Gli autori ringraziano il Dr. James Bamberga ei membri del suo laboratorio per la collaborazione in questi studi. Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni NIH HD19950, EY07133 e da finanziamenti della Minnesota Medical Foundation.

Per rodamina-actina l&#39;etichettatura, i neuroni sono coltivati ​​su coprioggetto di vetro posto nella parte inferiore di 35 piatti di plastica mm, o su vetrini incollati in &quot;video&quot; piatti. 1. Preparazione del coprioggetto o &quot;Video&quot; Piatti <ol><li> Molti tipi di neuroni sono scarsamente adesivo per substrati in vitro. Coprioggetto di vetro, che sono necessari per questa procedura, potrebbe non consentire sufficiente neurone-substrato di adesione a meno che non siano adeguatamente puliti e preparati. Una procedura dettagliata per l&#39;acido di lavaggio e pulizia coprioggetto di vetro è descritto nel libro coltura cellule nervose, a cura di banchiere e Goslin. In alternativa, un rivestimento di nitrocellulosa per coprioggetto, che si lega avidamente molecole di substrato, è descritto nei passi 1.7 e 1.8 di seguito. </li><li> Vetro coprioggetti (es. 18 o 24 millimetri quadrati cerchi mm) sono risciacquati in dH 2 O e cotto a calore secco (≥ 225 ° C) più a lungo possibile (almeno alcuni giorni fino a tre mesi o più) per rimuovere le tracce di sostanze organiche composti. Passare al punto 1.6 o per i piatti il ​​video procede a 1,3. </li><li> Per creare un sottile substrato di vetro trasparente per videomicroscopia ad alta risoluzione, fori circolari di diametro appropriato sono perforati nel fondo di 35 o 50 millimetri Petri in plastica o piatti di coltura di tessuti utilizzando una sonda elettrica sughero (o uno strumento analogo). Foratura avviene lentamente con una leggera pressione per evitare di rompere la plastica. Bordi del foro sono raschiati con le forbici per creare una superficie liscia su entrambi i lati. </li><li> Coprioggetto di vetro sono puliti per l&#39;utilizzo di coltura, come descritto in 1.1 o 1.2. Coprioggetto sono incollati al posto sopra i fori, usando non tossico cemento acquario silicone (per coprioggetto 18x18mm, un po &#39;diametro 12mm è utilizzato). Il cemento è curata per 24 ore. </li><li> (I seguenti passaggi sono fatto utilizzando condizioni sterili) I piatti video sono risciacquati 3 volte con sterili dH 2 O e lasciati asciugare all&#39;aria. </li><li> Coprioggetto sono rivestite di molecole substrato neuronale per la cultura. In primo luogo, la superficie è rivestita con coprioggetto (250 microlitri per coprioggetto 18x18) una soluzione di 100 mg / ml poli-D-lisina in PBS per 4-8 ore (o una notte) in un umidificata 38 ° C. Coprioggetto vengono poi risciacquati 3 volte con sterili dH 2 O per rimuovere legato poli-D-lisina e lasciato asciugare all&#39;aria. Molti tipi di neuroni sono coltivate su vetrini rivestiti di poli-D-lisina da solo, se le proteine ​​del siero sono compresi nel mezzo di coltura. Tuttavia, i risultati più rilevanti per le condizioni in vivo sono ottenuti utilizzando molecole di substrato naturale. Le soluzioni di queste molecole, come laminina, fibronectina o L1 CAM (1-20 mg / ml in PBS), può essere direttamente applicato vetrini rivestiti di poli-D-lisina per 4-8 ore o durante la notte, ma nel nostro laboratorio di routine mano i coprioggetti preparata con un sottile strato di nitrocellulosa prima di applicare molecole di adesione cellulare per aumentare la proteina-substrato vincolanti. </li><li> Fare una soluzione di nitrocellulosa 1% in nitrocellulosa sciogliendo 5 g in 5 ml di 100% acetato di amile. Applicare 10 ml di questa soluzione per il