Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R01 GM56244 di ANI, che comprende fondi erogati attraverso il Recovery and Reinvestment Act del 2009, e dal NIH R01 GM87130 a JARP

1. Isolamento di embrioni Nota: tutte le operazioni che coinvolgono i topi devono essere eseguite conformemente alla cura degli animali appropriati e politiche di utilizzo e protocolli <ol><li> Verificare la presenza di una spina di accoppiamento nel topo femmina la mattina dopo l&#39;accoppiamento e separare le femmine accoppiate dalla stalloni mettendoli in una gabbia diversa. Mezzogiorno del giorno che la spina di accoppiamento è osservato è considerato giorno embrionale 0,5 (E0.5) dello sviluppo. </li><li> A E8.5, (o la fase desiderata, se diversa), il sacrificio il mouse utilizzando un protocollo approvato. </li><li> Bagnare il ventre dell&#39;animale eutanasia con il 70% di etanolo e aprire la cavità addominale. I siti di impianto che indica la presenza di embrioni di sviluppo sono viste come un &quot;grani di un rosario&quot; sistemazione lungo la lunghezza di ogni corno uterino (figura 1A). Utilizzando le forbici, rimuovere entrambi i corni uterini, tagliare ogni sito a separare l&#39;impianto individualmente (Figura 1B) e metterli in un piatto da mm 100 petri contenenti temperatura ambiente (RT) dissezione medio (DMEM, 10% di siero fetale bovino, 20 mM pH 7,4 HEPES , 60 mg / ml di penicillina, 2 mM streptomicina). </li><li> Utilizzando pinze, rimuovere ogni embrione e membrane che circondano dal tessuto uterino (figura 1C) e metterli in media dissezione fresco. </li><li> Isolare gli embrioni individuale sotto un microscopio da dissezione con pinze. In questa fase di sviluppo, gli embrioni sono circondati dalla parietale sacco vitellino, che contatti il ​​tessuto deciduum, il viscerale sacco vitellino e il sacco amniotico. L&#39;amnios è una membrana trasparente che è in diretto contatto con l&#39;embrione. Il viscerale sacco vitellino si trova tra l&#39;amnios e il sacco vitellino parietale ed è facilmente distinguibili in E8.5-E9.5 embrioni per la presenza di vasi sanguigni importanti che alimentano l&#39;embrione. Rimuovere ciascun embrione dalla sua membrane che circondano e trasferire singolarmente in una nuova piastra contenente i media dissezione per rimuovere il sangue in eccesso. La fase di sviluppo può variare da embrione a dell&#39;embrione e tra cucciolate; rappresentante E8.5 embrioni e un embrione rappresentante E9.5 sono mostrati in Figura 1D. </li><li> Trasferimento di ogni embrione in una provetta eppendorf da 1,5 ml contenente 200 ml di dissezione dei media (come descritto al punto 4). </li></ol> 2. Omogeneizzazione dei Embryo isolati <ol><li> Aggiungere 20 unità di Collagenasi di tipo II in un volume di 200 ul (diluito in fosfato 1X Dubbecco di Buffered Saline; DPBS) ad ogni provetta Eppendorf. </li><li> Scuotere campioni a 37 ° C shaker a 100 rpm per 20 min. </li><li> Risospendere bene pipettando di interrompere grumi di cellule. </li><li> Applicare la sospensione cellulare sulla parte superiore della cella di filtro sterile (40 maglie micron) posto sopra un tubo eppendorf da 1,5 ml. </li><li> Applicare immediatamente 600 ml di temperatura ambiente 1X DPBS sulla parte superiore della cella di filtro per completare la separazione. Gettare il filtro. </li><li> Centrifugare i campioni a 4 ° C a 4000 xg per 5 min. </li><li> Scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet in 1 ml di RT DPBS 1X. </li><li> Centrifugare i campioni a 4000 xg per 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Scartare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet in 200 ml di mezzi dissezione RT. </li><li> Contare le cellule embrionali. C&#39;è una media 3-5 x 10 6 cells/E8.5 embrione. </li></ol> 3. Cross-link cromatina <ol><li> Aggiungere 5,6 ml di formaldeide al 37% al 200 campioni microlitri per una concentrazione finale di 1% di formaldeide. </li><li> Incubare i campioni per 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Centrifugare i campioni a 4 ° C a 4000 xg per 3 min. </li><li> Scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule con il freddo 1X DPBS contenente 80 microlitri / ml di cocktail di inibitori della proteasi (PIC). </li><li> Centrifugare i campioni a 4 ° C a 4000 