This work has been supported by NINDS, RO1NS52699 and MH84874 to SA. 
We would like to thank Dr. Dave Featherstone (Department of Biological Sciences, University for Illinois at Chicago) for providing us with the suture glue used in the immunohistochemistry work. We thank Michael Alpert for his comments and proofreading of the manuscript.

1 Preparazione di Poly-D-lisina Hydrobromide <ol><li> Preparare 1 mg / ml di poli-D-lisina bromidrato in 0,1 M tampone borato (pH 8,5). </li><li> Aliquota e conservare a -20 ° C. </li></ol> Rivestimento 2 Poly-lisina di vetrini Nota: Eseguire tutte le operazioni di pulizia e di rivestimento in una camera di flusso laminare. <ol><li> Luogo coprioggetto in una capsula di Petri contenente 1 N acido cloridrico (HCl) per 2 ore. </li><li> Aspirare tutto HCl e risciacquare con il 70% di etanolo (EtOH) 2-3x. </li><li> Lasciare in 70% EtOH per 1 ora. </li><li> Aspirare tutto il 70% EtOH e risciacquare con il 100% EtOH 2-3x. </li><li> Lasciare in 100% EtOH per 2 ore. Aspirare tutto EtOH. </li><li> Asciugare con carta da filtro e asciugare all&#39;aria per pochi secondi. </li><li> Luogo O / N in 1 mg / soluzione poli-lisina ml. </li><li> Sciacquare coprioggetto giorno dopo con acqua Millipore 4-5x. </li><li> Aria secca poli-lisina rivestite coprioggetto su rulli di vetro in un piatto pulito Petri. </li><li> Per immunohistochemistry, utilizzare 35 x 10 mm Petri coperchi piatto. Preparare sylgard (polydimethylsilioxane, PDMS) fiancheggiata piatti versando PDMS (elastomero e induritore 10: 1 in peso) nella capsula ad uno spessore di 0,3 cm, permettono di fissare a 30 ° CO / N. Una volta che questo è impostato, tagliare 2 cm di 1 cm incastonate nelle PDMS. Pulire e ricoprire il riquadro con poli-lisina seguendo la stessa procedura di cui sopra per coprioggetto. </li><li> Conservare coprioggetti e piatti rivestiti di poli-lisina coperti all&#39;interno della camera a flusso laminare fino al momento dell&#39;uso (fino a 2 settimane, ma ottenere i migliori risultati adesive preparando periodicamente ogni 3-4 giorni). </li><li> Preparare un blocco PDMS, al pin del midollo spinale nel affettatrice tessuto vibrante. Mix Elastomero Elastomero A e B 1: 1 in peso. Versare in una piastra di Petri di 100 x 15 mm e permettono di impostare O / N a 30 ° C. Tagliare un pezzo rettangolare di PMDS e la colla alla piastra di base per affettare con colla epossidica. Lasciare che la colla per impostare fissa i PDMS in atto e affettare più sezioni sottili sulla superficie per ottenere un appartamentosuperficie al pin del tessuto su. </li></ol> 3. acuta dissociazione della Lampreda Spinal Cord cedere isolati reticulospinal assoni <ol><li> Anestetizzare un ammoecoete o adulto lampreda (Petromyzon marinus) con tricaine metansulfonato (MS-222, 100 mg / L). Aggiungere anestetico in acqua, in una tazza di plastica coperto da un coperchio, contenente la lampreda di essere sacrificato. </li><li> Decapitare lampreda a freddo (4 ° C), soluzione di Ringer avente la seguente composizione (in mM): 130 NaCl, 2.1 KCl, 2,6 CaCl 2, 1.8 MgCl 2, 4 HEPES, 4 destrosio (pH 7.6, osmolarità 270 mOsm) e rimuovere il corpo muscoli della parete per esporre la superficie dorsale del midollo spinale. </li><li> Rimuovere meninge primitiva dalla superficie dorsale del midollo spinale con una pinza sottile. Non rimuovere ventrale meninge primitiva in questa fase. </li><li> Tagliare midollo spinale in 1 cm di lunghezza pezzi. </li><li> Pin un pezzo del midollo spinale utilizzando sottili perni di insetti, lato dorsale rivolta verso l&#39;alto, su un PDMS affettare pla di base foderatote (vedi 2.12) in un tessuto vibrante camera di affettatrice contenente soluzione ghiacciata di Ringer. </li><li> Rimuovere una sezione centrale della colonna dorsale del midollo spinale mediante tranciatura lungo l&#39;asse rostro-caudale con la lama, lasciando intatte le sezioni di colonna dorsale sul rostrale e caudale finisce per servire come maniglie durante il processo di dissociazione Figura 2a e la Figura 2b. Utilizzare l&#39;impostazione più lenta della velocità che permette affettare e un ambiente profondità che rimuove solo la colonna dorsale lasciando sottostante colonna assone reticulospinal Figura 2b non danneggiato. </li><li> Incubare pezzi del midollo spinale a fette a temperatura ambiente per 45 minuti in un cocktail di 1 mg / proteasi ml (tipo XIV da Streptomyces griseus) e 1 mg / collagenasi ml di preparato (tipo IA da Clostridium histolyticum) in soluzione di Ringer (adattato da El Manira &amp; Bussières 1997 17). </li><li> Pezzi del midollo spinale Pin enzimi trattati con perni sottili in un PDMS allineati Petri dish Contavorazio freddo (4 ° C), soluzione di Ringer. </li><li> Rimuovere ventrale meninge primitiva con una pinza sottile. </li><li> Tagliare