Ringraziamo Cecile Montgiraud, Juliette Gimenez, Magali Jaillard e Bertrand Bonnaud per il loro contributo allo sviluppo iniziale e ottimizzazione del protocollo HERV-V2. Desideriamo inoltre ringraziare Hader Haidous per la sua guida su considerazioni etiche.

1. Chirurgia Una volta rimosso dal chirurgo, mantenere la prostata in ghiaccio fino presa in carico da un patologo. 2. Manipolazione dei tessuti della prostata <ol><li> Per rispettare il ritardo di ischemia perioperatoria, trasferire i campioni prostatectomia radicale sul ghiaccio al laboratorio da personale dedicato entro 30 minuti dopo l&#39;ablazione chirurgica. Il ritardo di congelamento deve essere inferiore a 20-30 min (Figura 3A). </li><li> Pesare e macchiare la prostata secondo l&#39;usuale protocollo (ad esempio verde sul lato destro, nero sul lato sinistro, si vedano le figure 3B e 3C). </li><li> Eseguire una grande sezione trasversale della ghiandola sul lato posteriore (Figura 3D). Orientare la prostata e metterlo sul lato anteriore. Eseguire una grande sezione trasversale della ghiandola sul lato posteriore con un bisturi sterile. </li><li> Sezionare pezzi di tessuto sulla zona di transizione,sulle zone periferiche sinistro e destro, lasciando intatti i margini (Figura 3E). </li><li> Mettete i nuclei di tessuto in un tubo Eppendorf, scatto congelare e conservare in azoto liquido (Figura 3F). Se non si stanno facendo biobanca procedere direttamente con passo 2.7. </li><li> Eseguire prostata banking solo se la lunghezza totale del cancro su biopsie è superiore a 10 mm. Utilizzare un filo di sutura per chiudere la prostata e per evitare distorsioni della ghiandola e un&#39;interruzione minima del margine chirurgico (Figura 3G). Quindi fissare il campione prostatectomia radicale con formalina e incorporare in paraffina secondo la procedura usuale per l&#39;analisi istologica. </li><li> Montare nuclei di tessuto congelato in verticale su un piccolo tumulo di ottobre e fare sezioni di un criostato. Prendete un primo singolo 5 micron sezione congelata e macchiare con blu di toluidina. </li><li> Eseguire un esame istologico pratica di analizzare la natura del tessuto (cioè. Benigno o maligno). Per tumoraletessuto, stimare la quantità di cellule tumorali e selezionare solo nuclei con più del 80% delle cellule tumorali. </li><li> A seguito di questo, eseguire un nuovo singolo 5 micron sezione congelata e macchiare con ematossilina, eosina e Safran. Poi, tagliate 15 sezioni x 30 micron e metterlo in una provetta Eppendorf libero RNAsi. </li><li> Un ultimo 5 micron sezione congelata per ematossilina, eosina e Safran Coloratela per controllare la quantità di cellule tumorali al termine della procedura. </li><li> Inserire il tubo Eppendorf in ghiaccio secco e inviare il campione al laboratorio di biologia molecolare. </li></ol> 3. RNA estrazione, purificazione e Controllo Qualità <ol><li> Omogeneizzazione. Eseguire omogeneizzazione in presenza di 1 ml di Trizol/100 mg tessuto finché il tessuto è completamente sciolto in soluzione. Aggiungere la soluzione Trizol gradualmente e procedere con cautela su ghiaccio utilizzando una smerigliatrice a mano. Una volta omogeneizzato, un&#39;aliquota la soluzione per provette Eppendorf e lasciare in Trizol a temperatura ambiente percinque minuti. </li><li> Separazione di fase. Aggiungere 300 microlitri cloroformio (o 150 microlitri BCP/1.5 ml Trizol). Vortex 15 sec poi lasciato a temperatura ambiente per 2-3 minuti. Centrifugare a 12.000 xg per 15 minuti a 2-8 ° C. </li><li> RNA precipitazioni. Trasferire accuratamente la fase acquosa superiore in una nuova provetta. Aggiungere 750 microlitri isopropanolo. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti (agitare per inversione). Incubare 2 ore a -19 ° C/-31 ° C. Centrifugare i campioni a 12.000 xg per 30 min a 2-8 ° C. </li><li> Lavaggio RNA e sospensione. Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante. Lavare RNA pellet con 1 ml di 80% EtOH (indietro delicatamente i tubi). Centrifugare i campioni a 7.500 xg per 10 min a 2-8 ° C. Rimuovere il surnatante utilizzando P1000 e P10. Lasciare restante EtOH asciugare all&#39;aria per 2-3 minuti. Aggiungere 100 acqua RNase-free microlitri, tubi di trasferimento a 70 blocco termico ° C e lasciate riposare per 2-3 minuti per sciogliere il pellet. Poi mettere sul ghiaccio. Conservare a -19 ° C/-31 stoccaggio ° C per breve termine e -80 ° C per una conservazione a lungo termine. </li><li> Purificazione dell&#39;RNA. Purificare RNA utilizzando il kit RNeasy Mini (Qiagen). In breve, inizia con l&#39;aggiunta di 350 microlitri di buffer RLT al campione di RNA 100 microlitri e mescolare bene, quindi seguire la procedura Qiagen. Infine, prendere a 3 ml (su 50 ml) un&#39;aliquota del prodotto purificato per i controlli di qualità (passo 3.6). Conservare RNA a -19 ° C/-31 ° C per un periodo breve termine oa -80 ° C per una conservazione a lungo termine. </li><li> RNA QC (Figura 4A). Controllare la qualità dell&#39;RNA e l&#39;integrità dell&#39;RNA utilizzando un Bioanalyzer (Agilent) e un Nanodrop (Thermo), secondo le istruzioni del produttore. L&#39;RNA Integrity Number (RIN) viene utilizzato per valutare la qualità dell&#39;RNA. In particolare, riuscire nella rilevazione di 18S e 28S picchi si consiglia vivamente di utilizzare i campioni in ulteriori passi. </li></ol> 4. WT-ovation RNA Amplification Raccomandazioni per eseguire le fasi di amplificazione utilizzando il WT-Ovzione kit di amplificazione in condizioni ottimali: <ul><li> Eseguire non meno di otto campioni di amplificazione alla volta per garantire la precisione di pipettaggio. Poi, tenere conto di 1 volume di rifiuti durante la preparazione master mix che richiedono una scissione del kit in 3 lotti di 8 reazioni. </li><li> Tenere sempre i reagenti scongelati e provette su ghiaccio, se non diversamente indicato. </li><li> Utilizzare solo una soluzione di etanolo al fresco 80% per la depurazione. </li><li> Non smettere in qualsiasi fase del protocollo. </li></ul><ol><li> Diluire RNA totale per ottenere una concentrazione di 25 ng / ml. Processo 2 microlitri del campione diluito. </li><li> Preparare il Poly-A RNA picco-in di controllo della soluzione da una diluizione seriale del Poly-A RNA Archivio con Poly-A controllo tampone di diluizione (Affymetrix), per ottenere una diluizione 1:25.000. Fase 1: First Strand cDNA Synthesis 4,3-4,8. I reagenti citati sono indicati dal fornitore