xg per 3 min. </li><li> Scartare il surnatante. A questo punto, i campioni possono essere congelati a -80 ° C. Il congelati, i campioni reticolati sono stabili per diversi mesi. </li></ol> 4. Sonicazione <ol><li> Risospendere il pellet di cellule in 100 ml di buffer di lisi RT SDS (50 mM Tris-HCl (pH 8.1), 10 mM EDTA e 1% SDS con PIC appena aggiunto 1 ml PIC/800 microlitri di volume totale). Quando risospeso, aggiungere ulteriori 100 ul di tampone RT lisi SDS per promuovere la risospensione. Mescolare bene pipettando e inversione. </li><li> Incubare la sospensione cellulare in ghiaccio per 10 min. </li><li> Sonicare cellule lisate al DNA di taglio compreso tra 200 e 500 paia di basi con un Bioruptor Diagenode ™ UCD200 (5 min x 8 volte: impostazione di ampiezza di 30 sec on/30 sec off in alto (320 watt) di potenza). I campioni devono essere circondato da un impasto di ghiaccio. Non lasciare che i campioni di caldo sopra i 4 ° C o congelare. Ci sono molti tipi di sonicatori disponibili. Condizioni di sonicazione deve essere ottimizzata per ogni sonicatore comportare taglio del reticolato del DNA per una lunghezza di circa 500 bp. </li><li> Centrifugare i campioni sonicato a 4 ° C a 14000 xg per 10 min. </li><li> Transfer il supernatante in una nuova provetta eppendorf pre-raffreddata in ghiaccio. </li><li> Suddividere il campione sonicato in un massimo di 5 aliquote. Abbiamo empiricamente determinato che si E8.5 embrione può essere suddiviso in 5 aliquote. Campioni di dimensioni più piccole o più grandi possono essere ripartita in proporzione. A questo punto, il campione può essere conservato a -80 ° C fino all&#39;utilizzo ulteriormente. </li><li> Riservare una aliquota per l&#39;utilizzo come input e conservare a -20 ° C fino al punto 6, quando il cross-link sarà invertito. Diluire le aliquote altre 10 volte in tampone di diluizione ChIP (16,7 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1,2 mM EDTA, 1.1% Triton X-100, 167 mM NaCl e 0,01% SDS) contenente PIC appena aggiunta a 1 μl/800 microlitri di buffer. </li></ol> 5. Pre-clearing e Immunoprecipitazione <ol><li> Pre-clear il surnatante diluito con 75 ml di sperma di salmone-DNA / proteina A o G liquami agarosio-50% a 4 ° C, con rotazione, per 1 ora. L&#39;uso di proteine ​​sia A o perline G proteine ​​deve essere determinato dal anticorpi da utilizzare per il chip. Per esempio, la proteina A perline sono raccomandati per gli anticorpi di coniglio, mentre le proteine ​​G perle sono raccomandati per gli anticorpi di capra o il mouse anticorpi IgG 1. Per informazioni più dettagliate, vedere le raccomandazioni formulate dal produttore tallone. </li><li> Centrifugare a 4 ° C a 2500 xg per 1 min. </li><li> Trasferire il supernatante in una nuova, pre-raffreddata provetta Eppendorf. </li><li> Aggiungi anticorpi (4 mg / campione) per la pre-cancellati aliquota e incubare una notte a 4 ° C con rotazione. </li></ol> 6. Lavaggio della cromatina-proteina-tallone Complex <ol><li> Aggiungere 60 ml di sperma di salmone DNA / proteina A o G agarosio liquame in ciascuna provetta ed incubare a 4 ° C con rotazione per 1 ora. Utilizzare lo stesso tipo perlina utilizzato per il pre-clearing al punto 3. </li><li> Centrifugare a 4 ° C a 1000 xg per 1 min. </li><li> Rimuovere con cura il supernatante ed eliminarlo. Tenere il DNA-proteina-tallone complesso sul ghiaccio. </li><li> Risospendere e lavare il pellet come indicato di seguito con tamponi di lavaggio 1, 2, 3 e 4. Lavare 1-3 buffer, vengono refrigerate a 4 ° C e si lava con questi tamponi devono essere eseguiti a 4 ° C. Tampone di lavaggio 4 dovrebbe essere a temperatura ambiente e si lava con questo buffer deve essere eseguita a temperatura ambiente. Ogni lavaggio è di 5 minuti con rotazione alla temperatura appropriata. Dopo ogni lavaggio centrifuga, a 4 ° C (temperatura ambiente per tampone di lavaggio 4 lavaggi) a 1000 xg per 1 minuto, poi accuratamente aspirare o rimuovere il surnatante. </li></ol> Tampone 1: Bassa tampone di lavaggio di sale (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl e 0,1% SDS), 1 ml x 2 lavaggi. Buffer di 2: High tampone di lavaggio di sale (20 mM Tris-HCl (pH 8,1), 2 mM EDTA, 1% Triton X-100, 500 mM NaCl e 0,1% SDS), 1 ml x 2 lavaggi. Tampone 3: buffer sale lavare LiCl (10 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM EDTA, 1% IGEPAL-CA630, 0,25 M LiCl e acido desossicolico 1% (sale sodico)), 1 ml x 1 lavaggio. Buffer 4: tampone TE (10 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 mM EDTA), 1 ml x 2 lavaggi. 