tratti laterali del midollo spinale con una lama di bisturi a metà della sezione dorsale fette lasciando la colonna centrale di assoni reticulospinal intatti nel midollo spinale Figura 2d. </li><li> Mettere una goccia di olio di immersione sulla lente. </li><li> Posizionare il coprioggetto poli-lisina rivestito (figura 3a, pezzo superiore, rettangolo rosso) nella fessura della figura camera di registrazione 3 e applicare grasso per vuoto a tutti i bordi (spazio tra rettangoli rossi e blu in figura 3a, per facilitare un sigillo. Vite la parte superiore in posizione. Inserite la camera nel riquadro sulla piattaforma di registrazione. </li><li> Aggiungere la soluzione di Ringer nella camera di registrazione con una pipetta Pasteur. </li><li> Collegare il tubo di efflusso della bombola a pressione contenente soluzione antigelo per il tubo di ingresso del dispositivo di raffreddamento termoelettrico. Collegare il output tubo del dispositivo di raffreddamento termoelettrico al fine di ingresso della camicia di raffreddamento esterno e l&#39;estremità di uscita al serbatoio Figura 3b. </li><li> Mettete un pezzo di midollo spinale in un momento in camera di registrazione e separare delicatamente il midollo spinale mantenendo lungo il vetrino in ogni momento utilizzando pinze rivestite in teflon fino assoni sono isolati Figura 2e e 2f Figura. </li><li> Portare la temperatura della soluzione di registrazione a 10 ° C facendo passare l&#39;(azoto gassoso viene spinto nella bottiglia) pressurizzato soluzione antigelo (per spostamento), tramite il dispositivo di raffreddamento termoelettrico, attraverso la camicia di raffreddamento esterno della camera di Figura 3b registrazione. </li><li> Consenti assoni di recuperare per 1 ora posto dissociazione a 10 ° C. </li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig2highres.jpg" width="400" /> <strong&gt; Figura 2 Descrizione schematica del protocollo di dissociazione per l&#39;isolamento degli assoni reticulospinal. (A) la rimozione della colonna dorsale. La freccia indica la direzione di taglio del tessuto. Le corna dorsali sono contrassegnati da l&#39;alfabeto D (font color rosso), mentre le corna ventrali per l&#39;alfabeto V (font color rosso). (B) colonna Dorsale rimosso nella porzione centrale del midollo spinale esponendo gli assoni reticulospinal (linee verdi ). Le corna ventrali, che rimangono intatti dopo il processo di taglio, sono contrassegnati da l&#39;alfabeto V (font color rosso). (C) 45 min trattamento con proteasi e collagenasi enzimi cocktail (1 mg / ml). (D) Taglio delle vie laterali del midollo spinale; che indica la posizione, la direzione e la portata del taglio laterale. (e) dissociazione meccanica del midollo spinale. Le frecce indicano la posizione delle pinze e la direzione della forza di separazione durante la dissociazione. (F) representative esempio di dissociato preparazione assone reticulospinal. Le frecce verdi indicano le regioni di assoni reticulospinal acutamente dissociate, senza alcun processo post-sinaptici. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51925/51925fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 Schema di registrazione da camera per esperimenti di elettrofisiologia. Dimensioni previste sono in pollici. Rettangolo rosso mostrato nel diagramma basepiece (a) indica il posizionamento del coprioggetto nella scanalatura coprioggetto in basepiece. La regione tra il rettangolo rosso e blu, illustrato nel diagramma basepiece (a) è dove viene applicato il grasso alto vuoto. (B) mostra la camera di registrazione assemblato. 4. etichettatura e identificazione di terminali presinaptici con FM 1-43 <ol><li> Etichetta terminali presinaptici, incorporando FM 1-43 in vesicles durante synaptic eso-endocitosi durante l&#39;alta K + depolarizzazione. Profumato preparato con 5 mM FM 1-43 (in soluzione 5 ml di Ringer contenente KCl 30 mM). </li><li> Profumato preparato con 1 mg / ml Advasep-7 (in 5 ml di soluzione di Ringer) per rimuovere l&#39;eccesso di colorante FM) 18. </li><li> Profumato preparazione con la soluzione di Ringer per 15 min a dilavamenti qualsiasi colorante Remant e la Advasep. </li><li> Immagine con 100 X obiettivo a immersione in olio (NA 1,25) su un microscopio a fluorescenza invertito, in combinazione con una fotocamera digitale CCD e acquisizione delle immagini software micromanager, utilizzando protocolli di imaging di fluorescenza standard. </li><li> Identificare i terminali presinaptici fluorescente a bersaglio per la registrazione Figura 4c e 4d Figura. </li></ol> 5. immunoistochimica di isolati reticulospinal assoni <ol><li> Riempire piatto inserto (sezione Protocol 2.10.) Con bivalente-ione (Ca 2 + e Mg 2 +) gratisSoluzione di Ringer. </li><li> Realizzare pipette di patch in una micropipetta estrattore