come segue: A1 (First Strand Primer Mix), A2 (FiRST Strand Buffer Mix), A3 (First Strand Enzyme Mix). </li><li> Scongelare A1 e A2 a temperatura ambiente. Mescolare utilizzando un vortice-mixer per 2 secondi e centrifugare per 2 sec. Poi, mettere rapidamente sul ghiaccio. Mettere A3 sul ghiaccio. </li><li> Mettere 2 pl di RNA totale (50 ng) in una provetta da 0,2 ml PCR e aggiungere 2 ml di A1 (volume finale: 4 ml). Cap e girare la provetta per 2 sec. </li><li> Incubare a 65 ° C per 5 min quindi la provetta in ghiaccio. </li><li> Preparare la First Strand cDNA Master Mix come segue (data per una singola reazione). Mescolare pipettando e spin down brevemente Master Mix. Immediatamente, disporli sul ghiaccio. <table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Volume </th></tr><tr><td> First Strand Buffer Mix (A2) </td><td> 5 microlitri </td></tr><tr><td> Poly-A RNA Control (1:25.000) </td><td> 0,5 microlitri </td></tr><tr><td> First Strand Enzyme Mix (A3) </td><td> 0,5 microlitri </td></tr></tbody></table></li><li> Aggiungere 6 &amp; #181, l del Master Mix al / tubo Primer contenente RNA. Mescolare muovendo il tubo, centrifugare per 2 sec e mettere rapidamente sul ghiaccio (volume finale: 10 microlitri). </li><li> Incubare a 4 ° C per 1 minuto, poi 25 ° C per 10 min, quindi 42 ° C per 10 min e poi 70 ° C per 15 min. Conservare in luogo fresco a 4 ° C. Rimuovere il tubo di reazione da cicli termici, centrifugare brevemente e tenere in ghiaccio. Proseguire immediatamente con la seconda fase di Strand cDNA Synthesis. Fase 2: Second Strand cDNA Synthesis 4,8-4,12. I reagenti citati sono indicati dal fornitore come segue: B1 (Seconda Strand Buffer Mix) e B2 (Seconda Strand Enzyme Mix). </li><li> Spin giù B2 e B3 per 2 secondi e rapidamente disporli sul ghiaccio. Scongelare B1 a temperatura ambiente. Mescolare utilizzando un vortex mixer per 2 sec, centrifugare per 2 sec e rapidamente posto sul ghiaccio. </li><li> Preparare un secondo filone Master Mix come segue (data per una singola reazione). Mescolare pipettando e spin giù il brie Master Mixvolare. Immediatamente, disporli sul ghiaccio. <table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Volume </th></tr><tr><td> Secondo Strand Buffer Mix (B1) </td><td> 9.75 microlitri </td></tr><tr><td> Secondo Strand Enzyme Mix (B2) </td><td> 0,25 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Aggiungere 10 ml di Master Mix per ciascun tubo di reazione First Strand. Mescolare pipettando 3x, centrifugare per 2 sec e posto sul ghiaccio (volume finale: 20 microlitri). </li><li> Incubare a 4 ° C per 1 minuto, poi 25 ° C per 10 min, quindi 50 ° C per 30 min, quindi 70 ° C per 5 min. Conservare in luogo fresco a 4 ° C. Rimuovere il tubo di reazione da cicli termici, centrifugare brevemente e tenere in ghiaccio. Proseguire immediatamente con la fase post-Seconda Enhancement Strand. Fase 3: post-Seconda Strand Enhancement 4,13-4,15. I reagenti citati sono indicati dal fornitore come segue: B1 (Seconda Strand Buffer Mix), B3 (Reaction Enhancement Enzyme Mix). </p&gt; </li><li> Preparare una Master Mix combinando B1 e B3 Mix come segue (data per una singola reazione). Mescolare pipettando e spin down brevemente Master Mix. Immediatamente, disporli sul ghiaccio. <table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Volume </th></tr><tr><td> Secondo Strand Buffer Mix (B1) </td><td> 1,9 microlitri </td></tr><tr><td> Reazione Enhancement Enzyme Mix (B3) </td><td> 0.1 microlitri </td></tr></tbody></table></li><li> Aggiungere 2 ml di Master Mix per ciascun tubo di reazione Second Strand. Mescolare pipettando 3x, centrifugare per 2 sec e posto sul ghiaccio (volume finale: 22 microlitri). </li><li> Incubare a 4 ° C per 1 minuto, poi 37 ° C per 15 min, quindi 80 ° C per 20 min. Conservare in luogo fresco a 4 ° C. Rimuovere il tubo di reazione da cicli termici, centrifugare brevemente e disporli sul ghiaccio. Continuare subito con il passo SPIA amplificazione. Fase 4: Single strand cDNA (sscDNA) sintesi mediante procedura SPIA da 4.16 -4.19. I reagenti citati sono indicati dal fornitore come segue: C1 (SPIA Primer Mix), C2 (SPIA Buffer Mix), C3 (SPIA Enzyme Mix). </li><li> Scongelare la C1 e C2 a temperatura ambiente. Mescolare con un vortice-mixer, centrifugare per 2 sec e mettere rapidamente sul ghiaccio. Scongelare C3 su ghiaccio. Mescolare il contenuto capovolgendo delicatamente 5x. Assicurarsi di non introdurre bolle d&#39;aria. Poi, girare per 2 sec e posto sul ghiaccio. </li><li> Preparare un SPIA-Master Mix, che rappresentano un volume di 0,5 spreco, come segue. Mescolare pipettando e spin down brevemente Master Mix. Immediatamente, disporli sul ghiaccio. <table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Volume </th></tr><tr><td> SPIA-Buffer Mix (C2) </td><td> 5 microlitri </td></tr><tr><td> SPIA-Primer Mix (C1) </td><td> 5 microlitri </td></tr><tr><td> SPIA-Enzyme Mix (C3) </td><td> 10 microlitri </td></tr></tbody></table></li><li> Aggiungere 20 ml di SPIA Master Mix per Enhanced secondo filone di reazione tube. Mescolare pipettando 6-8x, effetti e mettere rapidamente sul ghiaccio (volume finale: 42 microlitri). </li><li> Incubare a 4 ° C per 1 minuto, poi 47 ° C per 60 min e poi 95 ° C per 5 min. Conservare in luogo fresco a 4 ° C. Togliere la provetta dal termociclatore, centrifugare brevemente e disporli sul ghiaccio. </li></ol> 5. sscDNA Depurazione e Controllo Qualità <ol><li> sscDNA purificazione. Purificare sscDNA utilizzando il kit di purificazione QIAquik PCR (Qiagen). Brevemente, iniziare aggiungendo 200 microlitri tampone PB a 42 ml di prodotto cDNA amplificato, mescolare e carico sulla colonna. Quindi seguire la procedura Qiagen. Infine, prendere a 3 ml (su 30 ml) un&#39;aliquota del prodotto purificato sscDNA per i controlli di qualità (passo 5.2). </li><li> sscDNA cedere e verifica distribuzione dimensionale (Figura 4B). Controllare sscDNA resa e distribuzione dimensionale usando un Bioanalyzer e un Nanodrop, secondo le istruzioni del produttore. La dimensione di distribuzione di cDNA amplificati dovrebbe be in genere compreso tra i 100 ei 1.500 basi lunghe con un picco di circa 600 basi. </li></ol> 6. sscDNA frammentazione <ol><li> Preparare 2 mg di cDNA in 30 microlitri, la regolazione del volume con acqua priva di nucleasi. </li><li> Preparare 1x One-Phor-All Buffer PLUS (OPA), partendo da un buffer 10x OPA PLUS soluzione. </li><li> Preparare 0,2 U / ml DNasi I (diluizione 5 volte di 1 U / ml DNasi I). </li><li> Preparare una frammentazione Master Mix come segue (proposta per una singola reazione): <table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Volume </th></tr><tr><td> 10X One-Phor-All Buffer PLUS </td><td> 3,6 microlitri </td></tr><tr><td> DNasi I (0,2 U / ml) </td><td> 3 microlitri </td></tr></tbody></table></li><li> Aggiungere 6.6 ml di frammentazione Mix ai 30 ml di sscDNA. </li><li> Spin e incubare a 37 ° C per 10 min, poi inattivare la DNasi I a 95 ° C per 10 min e tenere in ghiaccio. Aliquota 1 &amp;# 181; l di cDNA frammentato per la verifica della distribuzione di dimensioni basati Agilent. </li><li> sscDNA verifica distribuzione dimensionale (Figura 4C). Controllare distribuzione delle dimensioni sscDNA utilizzando un Bioanalyzer (Agilent). La granulometria delle cDNA frammentato deve essere tipicamente compresa tra 35 e 200 basi. </li></ol> 7. Etichettatura dei frammentati sscDNA <ol><li> Diluire il DLR-1a 7,5 mm a 5 mm di DEPC-acqua. </li><li> Preparare una etichettatura Master Mix come segue (data per una singola reazione): <table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Volume </th></tr><tr><td> 5x TdT Reaction Buffer </td><td> 14 microlitri </td></tr><tr><td> CoCl 2 (25 mm) </td><td> 14 microlitri </td></tr><tr><td> DLR-1a (5 mm) </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Transferasi terminale (400 U / ml) </td><td> 4.4 microlitri </td></tr></tbody></table></li><li> Aggiungere 33.4 ml di mix di etichettaturaper ciascun campione di cDNA frammentato. </li><li> Mescolare muovendo il tubo, girare brevemente e incubare a 37 ° C per 60 minuti, poi tenere su ghiaccio. </li></ol> 8. L&#39;ibridazione di microarray HERV Chip <ol><li> Prewet il GeneChip HERV con 200 ml di preibridazione Mix (Affymetrix) e incubare a 50 ° C, 60 rpm, per 10 min. </li><li> Preparare la miscela di ibridazione come segue (proposta per una singola reazione): <table border="1"><tbody><tr><th> Reagente </th><th> Volume </th></tr><tr><td> Controllo Oligo B2 (3nm) </td><td> 3.3 microlitri </td></tr><tr><td> 20x eucariotico ibridazione di controllo </td><td> 10 microlitri </td></tr><tr><td> 2x Ibridazione Mix </td><td> 100 microlitri </td></tr><tr><td> 99,9% DMSO </td><td> 17.7 ml </td></tr></tbody></table></li><li> Aggiungere 131 ml di miscela di ibridazione a 69 ml di frammentazione e cDNA marcato a temperatura ambiente per effettuare una vo finalelume di 200 microlitri. </li><li> Mescolare e denaturare per 2 min a 95 ° C, poi incubare a 50 ° C per 5 minuti e centrifugare a massima velocità per 5 min. </li><li> Svuotare il HERV GeneChip prewetted e caricare la preparazione di destinazione 200 ml. Applicare difficili macchie sui due setti. </li><li> Ibridare a 50 ° C, 60 rpm, per 18 hr. </li><li> Dopo 18 ore, svuotare il GeneChip HERV e conservare la soluzione di ibridazione raccolte a 4 ° C. Riempire la matrice sonda con 250 microlitri tampone di lavaggio A. Se il chip non vengono eseguiti immediatamente sul fluidica, conservati a 4 ° C. </li></ol> 9. Lavaggio e colorazione <ol><li> Eseguire i Fluidics dalla barra dei menu GCOS. Nella finestra di dialogo Fluidics, selezionare la stazione di interesse (1-4), quindi selezionare Shutdown_450 per tutti i moduli, quindi eseguire. Immergere le 3 linee di aspirazione Tecnica pneumatica in acqua Milli-Q. Seguire le istruzioni sullo schermo LCD. </li><li> Applicare il programma Prime_450 a tutti i moduli. Posizionare il tubo di tampone di lavaggio A inun flacone contenente 400 ml di tampone di lavaggio A, e quello per tampone di lavaggio B in un flacone contenente 200 ml di tampone di lavaggio B. Poi di nuovo, seguire le istruzioni visualizzate sul display. </li><li> Sollevare e posizionare gli aghi macchia 600 microlitri cocktail 1 (SAPE Solution Mix) e 600 microlitri macchia cocktail 2 (Soluzione Anticorpi Mix) contenente microprovette alle posizioni # 1 e # 2, e 800 microlitri di matrice possesso di soluzione tampone alla posizione # 3 . </li><li> Assegnare il chip diritto di ogni modulo, selezionare il protocollo FS450-004 ed eseguire ogni modulo, seguendo le istruzioni sullo schermo. </li></ol> 10. Scansione <ol><li> Scaldare il scanner GS3000. E &#39;pronto per la scansione quando la luce diventa verde. </li><li> Applicare dure-spot sul setti per evitare perdite quindi caricare il chip nel caricatore automatico o in alternativa direttamente nello scanner. Avviare la scansione. </li><li> Dopo la scansione del chip. File cel vengono generati. Controllare l&#39;immagine e allineare la griglia al posto per identificare le cellule sonda (&lt;strong&gt; Figure 4D-F). </li></ol> 11. Analisi dei dati <ol><li> Il controllo di qualità. Fare riferimento alla norma Affymetrix controlli per verificare che i chip HERV-V2 soddisfano i criteri di QC. A questo scopo possono essere utilizzate le seguenti rappresentazioni: la distribuzione valore di intensità log (trame densità e box plot), la deviazione assoluta mediana (MAD) rispetto alla media intensità (MAD-Med) trame, le trame di fondo, l&#39;errore standard normalizzato unscaled (Nuse) Trame e l&#39;espressione di registro relativa (RLE) Trame. </li><li> Normalizzazione. Inoltre, il set di dati dovrebbe essere esplorata per evidenziare gli effetti lotti inattesi e di correggerli prima analisi statistica. La pre-elaborazione dei dati comprende quindi una correzione del fondo (ad es. Sulla base del segnale di base sonda triptofano), seguita da RMA normalizzazione e riepilogo 15. </li><li> Data mining e ricerca di geni differenziali espressi. Normalizzare le patatine e applicare un clusteri gerarchicoapproccio ng per esplorare il dataset (Figura 6A). Quindi, eseguire una ricerca di geni espressi in modo differenziale (DEG) utilizzando il classico un&#39;analisi significativa dei microarray (SAM) Procedura di 16 seguito da un tasso di scoperta falso (FDR) Correzione 17. Si noti che questi passaggi siano pienamente integrati in alcune suite software di analisi come Partek GS, ma possono in alternativa essere eseguiti utilizzando il software statistico R 18 con i pacchetti del progetto Bioconductor 19. Dopo l&#39;analisi statistica, filtrare il set di dati per escludere le probesets per i quali i valori di espressione sono meno di 2 6. </li><li> Visualizzazione e interpretazione. Interpretare i risultati del microarray HERV-V2 in un&#39;interfaccia dedicata utilizzando database di annotazione. </li></ol>