coprioggetto e delicatamente tutta la superficie. Aria secca 10 minuti. </li><li> Applicare 250 microlitri di una soluzione di 25 mg / ml laminina o 4 mg / mL L1 CAM in PBS e in tutta la superficie nitrocellulosa. Incubare 4 ore (o durante la notte) in un umidificata 38 ° C, substrato aspirare e aggiungere immediatamente terreno di coltura, in modo che il substrato non si secchi. </li></ol> 2. Preparazione delle Culture neuronale <ol><li> Embrionali giorno 7 embrioni di pollo vengono rimossi da uova, e collocati in 100 piatti millimetri Petri contenenti terreno di coltura con 10% siero per la dissezione, per rimuovere gli organi interni dal torace e l&#39;addome, utilizzando uno stereomicroscopio. </li><li> Gli embrioni vengono poi risciacquati con medio e trasferito in un piatto di 60 mm con ambiente liquido e ulteriormente sezionato per rimuovere e preparare espianti di gangli delle radici dorsali (DRG) o tessuti neurali della retina. Una descrizione dettagliata dissezione può essere trovato in Metodi di Biologia Cellulare, volume 71, Neuroni: Metodi e Applicazioni per il biologo cellulare, a cura di Hollenbeck e Bamberga. Espianti DRG sono gangli 1/2-whole e neurali espianti retinici sono 1 mm o meno di diametro. </li><li> Dopo aver pulito la espianti di tessuti estranei, gli espianti individuali sono mosso con pinze orologiai per i coprioggetti, che sono già in capsule di Petri con il terreno di coltura. Sotto un microscopio da dissezione, l&#39;espianto viene delicatamente premuto al centro del vetrino con una pinza per evitare movimenti durante il trasporto al incubatrice. Espianti sono coltivate in media con F12 B27 additivi, tamponata con 10 mM HEPES a pH 7.4 e messo la notte in un umidificata 38 ° C. I fattori di crescita possono essere aggiunti, se necessario, al mezzo di coltura. Neurotrofine sono spesso aggiunti ai DRG culture di anziani embrioni, anche se E7 neuroni DRG si estenderà assoni da espianti senza neurotrofine aggiunto. Espianti di retina neurale estendere assoni in questo terreno di coltura senzadding fattori di crescita. </li><li> Le culture sono incubate per almeno 18 ore per consentire sufficiente crescita degli assoni, prima di iniziare la procedura di seguito. </li></ol> 3. Preparazione di Rodamina-actina Buffer permeabilizzazione <ol><li> Una soluzione tampone stock di permeabilizzazione contenente 138 mM KCl, 10 TUBI mm, 3 mm EGTA, 4mm MgCl 2 e 1% BSA (pH = 6,9) può essere mantenuta fino a 2 settimane a 4 ° C11. Appena prima dell&#39;uso, i seguenti componenti sono aggiunti per una concentrazione finale di: 0,025% saponina, 0,1 mM ATP, e 100 nM-Alexa Fluor 350 falloidina. </li><li> Una soluzione a parte è anche preparata al momento dell&#39;uso con questi stessi componenti più 0.45μM rodamina non muscolo actina La soluzione è alternativamente agitazione orizzontale e tritrated per 5 minuti per sciogliere rodamina-actina grumi, ed è in agitazione per 1 minuto durante la fase iniziale di permeabilizzazione per prevenire la polimerizzazione nel tubo. Se, nonostante questo, il montaggio filamento nel tubo rimane un problema, la soluzione può essere centrifugati prima dell&#39;uso. </li></ol> 4. Permeabilizzazione delle Culture e Integrazione della neuronale Rodamina-actina su F-actina Ends spinato <ol><li> Un piatto cultura con espianti DRG o della retina viene accuratamente rimossa dal termostato e le seguenti operazioni vengono eseguite a temperatura ambiente. </li><li> Tutte le modifiche delle soluzioni deve essere fatto attentamente. La punta della pipetta deve essere posizionato sul bordo del vetrino e le soluzioni devono essere