P-87. Mettere una piccola quantità di colla sutura ad una estremità del kit di poli-lisina utilizzando una pipetta di patch (1,5 millimetri di vetro di diametro esterno) e di aspirazione (utilizzando un tubo in silicone 0,89 millimetri di diametro interno con una punta micropipetta fissato all&#39;estremità di aspirazione). </li><li> Effettuare dissociazioni utilizzando la stessa procedura di cui alla sezione Protocollo 3 Figura 2. Posizionare un&#39;estremità del midollo spinale sulla colla sutura e premere delicatamente con una pinza ad aderire con forza alla superficie. Mettere una goccia di colla sutura all&#39;altra estremità del riquadro e allungare delicatamente il midollo spinale fino assoni sono dissociate e aderire l&#39;estremità del midollo spinale libero trascinandola delicatamente sopra la colla sutura. Fissare in posizione da pressatura soffice verso il basso con le pinze. </li><li> Bivalente Libero scambio soluzione di Ringer con la soluzione regolare di Ringer da perfusione. </li><li> Consenti assoni di recuperare per 20 min dopo dissociation a 10 ° C. </li><li> Fissare assoni dissociate in 4% paraformaldeide (PFA) {preparato in tampone fosfato salino (PBS, (mm) 137 NaCl, KCl 2.7, Na 2 HPO 4 10, KH 2 PO 4 1.8, pH 7,4)} per 20 min. Filtrare la soluzione PFA prima dell&#39;uso passando attraverso un filtro a siringa da 0,2 micron. </li><li> Lavare il PFA mediante perfusione 0,1 M glicina (in PBS) per 10 min. </li><li> Incubare in 0,1% Triton-X (in PBS) per 10 min. </li><li> Lavare mediante perfusione PBS per 20 min. </li><li> Bloccare con latte non grasso 5% (in PBS) per 6 ore a 4 ° C. </li><li> Aggiungi in anticorpo primario per VGCC di interesse (1: 200 diluizione in PBS) e incubare per 20 ore a 4 ° C. </li><li> Lavare mediante perfusione PBS per 20 min. </li><li> Bloccare con latte non grasso 5% (in PBS) per 10 min a 4 ° C. </li><li> Aggiungi a anticorpo secondario (1: 400 diluizione in PBS) e incubare al buio per 2 ore a 4 ° C. </li><li> Lavare mediante perfusione con PBS per 20 min. </li><li> Blocco con 1% di siero bovino Albumin (in PBS) per 20 min. </li><li> Aggiungi a Alexa Fluor 488 falloidina (5 unità / ml concentrazione di lavoro; magazzino preparato in metanolo 200 Unità / ml). </li><li> Lavare mediante perfusione con PBS per 20 min. </li><li> Immagine con obiettivo a immersione 100X acqua sul microscopio confocale. </li></ol> 6. elettrofisiologiche di registrazione <ol><li> Realizzare pipette di patch di vetro alluminosilicato (resistenza pipetta 2-5 MW) in una micropipetta estrattore P-87. Progettazione di patch pipetta in modo che la punta della pipetta abbraccia tutto il diametro del terminale presinaptico. </li><li> PDMS pipette di patch cappotto immergendo la pipetta di patch sotto pressione 50-60 psi in PDMS 23 (allegare un tubo di silicone, 0,89 millimetri di diametro interno, collegato ad una bombola di gas di azoto, al back-end della pipetta di patch) e asciugare con un calore pistola. In alternativa, cappotto manualmente la pipetta con PDMS, applicando il rivestimento più vicino alla punta più possibile, sotto un microscopio composto. </li><li> Fuoco pipette di patch smalto utilizzando un microforge (un filamento di platino su misura montata sul palco di un microscopio composto). </li><li> Identificare assoni isolate dimostrano terminali presinaptici etichettati da microscopia a fluorescenza. </li><li> Riempire soluzione di registrazione (progettata per isolare Ca 2 + correnti; 10 mM CaCl 2 o 90 mm ​​BaCl 2 come portatori di carica, tamponata con HEPES pH 7,6, osmolarità 270 mOsm) nella pipetta di patch con una siringa. </li><li> Inserire la pipetta di patch nel supporto pipetta e la posizione sopra il bagno utilizzando un manipolatore MP225 motorizzato. Abbassare delicatamente la pipetta di patch nel bagno e la posizione contro la faccia di un terminale presinaptico fluorescente identificato. </li><li> Anticipo la pipetta di patch lentamente fino di contatto con la membrana. A questo punto, ottenere una tenuta gigaohm da aspirazione delicata bocca attraverso un tubo collegato al titolare pipetta. </li><li> Per ottenere i bassissimi livelli di rumore di fondo necessarie per la registrazione di singolo canale Ca 2 + correnti, utilizzare un Axopatch 200B con un headstage raffreddata per le registrazioni. Dati campione a 20-50 kHz e filtro con un filtro di Bessel 5 kHz. Eseguire l&#39;acquisizione di dati tramite un Axograph X. </li><li> Utilizzare un protocollo standard di passo, in incrementi di 10 mV come stimolo. Incorporare un pre-impulso nel protocollo, che precede il protocollo passo, al fine di garantire l&#39;attivazione massima di canali del Ca 2 +. Incorporare un 10 mV perdita passo verso il protocollo step per la post-analisi sottrazione delle correnti di fuga. </li></ol>

