<p class="jove_content"> Questa ricerca è stata sostenuta da una sovvenzione Facoltà Nuovo dal Consiglio di Facoltà borsa di studio alla Western Kentucky University. </p>

<p class="jove_title"> 1. Finger-Stick prelievo di sangue </p><ol><li> Raccolta di sangue intero è di solito presi a riposo per una misura di base (di solito dopo 10-15 resto seduto min), durante o immediatamente dopo un attacco di esercizio, e per tutto il periodo post-esercizio (in genere da 1-3 ore dopo la cessazione del esercizio fisico). </li><li> Utilizzando le precauzioni universali, in primo luogo sterilizzare la punta del dito con il 70% di alcool isopropilico. </li><li> Successivamente, la puntura il sito utilizzando un bisturi automatici o dispositivi simili. Anche se si usa un 30-gauge bisturi per offrire il comfort soggetto, un ago di diametro più ampio potrebbero essere utilizzati. </li><li> Eliminare la prima goccia di sangue, e poi raccogliere in provette di sangue capillare o microvettes trattati con litio eparina per prevenire la coagulazione. </li></ol><p class="jove_title"> 2. Fenotipizzazione delle cellule e colorazione apoptosi </p><ol><li> Aggiungere 10 microlitri di sangue intero eparinizzato al pannello di anticorpi titolati in 250 microlitri di buffer vincolanti (vedi tabella 1 schema). Abbiamo usato un fattore di diluizione 1:20 con successo, ma ogni laboratorio dovrebbe titolo i loro reagenti per determinare la migliore soluzione di lavoro. <br /> <strong>Tabella 1.</strong> Pannello di anticorpi per la determinazione di esercizio apoptosi indotta in sottoinsiemi dei leucociti. Apoptosi precoce è stato definito mediante l&#39;espressione di annessina V, mentre l&#39;apoptosi in ritardo è stato definito con un doppio etichettatura positiva con annessina V e 7-AAD. Le cellule necrotiche erano annessina V e 7-AAD + solo le celle. <br /><table border="1"><tbody><tr><td> Provetta 1 </td><td> Provetta 2 </td><td> Tubo 3 </td><td> Tubo 4 </td></tr><tr><td> Solo le cellule del tubo </td><td> Annessina V - FITC </td><td> Annessina V - FITC </td><td> Annessina V - FITC <strong></strong></td></tr><tr><td></td><td> Anti CD4 umano - PE </td><td> Anti umane CD8 - PE </td><td> Anti umani CD19 - PE </td></tr><tr><td></td><td> 7-AAD </td><td> 7-AAD </td><td> 7-AAD </td></tr><tr><td></td><td> Anti umani CD45RA - APC </td><td> Anti umani CD45RA - APC </td><td></td></tr></tbody></table><br /> 7-AAD = 7-amino-actinomicina D, APC = Allophycocyanin, CD4 = linfociti T helper, CD8 = soppressore / linfociti T citotossici, i linfociti B CD19 =, CD45RA = sottopopolazioni cellulari ingenuo, FITC = isotiocianato di fluorescina, PE = ficoeritrina. </li><li> Incubare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti. </li><li> Centrifugare a 1075 xg per 5-10 minuti. </li><li> Decantare, aggiungere 300 ul Red Cell Lysis Buffer sangue, e completamente vortice. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti. </li><li> Aggiungere 300 ml di PBS per fermare la reazione di lisi. </li><li> Centrifugare a 1075 xg per 5-10 minuti. </li><li> Decantare, rack, e aggiungere 50 microlitri di buffer vincolanti. </li><li> Analizzare mediante citometria di flusso. </li></ol><p class="jove_content"> Si raccomanda, come minimo, i seguenti controlli da utilizzare: un solo tubo di cellule per servire come controllo negativo nel rilevare autofluorescenza sfondo, e le provette contenenti ciascuno fluorocromo per impostare compensazione durante l&#39;impostazione iniziale della citometria a flusso. Inoltre, abbiamo utilizzato perline standard di compensazione con successo per creare i nostri esperimenti. </p>

<ol>
	<li>Simpson, R. J., Florida-James, G. D., Whyte, G. P., Black, J. R., Ross, J. A., Guy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apoptosis+does+not+contribute+to+the+blood+lymphocytopenia+observed+after+intensive+and+downhill+treadmill+running+in+humans.">Apoptosis does not contribute to the blood lymphocytopenia observed after intensive and downhill treadmill running in humans.</a> <em style='font-style: italic'>Res. Sports Med</em>. <b>15</b>, 157-174 (2007).</li><li>Steensberg, A., Morrow, J., Toft, A. D., Bruunsgaard, H., Pedersen, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+exercise,+lymphocyte+apoptosis+and+F2-isoprostanes.">Prolonged exercise, lymphocyte apoptosis and F2-isoprostanes.</a> <em style='font-style: italic'>Eur. J. Appl. Physiol</em>. <b>87</b>, 38-42 (2002).</li><li>Mooren, F. C., Bloming, D., Lechtermann, A., Lerch, M. M., V&#246;lker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+apoptosis+after+exhaustive+and+moderate+exercise.">Lymphocyte apoptosis after exhaustive and moderate exercise.</a> <em style='font-style: italic'>J. Appl. Physiol</em>. <b>93</b>, 147-153 (2002).</li><li>Peters, E. M., Eden, M. V. a. n., Tyler, N., Ramautar, A., Chutergoon, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prolonged+exercise+does+not+cause+lymphocyte+DNA+damage+or+increased+apoptosis+in+well-trained+endurance+athletes.">Prolonged exercise does not cause lymphocyte DNA damage or increased apoptosis in well-trained endurance athletes.</a> <em style='font-style: italic'>Eur. J. Appl. Physiol</em>. <b>98</b>, 124-131 (2006).</li><li>Wang, J. -. S., Huang, Y. -. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+exercise+intensity+on+lymphocyte+apoptosis+induced+by+oxidative+stress+in+men.">Effects of exercise intensity on lymphocyte apoptosis induced by oxidative stress in men.</a> <em style='font-style: italic'>Eur. J. Appl. Physiol</em>. <b>95</b>, 290-291 (2005).</li><li>Mooren, F. C., Lechtermann, A., V&#246;lker, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exercise-induced+apoptosis+of+lymphocytes+depends+on+training+status.">Exercise-induced apoptosis of lymphocytes depends on training status.</a> <em style='font-style: italic'>Med. Sci. Sports Exerc</em>. <b>36</b>, 1476-1483 (2004).</li><li>Navalta, J. W., Sedlock, D. A., Park, K. -. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+treatment+influences+the+yield+of+apoptotic+lymphocytes+after+maximal+exercise.">Blood treatment influences the yield of apoptotic lymphocytes after maximal exercise.</a> <em style='font-style: italic'>Med. Sci. Sports Exerc</em>. <b>37</b>, 369-373 (2005).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