rimosso e aggiunto lentamente e con una forza minima. </li><li> Il terreno di coltura viene rimosso dalla pipetta con attenzione, ma costantemente, e con un tampone permeabilizzazione sufficiente a coprire le cellule si aggiunge per 1 min (per 18 millimetri x 18mm coprioggetto, ~ 60 mL). La cultura non è risciacquata con altre soluzioni prima di aggiungere il buffer permeabilizzazione, e il coprioggetto non si lascia asciugare prima di aggiungere il buffer di permeabilizzazione. </li><li> Il buffer di permeabilizzazione viene delicatamente rimosso dalla pipetta e sostituito con il buffer permeabilizzazione contenente 0,45 rodamina mM non actina muscolare per 4 min. </li><li> La rodamina-actina-contenente tampone viene delicatamente rimosso tramite una pipetta, ei neuroni sono fissati con l&#39;aggiunta di una soluzione di paraformaldeide al 4% (da laboratorio, fatta con tampone fosfato, pH 7,3), 0,05% glutaraldeide e il 10% di saccarosio. Dopo 5 minuti la fissazione coprioggetto sono delicatamente sciacquati con PBS, e montato in Slowfade il 3 pollici vetrini. </li><li> Un approccio alternativo alle soluzioni cambiamento è quello di utilizzare una cella di flusso. Questa può essere una cella a flusso disponibile in commercio, o di una cella di flusso semplice può essere fatto mettendo piccoli pezzi di plastica (≤ 1 mm di spessore) come distanziatori agli angoli del vetrino, e poi si monta una uguale dimensione coprioggetto sulla parte superiore del coprioggetto. Le soluzioni possono essere scambiati mettendo la pipetta ad un lato della cella di flusso e della revoca soluzioni con uno stoppino (cotone o un Kimwipe) dall&#39;altra parte. </li><li> L&#39;incorporazione di rodamina-actina su F-actina finisce spinato e fluorescenti-falloidina etichettatura di F-actina in coni di crescita è visualizzato con epi-fluorescenza ottica con un obiettivo 60X immersione in olio, e le immagini sono raccolte, con una camera CCD raffreddata. Un microscopio confocale può fornire immagini migliori. </li><li> Per una migliore quantificazione della rodamina-actina incorporazione di tutte le immagini devono essere raccolti in una sola sessione, utilizzando lo stesso guadagno e le impostazioni di esposizione la sensibilità della fotocamera digitale per ogni immagine. Analisi di etichettatura dovrebbe essere fatto dalle regioni equivalente per ogni immagine Metamorph, Immagine J o simili strumenti informatici per l&#39;analisi delle immagini può essere utilizzato. </li></ol> VARIAZIONI DI QUESTA PROCEDURA 5. Una variante: Raccogliere Immagini Live Cell Prima Rodamina-actina Etichettatura <ol><li> Video piatti sono posti su un palco microscopio riscaldato, e vivere le immagini cono di crescita sono stati raccolti. Coprioggetto griglia può essere utilizzato, o incisioni e / o segni penna sul vetrino può essere fatto per trovare più facilmente le cellule specifico dopo l&#39;etichettatura, o il piatto video può essere fissato in posto sul palco microscopio per tutta la durata della procedura. </li><li> Permeabilizzazione, incorporazione di rodamina-actina, e la fissazione delle cellule sono condotte nel piatto video, sia su o giù dal palco microscopio. Dopo il fissaggio, PBS si aggiunge ai piatti il ​​video per l&#39;imaging immediata. Per preservare il campione per l&#39;imaging in seguito, media slowfade montaggio viene aggiunto al coprioggetto e un coprioggetto di uguali dimensioni si posa delicatamente sulla parte superiore (evitando bolle), e poi i bordi sono sigillati con smalto trasparente. </li></ol> 6. Variante due: immunochimica di Co-label proteine ​​aggiuntive <ol><li> Rodamina-actina