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The authors do not have any competing financial interests or other conflicts of interest to disclose.

Il nostro protocollo dissociazione è significativa cedendo isolati assoni reticulospinal privi di postsinaptico proiezioni figura 2f, ma che tuttavia mantengono funzionale presinaptica terminali Figura 4c e 4d Figura. L&#39;assenza di processi di post-sinaptici che si oppongono al terminale presinaptico registrazione consente l&#39;accesso diretto alla membrana di rilascio presinaptico faccia a terminali presinaptici singoli, in precedenza non possibile in sinapsi cent...

Trasmissione sinaptica è un processo estremamente rapido e preciso. Azione potenziale invasione del terminale presinaptico porta all&#39;apertura dei VGCCs situati nella membrana di rilascio viso, il conseguente aumento della presinaptico Ca 2 + che funge da innesco per la fusione della vescicola e neurotrasmettitore rilascio 1. Tutti questi passaggi si verificano all&#39;interno di centinaia di microsecondi 2, e quindi richiedono accoppiamento spaziale stretto VGCCs alle macchine di fusione delle vescicole 3. Presinaptici Ca 2 + flussi sono stati caratterizzati principalmente attraverso approcci di imaging utilizzando Ca 2 + coloranti sensibili 4. Integrare Ca 2 + buffer che modulano Ca 2 + nei neuroni presinaptici è stato utilizzato per caratterizzare indirettamente il rapporto tra calcio presinaptico e neurotrasmissione 3. Inoltre, modulando la presinaptico libera Ca 2 + concentrazione da uncaging Ca 2 + 5 o registrazione macroscopic Ca 2 + correnti sono stati utilizzati in combinazione con misure di fusione della vescicola e / o rilascio; quali misure di capacità di 6 o postsinaptici 2 risposte per affrontare la stessa domanda. Tuttavia, caratterizzando Ca 2 + correnti direttamente in faccia rilascio, la sezione specializzata della membrana presinaptica dove depolarizzazione della membrana viene tradotto in Ca 2 + correnti di attivazione sinaptica fusione delle vescicole e il rilascio dei neurotrasmettitori, è parte integrante di ottenere una misura precisa del Ca 2 + requisito per la fusione delle vescicole sinaptiche. Inoltre, la capacità di caratterizzare direttamente Ca 2 + correnti a singoli terminali presinaptici, accoppiato con misure simultanee accurate di fusione della vescicola e rilascio permette una spiegazione precisa della relazione temporale tra l&#39;andamento temporale del potenziale d&#39;azione, presinaptico Ca 2 + corrente, fusione della vescicola e rilascio. L&#39;accesso alla membrana di rilascio visonon è disponibile nella maggior parte dei terminali presinaptici dovuti a chiudere apposizione da parte dei dendriti postsinaptici. Questa inaccessibilità è stato un grande ostacolo nella caratterizzazione di VGCCs quanto impedisce misure dirette di corrente a singoli terminali presinaptici. Caratterizzazione diretta di presinaptici Ca 2 + correnti a singoli terminali presinaptici non è finora stato possibile in sinapsi centrali ed è stato raggiunto solo in due terminali presinaptici di tipo caliceale; calice-tipo sinapsi delle pulcino ganglio ciliare 7-10 e ratto calici 11,12. In tutti gli altri terminali presinaptici tra cui la sinapsi reticulospinal gigante nella lampreda midollo spinale 13, la mancanza di accesso alla membrana di rilascio volto presinaptica ha reso necessario l&#39;utilizzo di approcci indiretti come Ca 2 + di imaging per studiare presinaptici Ca 2 + flussi. <img alt="Figura 1" fO: content-width = src &quot;5in&quot; = &quot;/ files / ftp_upload / 51925 / 51925fig1highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figura 1 Lampreda gigante sinapsi reticulospinal. (A) Sezione di lampreda midollo spinale che indica l&#39;orientamento dorso-ventrale. Assoni reticulospinal sono contrassegnati dall&#39;asterisco verde. (B) 3-D ricostruzione della sinapsi reticulospinal nella lampreda midollo spinale che mostra presinaptico assone reticulospinal facendo numerosi en passant contatti (contrassegnato da frecce verdi) sul neurone postsinaptico 13. Terminali presinaptici sono stati etichettati con Alexa Fluor 488 hydrazide falloidina coniugato (verde), mentre il neurone postsinaptico è stato riempito con Alexa Fluor 568 hydrazide (rosso). Lampreda assoni giganti reticulospinal, situato nella regione ventrale del midollo spinale parallelo al rostrale-caudale asse Figura 1a, forma multipla en passant contatti sinaptici sui neuroni delspinale corno ventrale 14 Figura 1b 13. Whole-cell macroscopica Ca 2 + correnti sono state registrate da assoni reticulospinal nel midollo spinale intatto 13,15. Tuttavia, precedenti tentativi ciechi a misura diretta di Ca 2 + correnti in assoni reticulospinal nel intatta lampreda midollo spinale utilizzando cellule-attached tecnica del patch clamp hanno provato senza successo 13 a causa della mancanza di accesso alla membrana presinaptica rilascio volto a causa dei processi di postsinaptici opposte Figura 1b. La membrana di rilascio volto è stato in precedenza reso accessibile dalla rimozione del neurone postsinaptico 11, perturbazione meccanica della sinapsi prima di registrare 12 o trattamento enzimatico accoppiato con dissociazione meccanica 16. Data la complessa organizzazione del midollo spinale, che si sarebbe rivelato estremamente difficile identificare il neurone postsinaptico e ritrarre meccanicamente o perturbare the sinapsi. Quindi, abbiamo deciso di utilizzare il trattamento enzimatico 17 seguita da dissociazione meccanica. Usando questo approccio, abbiamo sviluppato una preparazione acutamente dissociata della lampreda midollo spinale che produce vitali isolati assoni reticulospinal con terminali presinaptici funzionali privi di qualsiasi processo post-sinaptici, fornendo così un accesso illimitato ai singoli terminali presinaptici. In combinazione con un microscopio invertito e standard di imaging di fluorescenza, che ci permette di identificare e indirizzare i singoli terminali presinaptici fluorescenti-identificato, con una pipetta di patch contenente una soluzione di registrazione che isola Ca 2 + correnti figura 4c e 4d figura, per la registrazione utilizzando cellulo- allegato tecnica voltage-clamp. Ca 2 + correnti sono state registrate direttamente a livello della membrana presinaptica del rilascio volto dell&#39;individuo terminali presinaptici figura 4f. Questo è un significant passo avanti nel campo della trasmissione sinaptica poiché è la prima di tali registrazioni da effettuare in sinapsi centrali.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="713">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:211px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td style="width:211px;">EMD Millipore</td>
			<td style="width:119px;">SLGV004SL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">22x60 mm coverslips</td>