<p class="jove_content"> Un mini-invasiva procedura di raccolta dei campioni e successiva analisi è dimostrato per l&#39;analisi delle fasi sia precoce e tardiva di esercizio apoptosi indotta da linfociti. E &#39;anche possibile escludere con chiarezza quelle cellule, che sono necrotico, e non apoptotica. Questa procedura risolve gli inconvenienti ed il disagio associato a venipuntura invasiva della regione antecubitale in momenti diversi, prima, durante e immediatamente dopo l&#39;esercizio o attribuisce un catetere per tutta la durata della ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Flow Cytometry Binding Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>eBioscience</td>
<td>00-4222-26</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RBC Lysis Buffer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>eBioscience</td>
<td>00-4333-57</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lancet Device</td>
<td>Accu Check Soft Touch</td>
<td>Roche Diagnostics Corp.</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary tubes</td>
<td>Heparinized Capillary Tubes</td>
<td>Chase Scientific Glass, Inc.</td>
<td>501</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Centrifuge</td>
<td>GmC Lab</td>
<td>Gilson</td>
<td>PMS-880</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Annexin V-FITC Conjugated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biovision Inc.</td>
<td>K201-400-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD4-PE Conjugated</td>
<td>Anti-human, clone RPA-T4</td>
<td>eBioscience</td>
<td>12-0049-42</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD8-PE Conjugated</td>
<td>Anti-human, clone OKT8</td>
<td>eBioscience</td>
<td>12-0086-73</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD19-PE Conjugated</td>
<td>Anti-human, clone HIB19</td>
<td>eBioscience</td>
<td>12-0199-42</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>7-AAD Viability Staining Solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>eBioscience</td>
<td>00-6993-50</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CD45RA-APC Conjugated</td>
<td>Anti-human, clone HI100</td>
<td>eBioscience</td>
<td>17-0458-42</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Flow cytometer</td>
<td>C6</td>
<td>Accuri</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

finger-stick blood sampling methodology for the determination of exercise-induced lymphocyte apoptosis

<p class="jove_content"> L&#39;esercizio fisico è uno stimolo fisiologico in grado di indurre l&#39;apoptosi nelle cellule del sistema immunitario. Ad oggi, diverse limitazioni sono state identificate con la misura di questo fenomeno, in particolare relativi alla quantità di tempo necessaria per isolare e trattare un campione di sangue prima della valutazione della morte cellulare. A causa di questo, è difficile stabilire se un aumento segnalato in apoptosi delle cellule immunitarie possono essere contribuito l&#39;effetto reale di esercizio del sistema, o un riflesso del tempo e di elaborazione necessaria per ottenere alla fine questa misura. In questo articolo si dimostra una procedura rapida e mini-invasiva per l&#39;analisi di esercizio apoptosi indotta da linfociti. A differenza di altre tecniche, il sangue intero viene aggiunto a un pannello di anticorpi immediatamente dopo l&#39;ottenimento di un campione. Dopo il periodo di incubazione, i globuli rossi vengono lisati ed i campioni sono pronti per essere analizzati. L&#39;uso di un dito-stick procedura di campionamento riduce il volume di sangue richiesto, e riduce al minimo il disagio ai soggetti. </p>

Watch this Scientific Journal Video about Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis at JoVE.com

Finger-stick Blood Sampling Methodology for the Determination of Exercise-induced Lymphocyte Apoptosis

<p class="jove_content">L&#39;esercizio fisico è in grado di indurre l&#39;apoptosi nelle cellule del sistema immunitario. Ci sono limitazioni concernenti le misure varie, in particolare relativi alla quantità di tempo necessaria per isolare e trattare un campione di sangue prima della valutazione. È dimostrata una procedura rapida e mini-invasiva per l&#39;analisi di esercizio apoptosi indotta da linfociti.</p>

Finger-stick Metodologia di campionamento del sangue per la determinazione di esercizio apoptosi indotta da linfociti

Exercise is a physiological stimulus capable of inducing apoptosis in immune cells. To date, various limitations have been identified with the measurement ...

finger-stick-blood-sampling-methodology-for-determination-exercise

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.1K Views.  Western Kentucky University. L'esercizio fisico è in grado di indurre l'apoptosi nelle cellule del sistema immunitario. Ci sono limitazioni concernenti le misure varie, in particolare relativi alla quantità di tempo necessaria per isolare e trattare un campione di sangue prima della valutazione. È dimostrata una procedura rapida e mini-invasiva per l'analisi di esercizio apoptosi indotta da linfociti.