incorporazione e fissazione può essere condotto sui neuroni coltivati ​​su vetrini o in piatti di video, come descritto in precedenza (4,2-4,4). </li><li> Dopo la fissazione, e risciacquo in PBS, le cellule vengono trattate 15 minuti con 0,1 M glicina in PBS e poi estratto con 0,1% Triton X-100 (TX-100) in PBS con siero di capra al 2% e 1% di BSA per 1 h. Coprioggettovengono incubati con gli anticorpi primari diluiti in PBS contenente BSA 1% per 1 h. I coprioggetti vengono poi risciacquati e incubate a 0,1% TX-100 in PBS con siero di capra al 2% e 1% di BSA per 1 ora, prima di applicare gli anticorpi secondari fluorescenti a diluizione 1:1000 in PBS con BSA 1% per 1 h. Dopo il risciacquo, i coprioggetti sono di nuovo incubati in 0,1% TX-100 in PBS con siero di capra al 2% e 1% di BSA per 30 minuti, risciacquato, e montato in anti-sbiadimento media. La localizzazione di alcune proteine ​​viene interrotto dal passo permeabilizzazione iniziale (4,3). Per mantenere queste proteine ​​per la localizzazione con gli anticorpi, 0,05% e 0,05% paraformaldeide glutaraldeide può essere aggiunta al buffer permeabilizzazione per 1 minuto (cioè prima di aggiungere il rodamina-actina) senza alterare l&#39;etichettatura spinato fine di rodamina-actina. </li><li> Immagini di coni di crescita triplo etichettati sono raccolti al microscopio a fluorescenza o confocale. </li></ol> 7. Variazione Tre: valutazione degli effetti di Cues Guida alla F-actina estremità libere spinato <ol><li> Un fattore di crescita o spunto guida si aggiunge ai piatti della cultura in incubatrice a concentrazioni di alcuni ng / mL per qualche minuto (o un tempo di trattamento appropriato) prima di rimuovere l&#39;antenna dal termostato e iniziare la procedura di permeabilizzazione. Ciò consente di valutare a breve termine gli effetti di fattori di crescita o di indicazioni di guida su F-actina estremità libere spinato. </li><li> Un piatto video con culture neuronali può essere posizionato su un palco microscopio riscaldato, e fattori di crescita o indicazioni di guida può essere rilasciata da una micropipetta in un gradiente in prossimità di un cono di crescita prima di iniziare la permeabilizzazione e rodamina-actina incorporazione. Per esempio, NGF può essere rilasciato per DRG neuroni o netrina per neurali cellule gangliari della retina. La pipetta può essere introdotta per la più breve 1-2 minuti prima di iniziare la procedura di permeabilizzazione. Ciò permette la valutazione degli effetti locali di un gradiente di guida spunto sulla formazione di F-actina estremità libere spinato dei margini di cono di crescita importanti (vedi citazione di riferimento 10 per le immagini). </li><li> Queste variazioni possono essere combinati con anticorpo-mediata etichettatura di altri componenti neuronali, come descritto al precedente punto 6.2. </li></ol> 8. Quattro variazione: F-actina Etichettatura gratis Fine spinato sui neuroni transfettati <ol><li> L&#39;uso di costrutti costitutivamente attivo o dominante negativo o knockdown proteine ​​mediante RNAi (con un marcatore fluorescente identificazione) può essere utilizzato per valutare il coinvolgimento di una proteina nella regolazione della F-actina estremità libere spinato. A seconda delle proteine, la sua localizzazione all&#39;interno del cono di crescita, e se è fusa ad un tag fluorescente, la proteina fluorescente espressi nelle cellule transfettate possono essere persi su permeabilizzazione. Se questo è il caso, i piatti video può essere utilizzato per identificare una cellula transfettate microscopio prima di permeabilizzazione e la permeabilizzazione