Questo lavoro è stato sostenuto da bioMérieux SA, la Hospices Civils de Lyon e l&#39;agenzia pubblica francese OSEO (Diagnostica avanzata per nuovi approcci terapeutici, un programma finanziato dal governo francese dedicato alla medicina personalizzata). PP, VC, GO, NM, e FM sono dipendenti di bioMérieux SA. PP, NM e FM hanno presentato le domande di brevetto che coprono le conclusioni di questo lavoro.

Negli ultimi 10 anni, la maggior parte dei tentativi di misurazione espressione HERV hanno utilizzato tecniche di RT-PCR a concentrarsi su un locus specifico 20-24 oppure sulla base della relativa conservazione dei geni pol Per valutare le tendenze generali all&#39;interno HERV generi 25,26 . Inoltre, amplificazioni PCR con primer altamente degenerati accoppiato con microarray a bassa densità destinati a rilevare e quantificare l&#39;espressione di famiglie HERV 27,28. Al fine di rintracciare l&#39;espressione del locus individuo all&#39;interno di una famiglia, metodi basati sulla PCR di regioni conservate in combinazione con successiva clonazione e il sequenziamento abilitato elementi distinti trascrizionalmente attivi delle HML-2 29,30 o HERV-E4.1 31 famiglie a essere identificati. Finendo anche dalla clonazione e sequenziamento passi, la tecnica di monitoraggio espressione del genoma di ripetizione al fine di individuare i promotori tra ripetizioni identificati attivi HML-2 specifici LTR solitarie umani <sup&gt; 32,33. Abbiamo successivamente sviluppato due generazioni di microarrays ad alta densità dedicate all&#39;analisi del trascrittoma HERV, introducendo opportune metodologie per ripetuta progettazione sonda elemento al fine di minimizzare reazioni incrociate tra elementi paraloghe all&#39;interno di una famiglia 34,35. Il chip HERV-V2 che si rivolge 2690 provirus distinti e 2883 LTR solisti del HERV-W, HERV-H, HERV-E 4.1, HERV-FRD, HERV-K HML-2 e HERV-K HML-5 famiglie, ha presentato il espressione di 1.718 HERV loci (Figure 7A e B) in una vasta gamma di tessuti 35, illustrate in questo documento per l&#39;identificazione di putativi prostata biomarker tumorali. Inoltre, l&#39;utilizzo di più probesets su un dato locus è informato sulla sua regolazione trascrizionale. In primo luogo, un segnale negativo U3 in combinazione con un U5 positivo classifica il LTR come promotore, e segnali negativi viceversa U3 positivi e U5 può riflettere un ruolo poliadenilazione. Abbiamo così identified 326 LTR promotore in una vasta gamma di tessuti 35 e, basandosi su questa U3-U5 dicotomica informazioni fornite dalla matrice, abbiamo proposto e confermato sperimentalmente per alcuni casi selezionati che tale trascrizione autonoma era controllata da un processo dipendente metilazione epigenetica 34 (Figura 8). In secondo luogo, l&#39;individuazione di segnali provenienti ad esempio LTR, gag ed env probesets indipendenti o emessi da sonde destinate specifico svincolo Splice è informato sulla strategia di splicing provirale, come dimostra il profilo di espressione ERVWE1/Syncytin1 in placenta o nel testicolo tumorale 34. Questo indica che il processo di HERV selezione specifica sonda è abbastanza robusto per sostenere l&#39;individuazione di una strategia splicing tessuto-associata, nel modo più efficiente per geni convenzionali 36 (Figura 8). Questo metodo è il primo tentativo di identificare l&#39;espressione locus individualmente HERVutilizzando un microarray ad alta densità personalizzato basato sulla tecnologia Affymetrix. I vantaggi chiaramente identificati formato microarray di decifrare transcriptome HERV costituito da (i) l&#39;esplorazione coordinata di diversi famiglie HERV e (ii) l&#39;analisi simultanea e indipendente dalle regioni differenti per ciascun locus, ad es. Domini U3 e U5 per solista e LTR provirali, le regioni del bavaglio o env ed eventuali giunzioni di splicing associati alle strutture provirali, senza alcun a priori sulla funzionalità dell&#39;elemento HERV. Le prospettive si basano su un miglioramento delle annotazioni negli strumenti di bioinformatica microarray associati. Ciò dovrebbe permettere di convertire i segnali di chip in ipotesi biologiche, ad esempio se HERVs attivi rappresentati in auto lncRNA trascrizione o modulano più o meno prossimale codifica l&#39;espressione genica. Infatti, tale ipotesi è supportata da recenti studi che hanno identificato prostata cancro associato trascritti ncRNA contenenti componenti di vORF IRAL della famiglia HERV-K endogeno retrovirus o più parti di una regione del promotore LTR virale 37, così come due eventi gene di fusione ovvero HERV-K22q11-ETV1 e HERV-K17-ETV 38,39. Nel loro insieme, questo approccio intero trascrittoma combinata con la funzione LTR e splicing identificazioni strategia può aiutare a decifrare il marcatore contro gli elementi di innesco di espressione HERV a 40,41 croniche e le malattie infettive 42,43.