			<td style="width:211px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">12545J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Advasep-7</td>
			<td style="width:211px;">Cydex Pharmaceuticals</td>
			<td style="width:119px;">ADV7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A12379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">A21070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Antifreeze</td>
			<td style="width:211px;">Prestone</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Boric acid</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Bright field light source</td>
			<td style="width:211px;">Dolan-Jenner</td>
			<td style="width:119px;">Fiberlite 180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Collagenase Type IA from Cloristridium histolyticum</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Cover slip</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-545-J</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dextrose</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9559</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Digital CCD Camera</td>
			<td style="width:211px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:119px;">C8484-03G01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection fine forceps</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection forceps</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11251-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection microscope</td>
			<td style="width:211px;">Leica Biosystems</td>
			<td style="width:119px;">Leica MZ 12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection scissors</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15025-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection scissors fine</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Dissection scissors ultra fine</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">15000-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">FM 1-43</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen/Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">T3163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Glycine</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">HEPES</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H7523</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">High vacuum grease</td>
			<td style="width:211px;">Dow-Corning</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:211px;">Fisherbrand</td>
			<td style="width:119px;">SA-56-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Immersion oil</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">M2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Industrial grade Nitrogen gas tank</td>
			<td style="width:211px;">Praxair</td>
			<td style="width:119px;">UN1066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Insect pins</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">26002-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:216px;">Liquid suture glue</td>
			<td>Braun Veterinary Cair Division</td>
			<td style="width:119px;">8V0305</td>
			<td>The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Methanol</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right" style="width:119px;">154903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Non-fat dry milk</td>
			<td style="width:211px;">Cell Signaling Technology</td>
			<td style="width:119px;">9999S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">P-87 Micropipette puller</td>
			<td style="width:211px;">Sutter Instruments</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Perfusion pump</td>
			<td style="width:211px;">Cole-Palmer</td>
			<td style="width:119px;">Masterflex C/L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Petri dish 100x15 mm</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Petri dish 35x10 mm</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-scientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">875712</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Poly-D-lysine hydrobromide</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P1024</td>
			<td>MW &#62; 300000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Potassium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Potassium phosphate monobasic</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5379</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Primary antibodiesR-type calcium channel</td>
			<td style="width:211px;">Alomone Labs</td>
			<td style="width:119px;">ACC-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Protease Type XIV from Streptomyces griseus</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Scalpel blades</td>
			<td style="width:211px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">500240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Schot Duran Preesure Bottle</td>
			<td style="width:211px;">Fisher-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">09-841-006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:216px;">Silicone tubing for glue application</td>
			<td style="width:211px;">Cole-Palmer</td>
			<td>07625-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Slicing base plate</td>
			<td style="width:211px;">Leica Biosystems</td>
			<td align="right" style="width:119px;">14046327404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:216px;">Slicing chamber</td>
			<td style="width:211px;">Leica Biosystems</td>
			<td align="right">1.4046E+10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:211px;"></td>
			<td style="width:119px;">S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Sodium tetraborate</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B3545</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:211px;">Dow Corning&#160;</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD&#174; 160</td>
			<td>To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:211px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:119px;">SYLGARD&#174; 184&#160;</td>
			<td>To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Teflon coated forceps</td>
			<td style="width:211px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:119px;">11626-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tricaine methanesulphonate</td>
			<td style="width:211px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Vibratome blades</td>
			<td style="width:211px;">World Precision Instruments&#160;</td>
			<td style="width:119px;">BLADES</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Xenon lamp</td>
			<td style="width:211px;">Nikon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute dissociation of lamprey reticulospinal axons to enable recording from the release face membrane of individual functional presynaptic terminals