può essere effettuata sul palco microscopio, dopo aver segnato le posizioni di cellule transfettate. In alternativa, un costrutto GFP-actina può essere co-trasfettate con GFP-costruire di interesse. In questo caso, GFP-actina saranno inseriti in F-actina, e non sarà perso da permeabilizzazione che consenta l&#39;identificazione delle cellule transfettate dopo permeabilizzazione. </li><li> Questa variazione può essere combinato con l&#39;aggiunta di indicazioni di guida, come descritto nella 7,1-7,3 sopra. </li></ol> 9. Rappresentante Risultati <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Inoltre globale di NGF aumenta totale F-actina e F-actina termina spinato al margine cono di crescita importanti. Quando un cono di crescita DRG viene stimolato con fattore di crescita nervosa (NGF) per 5 minuti, la polimerizzazione di actina è stimolato al margine leader, e una fascia luminosa della rodamina-actina etichettatura è visto intorno alla periferia cono di crescita. La figura 1 confronta rodamina-actina incorporazione in un cono DRG non stimolato la crescita e l&#39;NGF-stimolata cono di crescita DRG. La fluorescenza verde nelle immagini fuse è etichettatura falloidina di F-actina nel cono di crescita e il rosso è rodamina-actina etichettatura. Un buon controllo per l&#39;etichettatura fine spinato è quello di aggiungere 10-6 M o superiore citocalasina B o D nel buffer di permeabilizzazione in passi 4.2 e 4.3. Cytochalasins tappo F-actina finisce spinato e inibire rodamina-actina vincolante a fini spinato. Questo dovrebbe ridurre drasticamente o eliminare l&#39;incorporazione di rodamina-actina nella cella. Barre di scala, 10 micron. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Un gradiente di NGF aumenta a livello locale di F-actina finisce spinato. Una micropipetta che rilascia NGF è portato a un lato di un cono di crescita DRG per 2 minuti, seguito da etichettatura di F-actina estremità libere spinato. Le immagini qui sotto mostrano che l&#39;esposizione a un gradiente di NGF stimola a livello locale un aumento di F-actina estremità libere spinato nella regione del cono di crescita più vicini alla pipetta. L&#39;immagine mostra falloidina fuse in verdee rodamina-actina in rosso. Scala grafica, 10 micron. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Proteine ​​ERM attivato accumulano al margine cono di crescita importanti. Etichettatura immunocitochimica di phospho-Ezrin/Radixin/Moesin (Perm) con F-actina estremità libere spinato. Gluteraldehyde (0,05%) e paraformaldeide (0,05%) sono stati aggiunti al tampone permeabilizzazione iniziale per un minimo di conservare la localizzazione AEC. Rodamina-actina, rosso; PERM, verde; falloidina, blu. Scala grafica, 10 micron. <img src="/files/ftp_upload/2409/2409fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. La stimolazione di polimerizzazione dell&#39;actina richiede proteine ​​ERM attivo. DRG dissociata sono stati co-trasfettate con GFP-actina e un controllo GFP plasmide o un dominante negativo Ezrin / Radixin / Moesin (DN ERM) costruire. L&#39;uso di GFP-actina permette l&#39;identificazione di cellule transfettate dopo permeabilizzazione. Qui, NGF è stato aggiunto 5 min prima dell&#39;etichettatura di F-actina finisce spinato. Si noti il ​​cono di crescita transfettate con DN ERM ha ridotto i livelli di fine spinato al margine cono di crescita iniziale (pannello inferiore centrale), che contrasta con un cono di crescita vicina untransfected (pannelli inferiori), o con il controllo GFP (pannello centrale superiore). Rodamina-actina, rosso; GFP-actina, verde. Barre di scala, 10 micron.