Retrovirus endogeni umani (chiamati anche HERVs) sono sparsi in tutto il nostro genoma. Essi provengono da infezioni ancestrali e indipendenti all&#39;interno della linea germinale, seguiti da processi di propagazione copia-incolla e conducono alle famiglie multicopia. Oggi, essi non sono più infettive ma occupano 8% del genoma umano, come punto di confronto, esoni abbracciano 2% del genoma umano. Dati del progetto ENCODE pubblicato nel 2012 ha dimostrato che diversi tipi di RNA coprono circa il 62% del genoma, compreso un terzo in regioni intergeniche. Inoltre, sembra che la quantità di motivi regolatori trascrizionali è almeno 4,5 volte superiore a quella corrispondente al esoni codificanti proteine. Ripetizioni HERVs lungo terminali (LTR) rappresentano una vasta gamma di potenziali elementi regolatori trascrizionali, come lo è la loro funzione abituale nei retrovirus infettivi. Storicamente, a parte alcuni loci espresso nella placenta o testicolo, si credeva che HERV tacciono a causa di epregolamento igenetic. Pertanto, abbiamo progettato un microarray ad alta densità, in formato Affymetrix, al fine di caratterizzare in modo ottimale espressione individuale HERV loci, al fine di comprendere meglio se sono attivi, se guidano lncRNA trascrizione o modulano l&#39;espressione genica codificante. Questo strumento soprannominato HERV-V2 GeneChip integra 23.583 probesets HERV e può discriminare 5.573 elementi HERV distinti composti da LTR solisti così come provirus complete e parziali (Figura 2). Diagnosi, Valutazione, e il Piano: La diagnosi di cancro alla prostata è basato sul dosaggio dell&#39;antigene prostatico specifico (PSA) biomarker in laboratorio clinico, un esame rettale digitale per valutare alterazione morfologica della prostata e infine biopsie prostatiche osservati dal patologo. La mancanza di specificità e sensibilità sufficiente tra biomarker tumorali convenzionali, come PSA per il cancro alla prostata, è stato ampiamente riconosciuto after decenni di implicazioni cliniche 1. Inizialmente, PSA è stato proposto per la diagnosi e il trattamento di adenocarcinoma della prostata 11. Era quest&#39;ultimo proposto per lo screening del cancro e monitorare lo sviluppo della malattia 12. Tuttavia, rimane una domanda che viene regolarmente chiesto: &#39;come usare PSA&#39;. (I) Una zona grigia che corrisponde ad una concentrazione nel siero di 2,5-10 ng / ml non consente una chiara differenza deve essere fatta tra il cancro e non oncologico 2; (ii) due studi di coorte grandi iscrivendosi centinaia di migliaia di persone in Europa e USA non è riuscito a giungere ad una chiara conclusione circa l&#39;utilità dello screening in termini di malattia mortalità specifica 13,14, (iii) analisi dei parametri cinetici di PSA post-operatorio come liquidazione PSA, PSA velocity e tempo di raddoppio, anche se semplice in teoria, può porre notevoli sfide in pratica 3,4 applicazione. Possiamo aspettarci che nei prossimi anni, biomarker appcazioni sosterranno una scelta clinica tra vigile attesa e più o trattamenti meno aggressivi a seconda del tumore fenotipo. Per quanto riguarda la diagnosi reso dal patologo, un primo fattore limitante proviene da una falsa diagnosi negativa del 20% entro biopsie prostatiche (molti tumori sono mancati per campionamento). Una seconda preoccupazione occupa della necessità di una procedura biopsia ulteriore seguente uno negativo, che possono presentare effetti avversi. La prostatectomia radicale è attualmente uno dei trattamenti standard per il cancro alla prostata. Si propone in pazienti sani, invecchiamento 45-65 anni, soprattutto nel caso di modelli aggressivi (Gleason 7 a 10), tumore multifocale o tumore palpabile. Ora è fatto nel nostro reparto con chirurgia robotica assistita. A causa della crescente evidenza che i marcatori molecolari avranno fondamentale importanza nei prossimi anni, abbiamo deciso di proporre a tutti i nostri pazienti la possibilità di partecipare a un programma per la prostatabanche di tessuti. Più precisamente, i programmi di ricerca in espansione molecolari sul cancro alla prostata hanno portato ad una richiesta crescente di accesso ai tessuti tumorali freschi di alta qualità da campioni prostatectomia. Questa ricerca, in particolare gli approcci genomici, richiesto grandi campioni di qualità elevata DNA / RNA. Tumorali e tessuti adiacenti &quot;non tumorali&quot; dello stesso paziente sono necessari. Raccomandazioni per la gestione e l&#39;elaborazione prostatectomies radicali sono progettati per preservare le caratteristiche patologiche che determinano palco e lo stato dei margini e così il potenziale ulteriore trattamento e la prognosi. Qualsiasi metodo di campionamento tessuto fresco, quindi, non dovrebbe compromettere successive valutazioni patologiche per essere accettabile per la diagnosi. Dissezione macroscopica della prostata è difficile e grande attenzione deve essere prestata ai tessuti di margine e capsulare invasione: qualsiasi dissezione per la prostata bancario dovrebbe essere sempre condotta da un esperto uropathologist in base a un accordod protocollo. Il comitato etico della facoltà di medicina e la scheda medica stato convenuto di queste indagini e il consenso informato è stato ottenuto per tutti i pazienti inclusi nel tessuto della prostata bancario.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="717">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Trizol</td>
			<td style="width:92px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:137px;">15596-026</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">RNA poly-A control stock</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900433</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">DNAse 1</td>
			<td style="width:92px;">Promega</td>
			<td style="width:137px;">M6101</td>
			<td style="width:295px;">1,000 U (1 U/&#181;l)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Terminal transferase</td>
			<td style="width:92px;">Roche</td>
			<td style="width:137px;">3333574001</td>
			<td style="width:295px;">400 U. Including enzyme and coenzyme (CoCl2).</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">DLR-1a</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900542</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:195px;">Hybridization internal controls B2 and 20x Eukaryotic Hybridization Control</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900454</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:195px;">GeneChip Hybridization, Wash and staining</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">900720</td>
			<td style="width:295px;">Including PreHybridization Mix and 2x Hybridization Mix for 30 reactions</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:195px;">10x One-Phor-All Buffer PLUS</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;">Composition in DEPC-treated water: 100 mM Tris-acetate pH 7.5; 100 mM magnesium acetate; 500 mM potassium acetate.</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">RNeasy Mini kit</td>
			<td style="width:92px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">74104</td>
			<td style="width:295px;">RNA cleanup protocol</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">WT-Ovation RNA amplification system</td>
			<td style="width:92px;">Nugen</td>
			<td style="width:137px;">2210-24</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">QIAquik PCR purification kit</td>
			<td style="width:92px;">Qiagen</td>
			<td style="width:137px;">28104</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">Material Name</td>
			<td style="width:92px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalogue Number</td>
			<td style="width:295px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">Nanodrop 1000</td>
			<td style="width:92px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:195px;">GeneChip Scanner 3000 7G</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">GS30007G</td>
			<td style="width:295px;">Optional: autoloader</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GeneChip Fluidics Station 450</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">FS450</td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:195px;">GeneChip Hybridization 640 Oven</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;">640</td>
			<td style="width:295px;">Includes 4 GeneChip Probe array carriers</td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:195px;">Workstation loaded with GeneChip Operating Software (GCOS) including the GeneChip Scanner 3000 High-Resolution Scanning Patch</td>
			<td style="width:92px;"></td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;"></td>
		</tr>
		<tr height="232">
			<td height="232" style="height:232px;width:195px;">HERV-V2 chip</td>
			<td style="width:92px;">Affymetrix</td>
			<td style="width:137px;"></td>
			<td style="width:295px;">Custom array. 
			For microarray availability (for research use only), please contact: 
			Fran&#231;ois Mallet 
			Laboratoire Commun de Recherche Hospices Civils de Lyon-bioM&#233;rieux 
			Medical Diagnostic Discovery Department 
			Centre Hospitalier Lyon Sud, B&#226;timent 3F 
			69495, Pierre B&#233;nite cedex France 
			Phone: 33 (0)4 72 67 87 85 
			Email: francois.mallet@biomerieux.com</td>
		</tr>
		<tr height="717">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>HERV-V2 conception 
			Dedicated database and annotations 
			 
			The construction of a dedicated database, grouping genomic HERV sequences belonging to 6 HERV families, has been achieved by the following procedure: (i) the most complete and representative sequence of each HERV family was selected from the literature and defined as a prototype sequence (Figure 2). (ii) The 6 prototypes were functionally annotated with reference to their LTR (U3/R/U5) and internal parts (gag/pol/env). (iii) RepeatMasker 44 was then applied using these functional sequences as input libraries. A genome-wide search of all related sequences was performed over the human genome on the basis of a minimum 80% homology (NCBI 36/hg18). (iv) Finally, the functional sequences retrieved by this process were assembled into distinct loci on the basis of their genomic location and eventually implemented in a dedicated HERV database. This database, called HERV-gDB3, contains 10,035 individual HERV loci35. 
			 
			Locus-specific probes design 
			Starting from HERV-gDB3, overlapping tracks of 25-mer candidate probes were firstly generated. Each candidate probe was then aligned against the human genome using KASH 45 in order to assess the cross-hybridization potentialities. This latter estimation was performed by a model developed specifically for this purpose and referred to as EDA+. Briefly, the principle of EDA+ is to take into account the instability brought by mismatches and gaps in a 25-mer target/probe hybridization complex. Candidate probes exhibiting low cross-hybridization risks (i.e. a low number of non-specific genomic targets) are selected and lastly assembled into probesets. 
			 