Trasmissione sinaptica è un processo estremamente rapido. Potenziale d&#39;azione guidato afflusso di Ca 2 + nel terminale presinaptico, attraverso i canali del calcio voltaggio-dipendenti (VGCCs) situati nella membrana faccia rilascio, è l&#39;innesco per fusione della vescicola e il rilascio dei neurotrasmettitori. Fondamentale per la rapidità di trasmissione sinaptica è la sincronia spaziale e temporale tra l&#39;arrivo del potenziale d&#39;azione, VGCCs e macchinari rilascio dei neurotrasmettitori. La possibilità di registrare direttamente Ca 2 + correnti dalla membrana di rilascio volto dei singoli terminali presinaptici è indispensabile per una precisa comprensione del rapporto tra presinaptica Ca 2 + e il rilascio dei neurotrasmettitori. L&#39;accesso alla membrana di rilascio presinaptico viso per la registrazione elettrofisiologica non è disponibile nella maggior parte dei preparati e Ca 2 + presinaptico voce è stata caratterizzata mediante tecniche di imaging e macroscopica MeasureMe attualenti - tecniche che non hanno risoluzione temporale sufficiente per visualizzare Ca 2 + voce. La caratterizzazione di VGCCs direttamente presso i terminali presinaptici singoli non è stato possibile in sinapsi centrali ed è stato finora realizzato con successo soltanto nel calice-tipo sinapsi del ganglio ciliare pulcino e in calici di ratto. Abbiamo affrontato con successo questo problema nella sinapsi reticulospinal gigante del lampreda midollo spinale attraverso lo sviluppo di una preparazione acutamente dissociata del midollo spinale che produce isolati assoni reticulospinal con terminali presinaptici funzionali prive di strutture di post-sinaptici. Possiamo fluorescente etichettare e identificare i singoli terminali presinaptici e loro destinazione per la registrazione. Utilizzando questa preparazione, abbiamo caratterizzato VGCCs direttamente in faccia rilascio dei singoli terminali presinaptici utilizzando approcci di immunoistochimica e di elettrofisiologia. Ca 2 + correnti sono stati registrati direttamente al rilascio viso membrana of singoli terminali presinaptici, il primo di tali registrazioni da effettuare a livello delle sinapsi centrali.

<html> Questo produce protocollo dissociazione sani e funzionali isolate assoni reticulospinal privi di postsinaptico proiezioni figura 2f, ma che tuttavia conservano terminali presinaptici funzionali capaci di vescicole sinaptiche evocate eso-ed endocitosi Figura 4c e 4d Figura. Sezioni delle regioni isolate degli assoni reticulospinal possano essere chiaramente identificati al microscopio ottico per essere chiari di altri processi neuronali che consentono l&#39;accesso...