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

I metodi qui presentati permettono risoluzione temporale e spaziale dei componenti cellulari che sono coinvolti nel rimodellamento dinamica del citoscheletro di actina al margine leader di migrazione coni di crescita. L&#39;azione di molecole attrattivo, come NGF o netrina, per stimolare rapidamente polimerizzazione filamento si rivela come un aumento locale finisce actina spinato, creato da rottura di filamenti di actina attivato ADF / cofilina 10, come indicato nelle figure 1 e 2. Il metodo permette la loca...

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		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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		<tbody>
		
<tr>
<td>18x18 mm coverslip</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gold Seal</td>
<td>3305</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>35mm Petri dishes</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Falcon</td>
<td>351008</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Aquarium cement</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>DAP 100% silicone aquarium sealant</td>
<td>Any hardware store</td>
</tr>
<tr>
<td>Poly-D-lysine (mw &gt; 300,000)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>P1024</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Natural mouse laminin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>23017-015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>L1 CAM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>R &amp; D systems</td>
<td>777-NC</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Alexa-fluor 350 phalloidin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Molecular Probes)</td>
<td>A22281</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Rhodamine non-muscle actin</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cytoskeleton, Inc.</td>
<td>APHR-A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>F12 Culture medium</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>21700-075</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>B27</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen (Gibco)</td>
<td>17504-044</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Slowfade </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>536937</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

labeling f-actin barbed ends with rhodamine-actin in permeabilized neuronal growth cones

Le punte mobili di assoni in crescita sono chiamati coni di crescita. Coni di crescita degli assoni conducono navigare attraverso i tessuti in via di sviluppo, interagendo con spunti a livello locale ha espresso la guida molecolare che si legano recettori cono di crescita e regolano le dinamiche e l&#39;organizzazione del citoscheletro cono di crescita del 3-6. L&#39;obiettivo principale di questi segnali di navigazione è il reticolo di filamenti di actina che riempie la periferia cono di crescita e che la crescita unità motilità del cono attraverso la polimerizzazione di actina e continuo rimodellamento dinamico 7. Spunti interessanti indicazioni positive o indurre il cono di crescita di svolta stimolando filamenti di actina (F-actina) polimerizzazione nella regione della periferia cono di crescita che è più vicino alla fonte della stecca attrattiva. Questa la polimerizzazione di actina unità locali cono di crescita sporgenza, l&#39;adesione del margine di leader e di allungamento assonale verso l&#39;attrattore. Polimerizzazione filamento dipende dalla disponibilità di monomero di actina sufficiente e su nuclei di polimerizzazione o termina filamenti di actina spinato per l&#39;aggiunta di monomero. Actina monomero è abbondantemente disponibile nel ganglio della radice pulcino della retina e dorsale (DRG) coni di crescita. Di conseguenza, polimerizzazione aumenta rapidamente quando libero F-actina finisce spinato diventano disponibili per oltre monomero. Ciò si verifica in pulcino DRG e coni di crescita della retina mediante l&#39;attivazione locale della F-actina actina rottura delle proteine ​​depolimerizzazione fattore (ADF / cofilina) nella regione del cono di crescita più vicini ad un 80-10 attrattivo. Questa accresciuta ADF / cofilina attività separa i filamenti di actina per creare nuovi F-actina finisce spinato per la polimerizzazione. Il metodo seguito viene illustrato questo meccanismo. Contenuto totale di F-actina sono visibili con la colorazione falloidina fluorescenti. F-actina finisce spinato sono visualizzati con l&#39;incorporamento di rodamina-actina all&#39;interno di coni di crescita che sono permeabilizzate con la procedura descritta nel seguente, che è tratto da studi precedenti di altre cellule mobili 11, 12. Quando rodamina-actina è aggiunto ad una concentrazione al di sopra della concentrazione critica per oltre monomero di actina a fini spinato, rodamina-actina assembla sulla libera finisce spinato. Se lo spunto interessante è presentato in un gradiente, come essere liberati da una micropipetta posizionata su un lato di un cono di crescita, l&#39;incorporazione di rodamina-actina su F-actina finisce spinato sarà maggiore nella parte cono di crescita verso la micropipetta 10 . Coni di crescita sono strutture a piccole cellule e delicato. Le procedure di permeabilizzazione, rodamina-actina incorporazione, la fissazione e la visualizzazione di fluorescenza sono tutte curate e possono essere effettuate sul palcoscenico di un microscopio invertito. Questi metodi possono essere applicati allo studio di polimerizzazione locali actina nei neuroni migrazione, altre cellule del tessuto primarie o linee cellulari.