			Custom HERV GeneChip microarray 
			The custom HERV GeneChip integrates 23,583 HERV probesets and can discriminate 5,573 distinct HERV elements, composed of solo LTRs, complete and partial proviruses (Figure 2). The standard Affymetrix control probes for unbiased amplification and hybridization were also included in the microarray.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microarray-based identification of individual herv loci expression: application to biomarker discovery in prostate cancer

L&#39;antigene prostatico specifico (PSA) è il principale biomarker diagnostico per il cancro della prostata in uso clinico, ma manca di specificità e sensibilità, in particolare bassi valori di dosaggio 1. &#39;Come usare PSA&#39; rimane un problema di corrente, sia per la diagnosi come una zona grigia corrispondente ad una concentrazione nel siero di 2,5-10 ng / ml che non permette una chiara differenziazione da effettuare tra cancro e noncancer 2 o per follow paziente -come l&#39;analisi del PSA post-operatorio parametri cinetici possono porre notevoli sfide per la loro applicazione pratica 3,4. In alternativa, RNA non codificanti (ncRNAs) stanno emergendo come molecole chiave nel cancro umano, con la possibilità di servire come nuovi marcatori di malattia, ad esempio PCA3 nel carcinoma della prostata 5,6 e rivelare aspetti non caratterizzate della biologia tumorale. Inoltre, i dati del progetto ENCODE pubblicato nel 2012 ha mostrato che i diversi tipi di RNA coprono circa il 62% della generazioneome. Risulta inoltre che la quantità di motivi regolatori trascrizionali è almeno 4,5 volte superiore a quella corrispondente al esoni codificanti proteine. Così, ripetizioni terminali lunghe (LTR) di retrovirus endogeni umani (HERVs) costituiscono una vasta gamma di putative / candidati sequenze regolatrici trascrizionali, in quanto è la loro funzione primaria nei retrovirus infettivi. HERVs, che sono diffuse in tutto il genoma umano, provengono da infezioni ancestrali e indipendenti all&#39;interno della linea germinale, seguiti da processi di propagazione copia-incolla e portano a Multicopy famiglie che occupano l&#39;8% del genoma umano (notare che esoni coprono il 2% del nostro genoma ). Alcuni loci HERV esprimere ancora le proteine ​​che sono stati associati con diverse patologie tra cui il cancro 7-10. Abbiamo progettato un microarray ad alta densità, in formato Affymetrix, al fine di caratterizzare in modo ottimale espressione individuale HERV loci, al fine di comprendere meglio se possono essere attivi, se guidano ncRNA trascrizione o modulate codifica genica. Questo strumento è stato applicato nel campo del cancro della prostata (Figura 1).

Il valore di studi trascrittomiche risiede principalmente nella qualità del materiale biologico di partenza. Se l&#39;estrazione dell&#39;RNA avviene in condizioni ottimali, l&#39;RNA Integrity Number (RIN) è tipicamente 7 o superiore (Figura 4A). La necessità di ibridare 2 pg di cDNA sul chip Affymetrix HERV-V2 implica l&#39;uso di un processo di amplificazione. Un procedimento di amplificazione di successo porta ad una distribuzione a campana (Figura 4B). Poi, DNAse1 frammentazione viene eseguita al fine di omogeneizzare la distribuzione dimensionale cDNA circa 100 nucleotidi prima ibridazione (Figura 4C). Dopo l&#39;ibridazione e la scansione (Figura 4D), un controllo visivo dell&#39;immagine permette di controllare se la griglia è ben allineata ai punti (Figura 4E) e se i controlli di ibridazione sono coerenti (Figura 4F). Questa fase è utile per escludere microarray in cui bolle d&#39;aria o errori<html> verificato durante l&#39;esperimento. Una volta che i chip sono passati QC (Figura 5) e dopo la normalizzazione, l&#39;analisi statistica dei 5 match-pair tumorali e normali campioni di RNA prostata dall&#39;Ospedale Lyon-Sud portato all&#39;identificazione di 207 probesets HERV con i valori di espressione differenziale (p.val &lt;0,05) (Figura 6A). Per sostenere questi record e di acquisire informazioni prostata-specifico, 35 campioni match-pair aggiuntivi (colon, ovaio, testicolo, mammella, del polmone e della prostata) sono stati aggiunti l&#39;analisi e la procedura SAM-FDR (FDR = 20%) eventualmente individuato 44 della prostata specifiche probesets HERV. Tra questi, i più rilevanti 10 strutture HERV sono descritti (Figura 6B). Ulteriori studi clinici saranno necessari per valutare i valori di sensibilità e specificità di questi biomarcatori candidati. pload/50713/50713fig1.jpg &quot;width =&quot; 500px &quot;/&gt; . Figura 1 Schema del procedimento complessivo dalla clinica (1: prostatectomia dal clinico e la preparazione del tessuto dal patologo) al banco (2-6: preparazione del campione, preparazione bersaglio, elaborazione microarray) conduce alla identificazione di biomarcatori candidati (7: analisi bioinformatica dei microarrays HERV). Gli acidi nucleici derivate da tessuto normale sono rappresentati in arancione e acidi nucleici derivati ​​dalla zona tumorale sono costituiti da una miscela di normale (arancione) e specifica del tumore (nero) acidi nucleici. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig2.jpg" width="500px" /> . Figura 2 Concezione e il contenuto del chip HERV-V2: sequenze HERVrecuperato dal genoma umano sono memorizzati in un database chiamato HERV-gDB3, poi le sonde candidati 25-mer passano attraverso una procedura di modellazione ibridazione dedicato (EDA +) prima di essere poi sintetizzato sulla matrice (risultanti sottoregioni mirate sono rappresentati per ciascun famiglia). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig3.jpg" width="500px" /> Figura 3. Manipolazione prostata dal patologo. (A) freschi prostatectomia radicale campione viene trasferito al laboratorio. (BC) La prostata è macchiato (verde sul lato destro, nero sul lato sinistro). (D) sezione trasversale grande della ghiandola sul lato posteriore. (E) Lasciando i margini intatti, pieces di tessuti vengono sezionati da diverse aree della ghiandola prostatica. (F) Nucleo del tessuto sono collocati in una provetta Eppendorf. (G) filo di sutura viene utilizzato per chiudere la prostata e per evitare distorsioni della ghiandola e un&#39;interruzione minima del margine chirurgico. Poi, la prostatectomia radicale campione è pronto per la fissazione in formalina secondo la procedura usuale per l&#39;analisi istologica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig4.jpg" width="500px" /> Controlli Figura 4. Qualità della preparazione di acido nucleico e l&#39;efficienza di ibridazione. (A) L&#39;integrità dell&#39;RNA, (B) cDNA target e (C) obiettivi frammentate utilizzati nella fase di ibridazione amplificato. ThESE tre controlli di qualità sono stati ottenuti con il Bioanalyzer utilizzando RNA chip nano e il saggio Eucariota Nano Serie II. (D) l&#39;immagine complessiva del HERV-V2 zona ibridazione microarray dopo la scansione, (E) allargamento della fascia sinistra angolo mostrando griglia controlli di allineamento superiore e (F), allargamento della zona centrale che mostra avvistare i controlli di ibridazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig5.jpg" width="500px" /> Figura 5. Elaborazione di segnali. (A) Affymetrix polyA picco-in controlli di amplificazione. Il polyA controlla Dap, Thr, Phe e Lys trascrizioni da B. geni subtilis sono spillo nel campione di RNA e servono per valutare il successo complessivo<html> delle fasi di preparazione bersaglio. Intensità dovrebbe essere rilevata a valori decrescenti tra questi controlli spike-in per garantire che non vi era alcuna distorsione durante l&#39;amplificazione WT-Ovation tra altamente e geni basso espresso. (B) Affymetrix spike-in controlli di ibridazione. Tali obiettivi isolato da E. coli e P1 batteriofago sono a spillo prima della procedura di etichettatura. L&#39;aumento dei valori da BioB, Bioc, BioD e Cre indicano il successo globale del ibridazione. (C) distribuzione di intensità dei segnali di chip dopo RMA normalizzazione. La maggior parte dei probesets segnali presentano con valori inferiori a 2, 6 (sfondo), che indica l&#39;espressione complessiva riservata principalmente ad alcuni loci HERV specifico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig5highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . ftp_upload/50713/50713fig6.jpg &quot;width =&quot; 500px &quot;/&gt; Figura 6. Analisi dei dati. (A) Analisi di clustering gerarchico dei campioni normali e tumorali. Partizionamento raggruppamento è stato applicato ai valori di espressione normalizzati utilizzando un algoritmo di funzione di distanza euclidea, raggruppando probesets in alto (rosso) - e giù (blu)-regolazione tra campioni normali e tumorali. (B) La selezione dei migliori 10 strutture HERV identificati come candidato biomarker del cancro alla prostata. Per ogni elemento HERV, la relativa famiglia HERV, le coordinate genomiche (NCBI 36/hg18) e una breve descrizione della struttura HERV sono date. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig6highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig7.jpg" width="500px" /> Figura 7. </strong&gt; Il repertorio HERV. (A) Il sequenziamento del genoma umano ha rivelato 25.000 geni codificanti proteine ​​(esoni, 2%) e una quantità enorme di elementi trasponibili, tra cui 200.000 long-terminal repeat (LTR) retrotrasposoni (HERV, 8%). (B) estrapolazione da HERV-V2 contenuto del chip e dati di espressione associati (79 campioni provenienti da 8 normale rispetto a tipi di tessuti tumorali) indicano che un terzo del repertorio HERV è trascrizionalmente attivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig7highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 8" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50713/50713fig8.jpg" width="500px" /> Figura 8. Interpretazione funzionale dei segnali dal chip. (A) l&#39;identificazione Promotore e controllo epigenetico: segnale negativo U3 (sonda rossa, 5&#39;LTR) Rispetto al segnale positivo R-U5 (sonda blu, 5&#39;LTR) suggeriscono U3-driven trascrizione, sostenuto dalla differente metilazione CpG (cerchi neri pieni) contenuto di U3 in peritumorale normale rispetto a tessuti tumorali. (B) strategia di splicing: la presunta busta 3.1 kb mRNA codificante espresso esclusivamente nel tumore viene identificato utilizzando SD1/SA2 giunzione giunzione sovrapposti sonda. * Evince dal confronto con altri tessuti non-placentare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50713/50713fig8highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> .