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Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Acuta dissociazione di Lamprey reticulospinal assoni per attivare la registrazione dal rilascio Volto membrana di singoli funzionali terminali presinaptici

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

acute-dissociation-lamprey-reticulospinal-axons-to-enable-recording

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.7K Views.  University of Illinois at Chicago. Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals. 

Video: Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

La zona subventricolare En-face: colorazione Wholemount e flusso ependimale

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

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Neuroscienze

Vibrodissociation of Neurons from Rodent Brain Slices to Study Synaptic Transmission and Image Presynaptic Terminals

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of interest. This allows for examination of synaptic transmission under conditions where the extracellular and postsynaptic intracellular environments can be well controlled. A vibration-based technique without the use of proteases, known as vibrodissociation, is the most popular technique for mechanical isolation. A micropipette, with the tip fire-polished to the shape of a small ball, is placed into a brain slice made from a P1-P21 rodent. The micropipette is vibrated parallel to the slice surface and lowered through the slice thickness resulting in the liberation of isolated neurons. The isolated neurons are ready for study within a few minutes of vibrodissociation. This technique has advantages over the use of primary neuronal cultures, brain slices and enzymatically isolated neurons including: rapid production of viable, relatively mature neurons suitable for electrophysiological and imaging studies; superior control of the extracellular environment free from the influence of neighboring cells; suitability for well-controlled pharmacological experiments using rapid drug application and total cell superfusion; and improved space-clamp in whole-cell recordings relative to neurons in slice or cell culture preparations. This preparation can be used to examine synaptic physiology, pharmacology, modulation and plasticity. Real-time imaging of both pre- and postsynaptic elements in the living cells and boutons is also possible using vibrodissociated neurons. Characterization of the molecular constituents of pre- and postsynaptic elements can also be achieved with immunological and imaging-based approaches.

This report demonstrates a technique for mechanical isolation of individual viable neurons retaining attached presynaptic boutons. Vibrodissociated neurons have the advantages of rapid production, excellent pharmacological control and improved space-clamp without influence from neighboring cells. This method can be used for imaging of synaptic elements and patch-clamp recording.

Vibrodissociation di neuroni da fettine di cervello di roditore studio di trasmissione sinaptica e Immagine terminali presinaptici

Mechanical dissociation of neurons from the central nervous system has the advantage that presynaptic boutons remain attached to the isolated neuron of ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Tensione sensibile registrazione Dye da assoni, dendriti e spine dendritiche dei singoli neuroni in fettine di cervello

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Laser nanochirurgia di cerebellari Assoni<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of primary afferent fibers mediated by GABAergic axo-axonal synapses (primary afferent depolarization). The strength of primary afferent depolarization can be measured by recording of volume-conducted potentials at the dorsal root (dorsal root potentials, DRP). Pathological changes of presynaptic inhibition are crucial in the abnormal central processing of certain pain conditions and in some disorders of motor hyperexcitability. Here, we describe a method of recording DRP in vivo in mice. The preparation of spinal cord dorsal roots in the anesthetized animal and the recording procedure using suction electrodes are explained. This method allows measuring GABAergic DRP and thereby estimating spinal presynaptic inhibition in the living mouse. In combination with transgenic mouse models, DRP recording may serve as a powerful tool to investigate disease-associated spinal pathophysiology. In vivo recording has several advantages compared to ex vivo isolated spinal cord preparations, e.g. the possibility of simultaneous recording or manipulation of supraspinal networks and induction of DRP by stimulation of peripheral nerves.

Measuring Spinal Presynaptic Inhibition in Mice By Dorsal Root Potential Recording In Vivo

GABAergic presynaptic inhibition is a powerful inhibitory mechanism in the spinal cord important for motor and sensory signal integration in spinal cord networks. Underlying primary afferent depolarization can be measured by recording of dorsal root potentials (DRP). Here we demonstrate a method of in vivo recording of DRP in mice.

Misurare spinale Presinaptiche inibizione nei topi radice dorsale Recording potenziale<em&gt; In Vivo</em

Presynaptic inhibition is one of the most powerful inhibitory mechanisms in the spinal cord. The underlying physiological mechanism is a depolarization of ...

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to blindness in many retinal diseases. Calcium (Ca2+), a key second messenger in photoreceptor signaling and metabolism, has been proposed to be indirectly linked with photoreceptor degeneration in various animal models. Systematically studying these aspects of cone physiology and pathophysiology has been hampered by the difficulties of electrically recording from these small cells, in particular in the mouse where the retina is dominated by rod photoreceptors. To circumvent this issue, we established a two-photon Ca2+ imaging protocol using a transgenic mouse line that expresses the genetically encoded Ca2+ biosensor TN-XL exclusively in cones and can be crossbred with mouse models for photoreceptor degeneration. The protocol described here involves preparing vertical sections (&#8220;slices&#8221;) of retinas from mice and optical imaging of light stimulus-evoked changes in cone Ca2+ level. The protocol also allows &#8220;in-slice measurement&#8221; of absolute Ca2+ concentrations; as the recordings can be followed by calibration. This protocol enables studies into functional cone properties and is expected to contribute to the understanding of cone Ca2+ signaling as well as the potential involvement of Ca2+ in photoreceptor death and retinal degeneration.