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Labeling F-actin Barbed Ends with Rhodamine-actin in Permeabilized Neuronal Growth Cones

Un metodo per visualizzare e quantificare F-actina finisce spinato nei coni di crescita neuronale è descritto. Dopo i neuroni colture sulla coprioggetto di vetro, le cellule sono permeabilizzate con una soluzione contenente saponina. Poi, una breve incubazione con il buffer che contiene saponina rodamina-actina actina incorpora fluorescenti sul termina actina libera spinato.

L&#39;etichettatura di F-actina Finisce spinato con Rodamina-actina in permeabilizzate coni di crescita neuronale

The motile tips of growing axons are called growth cones. Growth cones lead navigating axons through developing tissues by interacting with locally ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.7K Views.  University of Minnesota. Un metodo per visualizzare e quantificare F-actina finisce spinato nei coni di crescita neuronale è descritto. Dopo i neuroni colture sulla coprioggetto di vetro, le cellule sono permeabilizzate con una soluzione contenente saponina. Poi, una breve incubazione con il buffer che contiene saponina rodamina-actina actina incorpora fluorescenti sul termina actina libera spinato.

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DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Etichettatura DiOLISTIC di neuroni da roditori e non-umano Fette cervello dei primati

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Ricerca

Neuroscienze

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of behaviors from the spiking activity of its neurons. One of the most effective methods to monitor spiking activity from a large number of neurons in multiple local neuronal circuits simultaneously is by using silicon electrode arrays1-3.
Action potentials produce large transmembrane voltage changes in the vicinity of cell somata. These output signals can be measured by placing a conductor in close proximity of a neuron. If there are many active (spiking) neurons in the vicinity of the tip, the electrode records combined signal from all of them, where contribution of a single neuron is weighted by its 'electrical distance'. Silicon probes are ideal recording electrodes to monitor multiple neurons because of a large number of recording sites (+64) and a small volume. Furthermore, multiple sites can be arranged over a distance of millimeters, thus allowing for the simultaneous recordings of neuronal activity in the various cortical layers or in multiple cortical columns (Fig. 1). Importantly, the geometrically precise distribution of the recording sites also allows for the determination of the spatial relationship of the isolated single neurons4. Here, we describe an acute, large-scale neuronal recording from the left and right forelimb somatosensory cortex simultaneously in an anesthetized rat with silicon probes (Fig. 2).

Extracellular recordings of neuronal activity using silicon probes in the anesthetized rat will be described. This technique allows information to be obtained across multiple brain areas from more than 100 neurons simultaneously. It provides information with single cell resolution about neuronal ensembles dynamics in multiple local circuits.