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Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

Retrovirus endogeni umani (HERV), che occupano l&#39;8% del genoma umano, mantengono la capacità di codifica scarse, ma centinaia di migliaia di lunga ripetizioni terminali (litri). Un microarray Affymetrix personalizzato è stato progettato per identificare l&#39;espressione individuale HERV locus ed è stato utilizzato su tessuti di carcinoma della prostata come un proof of concept per i futuri studi clinici.

Microarray identificazione dei singoli HERV Loci Expression: Domanda di Biomarker Discovery in Cancro alla prostata

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

microarray-based-identification-individual-herv-loci-expression

Research

JoVE Journal

Medicine

16.4K Views.  Joint Unit Hospices de Lyon-bioMérieux.  Retrovirus endogeni umani (HERV), che occupano l'8% del genoma umano, mantengono la capacità di codifica scarse, ma centinaia di migliaia di lunga ripetizioni terminali (litri). Un microarray Affymetrix personalizzato è stato progettato per identificare l'espressione individuale HERV locus ed è stato utilizzato su tessuti di carcinoma della prostata come un proof of concept per i futuri studi clinici. 

Video: Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

Valutazione della captazione nanoparticelle nei tumori in tempo reale utilizzando intravitale Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

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Medicina

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment resistance is thought to be the molecular complexity of the disease 1. Targeted therapy such as the tyrosine kinase inhibitor (TKI)-sunitinib have been utilized, but only 40% of patients will respond, with the overwhelming majority of these patients relapsing within 1 year 2. As such the question of intrinsic and acquired resistance in renal cell cancer patients is highly relevant 3.
In order to study resistance to TKIs, with the ultimate goal of developing effective, personalized treatments, sequential tissue after a specific period of targeted therapy is required, an approach which had proved successful in chronic myeloid leukaemia 4. However the application of such a strategy in renal cell carcinoma is complicated by the high level of both inter- and intratumoral heterogeneity, which is a feature of renal cell carcinoma5,6 as well as other solid tumors 7. Intertumoral heterogeneity due to transcriptomic and genetic differences is well established even in patients with similar presentation, stage and grade of tumor. In addition it is clear that there is great morphological (intratumoral) heterogeneity in RCC, which is likely to represent even greater molecular heterogeneity. Detailed mapping and categorization of RCC tumors by combined morphological analysis and Fuhrman grading allows the selection of representative areas for proteomic analysis.
Protein based analysis of RCC8 is attractive due to its widespread availability in pathology laboratories; however, its application can be problematic due to the limited availability of specific antibodies 9. Due to the dot blot nature of the Reverse Phase Protein Arrays (RPPA), antibody specificity must be pre-validated; as such strict quality control of antibodies used is of paramount importance. Despite this limitation the dot blot format does allow assay miniaturization, allowing for the printing of hundreds of samples onto a single nitrocellulose slide. Printed slides can then be analyzed in a similar fashion to Western analysis with the use of target specific primary antibodies and fluorescently labelled secondary antibodies, allowing for multiplexing. Differential protein expression across all the samples on a slide can then be analyzed simultaneously by comparing the relative level of fluorescence in a more cost-effective and high-throughput manner.

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

RPPA enables the protein expression of hundreds of samples, printed on nitrocellulose slides to be interrogated simultaneously, using fluorescently labelled antibodies. This technique has been applied to study the effect of drug treatment heterogeneity within clear cell renal carcinoma.

L&#39;uso di matrici inverse proteina di fase (RPPA) per esplorare Espressione Variazione proteine ​​all&#39;interno dei singoli tumori a cellule renali

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

Un romanzo ad alta risoluzione<em&gt; In vivo</em&gt; Tecnica di imaging per studiare la risposta dinamica di strutture intracraniche alla crescita del tumore e Terapeutica

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Un ortotopico Modello murino di Human Prostate Cancer Metastasi

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly isolated from human tissues and serially propagated in immunodeficient mice, typically through antibody labeling of subpopulations of cells and fractionation by flow cytometry. However, the unique clinical features of prostate cancer have considerably limited the study of prostate CSCs from fresh human tumor samples. We recently reported the isolation of prostate CSCs directly from human tissues by virtue of their HLA class I (HLAI)-negative phenotype. Prostate cancer cells are harvested from surgical specimens and mechanically dissociated. A cell suspension is generated and labeled with fluorescently conjugated HLAI and stromal antibodies. Subpopulations of HLAI-negative cells are finally isolated using a flow cytometer. The principal limitation of this protocol is the frequently microscopic and multifocal nature of primary cancer in prostatectomy specimens. Nonetheless, isolated live prostate CSCs are suitable for molecular characterization and functional validation by transplantation in immunodeficient mice.