Imaging Ca2+ Dynamics in Cone Photoreceptor Axon Terminals of the Mouse Retina

We describe a protocol to monitor Ca2+ dynamics in the axon terminals of cone photoreceptors using an ex-vivo&#160;slice preparation of the mouse retina. This protocol allows comprehensive studies of cone Ca2+ signaling in an important mammalian model system, the mouse.

Imaging Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Dinamica a cono fotorecettore Axon Terminali della retina di topo

Retinal cone photoreceptors (cones) serve daylight vision and are the basis of color discrimination. They are subject to degeneration, often leading to ...

Live Imaging of Nicotine Induced Calcium Signaling and Neurotransmitter Release Along Ventral Hippocampal Axons

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) is an important mechanism for neuromodulation by acetylcholine (ACh). The difficulty with access to probing the signaling mechanisms within intact axons and at nerve terminals both in vitro and in vivo has limited progress in the study of the pre-synaptic components of synaptic plasticity. Here we introduce a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal (vHipp)&#8211;accumbens (nAcc) circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze both the pre- and post-synaptic components of transmission while selectively varying the genetic profile of the pre- vs post-synaptic neurons. We demonstrate that projections from vHipp microslices, as pre-synaptic axonal input, form multiple, reliable glutamatergic synapses with post-synaptic targets, the dispersed neurons from nAcc. The pre-synaptic localization of various subtypes of nAChRs are detected and the pre-synaptic nicotinic signaling mediated synaptic transmission are monitored by concurrent electrophysiological recording and live cell imaging. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of glutamatergic synaptic plasticity in vitro.

We developed a gene-chimeric preparation of ventral hippocampal &#8211; accumbens circuit in vitro that allows direct live imaging to analyze presynaptic mechanisms of nicotinic acetylcholine receptors (nAChRs) mediated synaptic transmission. This preparation also provides an informative approach to study the pre- and post-synaptic mechanisms of synaptic plasticity.

Immagini dal vivo di nicotina indotta segnalazione Calcio e neurotrasmettitori uscita Lungo ventrali Hippocampal assoni

Sustained enhancement of axonal signaling and increased neurotransmitter release by the activation of pre-synaptic nicotinic acetylcholine receptors ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Registrazione di plasticità sinaptica in fettine ippocampali Acute mantenuti in un piccolo volume riciclaggio - aspersione- e sistema di immersione-tipo camera

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

In Vivo Singola molecola Tracking al terminale presinaptico nervo motore Drosophila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Single Synapse Indicators of Glutamate Release and Uptake in Acute Brain Slices from Normal and Huntington Mice

Synapses are highly compartmentalized functional units that operate independently on each other. In Huntington&#39;s disease (HD) and other neurodegenerative disorders, this independence might be compromised due to insufficient glutamate clearance and the resulting spill-in and spill-out effects. Altered astrocytic coverage of the presynaptic terminals and/or dendritic spines as well as a reduced size of glutamate transporter clusters at glutamate release sites have been implicated in the pathogenesis of diseases resulting in symptoms of dys-/hyperkinesia. However, the mechanisms leading to the dysfunction of glutamatergic synapses in HD are not well understood. Improving and applying synapse imaging we have obtained data shedding new light on the mechanisms impeding the initiation of movements. Here, we describe the principle elements of a relatively inexpensive approach to achieve single synapse resolution by using the new genetically encoded ultrafast glutamate sensor iGluu, wide-field optics, a scientific CMOS (sCMOS) camera, a 473 nm laser and a laser positioning system to evaluate the state of corticostriatal synapses in acute slices from age appropriate healthy or diseased mice. Glutamate transients were constructed from single or multiple pixels to obtain estimates of i) glutamate release based on the maximal elevation of the glutamate concentration [Glu] next to the active zone and ii) glutamate uptake as reflected in the time constant of decay (TauD) of the perisynaptic [Glu]. Differences in the resting bouton size and contrasting patterns of short-term plasticity served as criteria for the identification of corticostriatal terminals as belonging to the intratelencephalic (IT) or the pyramidal tract (PT) pathway. Using these methods, we discovered that in symptomatic HD mice ~40% of PT-type corticostriatal synapses exhibited insufficient glutamate clearance, suggesting that these synapses might be at risk to excitotoxic damage. The results underline the usefulness of TauD as a biomarker of dysfunctional synapses in Huntington mice with a hypokinetic phenotype.

We present a protocol to evaluate the balance between glutamate release and clearance at single corticostriatal glutamatergic synapses in acute slices from adult mice. This protocol uses the fluorescent sensor iGluu for glutamate detection, a sCMOS camera for signal acquisition and a device for focal laser illumination.