Registrazione Ensembles neuronali su larga scala con sonde di silicio sotto Rat anestetizzati

Large scale electrophysiological recordings from neuronal ensembles offer the opportunity to investigate how the brain orchestrates the wide variety of ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

Retrograda Etichettatura fluorescente Consente mirata extracellulare singola unità di registrazione da parte dei neuroni identificati<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Due registrazioni elettrofisiologiche di sinapticamente-evocati Risposte astrogliale e neuronale in acute fettine di ippocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells in Adult Zebrafish with Fluorescent Dyes

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs survival and regeneration experiments. Many studies have been performed in mammalian animals to research RGCs survival after optic nerve injury. However, retrograde labeling of RGCs in adult zebrafish has not yet been reported, though some alternative methods can count cell numbers in retinal ganglion cell layers (RGCL). Considering the small size of the adult zebrafish skull and the high risk of death after drilling on the skull, we open the skull with the help of acid-etching and seal the hole with a light curing bond, which could significantly improve the survival rate. After absorbing the dyes for 5 days, almost all the RGCs are labeled. As this method does not need to transect the optic nerve, it is irreplaceable in the research of RGCs survival after optic nerve crush in adult zebrafish. Here, we introduce this method step by step and provide representative results.

We introduce an efficient method to retrograde label retinal ganglion cells (RGCs) in adult zebrafish.

Etichettatura retrograda di cellule gangliari della retina in Zebrafish adulti con coloranti fluorescenti

As retrograde labeling retinal ganglion cells (RGCs) can isolate RGCs somata from dying sites, it has become the gold standard for counting RGCs in RGCs ...

Preparation of Neuronal Co-cultures with Single Cell Precision

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms can be used to investigate a variety of questions, spanning developmental and functional neurobiology to infection and disease propagation. However, conventional systems require significant cellular inputs (many thousands per compartment), inadequate for studying low abundance cells, such as primary dopaminergic substantia nigra, spiral ganglia, and Drosophilia melanogaster neurons, and impractical for high throughput experimentation. The dense cultures are also highly locally entangled, with few outgrowths (&#60;10%) interconnecting the two cultures. In this paper straightforward microfluidic and patterning protocols are described which address these challenges: (i) a microfluidic single neuron arraying method, and (ii) a water masking method for plasma patterning biomaterial coatings to register neurons and promote outgrowth between compartments. Minimalistic neuronal co-cultures were prepared with high-level (&#62;85%) intercompartment connectivity and can be used for high throughput neurobiology experiments with single cell precision.

Protocols for single neuron microfluidic arraying and water masking for the in-chip plasma patterning of biomaterial coatings are described. Highly interconnected co-cultures can be prepared using minimal cell inputs.

Preparazione della neuronali Co-culture con precisione singola cella

Microfluidic embodiments of the Campenot chamber have attracted great interest from the neuroscience community. These interconnected co-culture platforms ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Indurre Plasticità di astrociti recettori per manipolazione del neuronali di cottura Prezzi

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich structures suggest alterations in synaptic integrity and connectivity. Here we provide a detailed protocol for culturing primary rat cortical neurons, Phalloidin staining for F-actin puncta, and subsequent quantification techniques. First, the frontal cortex of E18 rat embryos are dissociated into low-density cell culture, then the neurons grown in vitro for at least 12-14 days. Following experimental treatment, the cortical neurons are stained with AlexaFluor 488 Phalloidin (to label the dendritic F-actin puncta) and microtubule-associated protein 2 (MAP2; to validate the neuronal cells and dendritic integrity). Finally, specialized software is used to analyze and quantify randomly selected neuronal dendrites. F-actin rich structures are identified on second order dendritic branches (length range 25-75 &#181;m) with continuous MAP2 immunofluorescence. The protocol presented here will be a useful method for investigating changes in dendritic synapse structures subsequent to experimental treatments.

Quantification of Filamentous Actin F-actin Puncta in Rat Cortical Neurons

Filamentous actin (F-actin) plays an important role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Quantification of F-actin puncta is therefore a useful tool to study the integrity of synaptic structures. This protocol describes the procedures of quantifying F-actin puncta labeled with Phalloidin in low-density primary cortical neuronal cultures.

La quantificazione di filamentosa Actina (F-actina) Puncta nel ratto neuroni corticali

Filamentous actin protein (F-actin) plays a major role in spinogenesis, synaptic plasticity, and synaptic stability. Changes in dendritic F-actin rich ...