The isolation of cancer stem cells (CSCs) directly from human tissues is requisite for their biological characterization. This manuscript describes a methodology for the isolation of prostate CSCs from human tissues, while also providing tips on troubleshooting difficult steps.

Isolamento di cancro cellule staminali da campioni umani di cancro alla prostata

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, diagnosis, prognosis and treatment. In recent years, microRNAs (miRNAs) have emerged as promising alternate biomarkers for prostate cancer diagnosis and prognosis. However, the development of miRNAs as effective biomarkers for prostate cancer heavily relies on their accurate detection in clinical tissues. miRNA analyses in prostate cancer clinical specimens is often challenging owing to tumor heterogeneity, sampling errors, stromal contamination etc. The goal of this article is to describe a simplified workflow for miRNA analyses in archived FFPE or fresh frozen prostate cancer clinical specimens using a combination of quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH). Within this workflow, we optimize the existing methodologies for miRNA extraction from FFPE and frozen prostate tissues and expression analyses by Taqman-probe based miRNA RT-PCR. In addition, we describe an optimized method for ISH analyses formiRNA detection in prostate tissues using locked nucleic acid (LNA)- based probes. Our optimized miRNA ISH protocol can be applied to prostate cancer tissue slides or prostate cancer tissue microarrays (TMA).

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

Analisi miRNA nel tumore alla prostata tessuti cliniche

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

Generation of Prostate Cancer Patient Derived Xenograft Models from Circulating Tumor Cells

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, biologic studies, and personalized medicine strategies. Circulating tumor cells (CTC) play a critical role in tumor metastasis and have been isolated from patients with several tumor types. Recently, CTCs have been used to generate PDX experimental models of breast and prostate cancer. This manuscript details the method for the generation of prostate cancer PDX models from CTCs developed by our group. Advantages of this method over conventional PDX models include independence from surgical sample collection and generating experimental models at various disease stages. Density gradient centrifugation followed by red blood cell lysis and flow cytometry depletion of CD45 positive mononuclear cells is used to enrich CTCs from peripheral blood samples collected from patients with metastatic disease. The CTCs are then injected into immunocompromised mice; subsequently generated xenografts can be used for functional studies or harvested for molecular characterization. The primary limitation of this method is the negative selection method used for CTC enrichment. Despite this limitation, the generation of PDX models from CTCs provides a novel experimental model to be applied to prostate cancer research.

This manuscript details a method used to generate prostate cancer patient derived xenografts (PDXs) from circulating tumor cells (CTCs). The generation of PDX models from CTCs provides an alternative experimental model to study prostate cancer; the most commonly diagnosed tumor and a frequent cause of death from cancer in men.

Generazione di cancro alla prostata del paziente Derivato modelli di xenotrapianto di cellule tumorali circolanti

Patient derived xenograft (PDX) models are gaining popularity in cancer research and are used for preclinical drug evaluation, biomarker identification, ...

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA (Locked Nucleic Acid) probe. The probe was recognized by anti-DIG alkaline phosphatase antibodies and later developed using alkaline phosphatase substrate producing fluorescence signals. Here we utilized miRNA in situ hybridization (MISH) technique to analyze expression of miR-489 in tissues from breast cancer patients. This technique can detect the localization of miRNA of interest in individual tissue samples. This technique can be used to compare the expression of desired miRNA in tumor tissue with that in adjacent normal tissue and to identify the specific structures responsible for expressing this miRNA. This technique can be very useful in answering certain clinical questions, such as role of specific miRNA in the development of cancer. Our results indicate that mammary epithelial cells express significantly higher levels of miR-489 than adjacent tumor cells.

Clinicopathological Analysis of miRNA Expression in Breast Cancer Tissues by Using miRNA In Situ Hybridization

Here we present a protocol to detect miRNA expression in breast cancer patient samples using miRNA in situ hybridization.

Analisi clinicopatologica di miRNA espressione in Breast Cancer tessuti mediante l&#39;utilizzo di miRNA<em&gt; In Situ</em&gt; ibridazione

In this article, we describe a detailed protocol for miRNA detection in breast cancer tissue using in situ hybridization with a digoxigenin-labelled LNA ...

Pre-clinical Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information about this disease. The human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model provides a useful alternative approach for understanding the specific interactions between genetically and molecularly altered tumor cells, their organ microenvironment, and for evaluation of efficacy of therapeutic regimens. This is a well characterized model designed to study the molecular events of primary tumor development and it recapitulates the early events in the metastatic cascade prior to embolism and entry of tumor cells into the circulation. Thus it allows elucidation of molecular mechanisms underlying the initial phase of metastatic disease. In addition, this model can annotate drug targets of clinical relevance and is a valuable tool to study prostate cancer progression. In this manuscript we describe a detailed procedure to establish a human orthotopic prostate cancer xenograft mouse model.

Prostate cancer is the second most common cause of cancer-related deaths in the United States. An orthotopic cancer model provides a useful approach to understand the biology of prostate cancer and to evaluate the efficacy of therapeutic regimens. This protocol describes detailed steps necessary to establish an orthotopic prostate cancer mouse model.

Pre-clinica ortotopico Modello murino di Human cancro alla prostata

To study the multifaceted biology of prostate cancer, pre-clinical in vivo models offer a range of options to uncover critical biological information ...

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose (MED) Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary to produce erythema (inflammatory reddening) on the surface of the skin. In this context, the MED is regarded as a key factor in determining starting doses for UV phototherapy for common skin conditions such as psoriasis and eczema. In research settings, MED testing also has potential to be a powerful tool for assessing within- and between-persons variation in inflammatory responses. However, MED testing has not been widely adopted for use in research settings, likely owing to a lack of published guidelines, which is a barrier to obtaining reproducible results from this assay. Also, protocols and equipment for establishing MED vary widely, making it difficult to compare results across laboratories. Here, we describe a precise and reproducible method to induce and measure superficial erythema using newly designed protocols and methods that can easily be adapted to other equipment and laboratory environments. The method described here includes detail on procedures that will allow extrapolation of a standardized dosage schedule to other equipment so that this protocol can be adapted to any UV radiation source.

Precision Implementation of Minimal Erythema Dose MED Testing to Assess Individual Variation in Human Inflammatory Response

Minimal erythema dose (MED) testing is used to establish dosage schedules for ultraviolet radiation phototherapy. It can assess individual variation in inflammatory response but lacks methodology for achieving reproducible results. Here, we present a precision implementation of MED and demonstrate its ability to capture individual variation in inflammatory response.

Implementazione di precisione dei test di dose minima di erithema (MED) per valutare la variazione individuale nella risposta infiammatoria umana

Minimal erythema dose (MED) testing is frequently used in clinical settings for determining the smallest amount of ultraviolet (UV) irradiation necessary ...