7. Eluizione della cromatina-anticorpo <ol><li> Risospendere il lavato cromatina-proteina-tallone complesso in 250 ml di tampone di eluizione appena preparati (1% SDS, 0,1 M NaHCO 3). Vigorosamente vortice il campione per 5 secondi, poi incubare a RT per 15 minuti con rotazione. </li><li> Centrifugare a 2500 xg per 1 minuto a temperatura ambiente e trasferire l&#39;eluato in un nuovo tubo eppendorf. </li><li> Ripetere i passaggi 1 e 2 e combinare i eluati nella stessa provetta Eppendorf. Il eluati deve essere conservato a temperatura ambiente. Al termine di questa fase, gli eluati possono essere conservati a -20 ° C fino a quando un ulteriore uso. </li></ol> 8. Reverse Cross-link e Recupero del DNA <ol><li> Aggiungere 20 l 5 M NaCl per 500 eluato microlitri (40 microlitri / ml per il controllo di input). </li><li> Riscaldare il eluati a 65 ° C in un bagno d&#39;acqua per 4 ore a notte. </li><li> 10 ml di ciascun campione (compreso il controllo di ingresso) può essere eseguito su un gel di agarosio al 2% accanto alla segnataglie spanning 0,1-1 kbp per verificare la dimensione del frammento di DNA. Il DNA apparirà come uno striscio e non un gruppo forte. Il resto dei campioni può essere lasciato a 65 ° C mentre il gel è in esecuzione. </li><li> Recuperare il DNA di ogni campione con un QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Aggiungere 600 microlitri di buffer QG (fornito nel kit) per ottimizzare l&#39;assorbimento del DNA con la membrana di silice in una colonna di spin QIAquick e 200 ul isopropanolo in un campione di 500 microlitri. Si noti che di buffer QG contiene un indicatore di pH che permette una facile determinazione del pH del campione. Se il colore del campione si trasforma dal giallo al viola (pH&gt; 7,5) dopo la miscelazione, aggiungere 10 ml di NaAcetate 3 M (pH 5.2) al campione e mescolare. Questo riduce il pH della miscela di massimizzare il DNA legame con le perline nella colonna. </li><li> Prima di caricare la colonna, controllare la miscela per stabilire se l&#39;eventuale precipitato SDS è presente. Se SDS precipitazioni si è verificato, il campione deve essere portata in un42 ° C bagnomaria fino a quando il precipitato scompare. </li><li> Carico di 700 l di miscela nella colonna di spin QIAquick (colonna viola nel kit) e centrifugare a RT a 14000 xg per 1 min. Gettare il flusso attraverso dalla colonna prima di procedere e ripetere l&#39;operazione con il resto del campione. </li><li> Aggiungere 500 microlitri di buffer QG per lavare la colonna. Centrifugare a RT a 14000 xg per 2 minuti. Gettare il flusso attraverso dalla colonna prima di procedere. </li><li> Lavare la colonna con 700 ml di PE tampone di lavaggio (in dotazione nel kit) a cui l&#39;etanolo è stato aggiunto secondo le istruzioni del produttore. Centrifugare a RT a 14000 xg per 1 min. Gettare il flusso attraverso dalla colonna prima di procedere. </li><li> Ripetere la fase di centrifugazione per rimuovere completamente la parte restante del buffer PE dalla colonna. Gettare il flusso attraverso il tubo e la raccolta. </li><li> DNA eluire dalla colonna in una nuova provetta eppendorf con l&#39;aggiunta di 60 microlitri di buffer EB (tampone di eluizione fornito nel kit). </li><li> Centrifugare a temperatura ambiente a 14000 xg per 1 min. Il DNA eluito può essere conservata a -20 ° C fino rilevamento. A 260 letture del materiale recuperato indicano in genere le concentrazioni di 90-120 ng / ul, per un recupero totale di circa 6-7 ug per aliquota. Tuttavia, la A 260/280 rapporto di questi campioni è tipicamente&gt; 1,8, il che suggerisce che l&#39;RNA è presente nel campione. Pertanto, l&#39;importo esatto di DNA recuperato può essere inferiore. </li></ol> 9. Analisi del DNA recuperato <ol><li> SDS possono interferire con l&#39;attività della polimerasi PCR Taq. SDS deve essere rimosso completamente prima di eseguire PCR. Incubare il DNA in ghiaccio per far precipitare ogni residuo SDS e centrifugare a 4 ° C a 14000 xg per 1 min. Trasferire il supernatante in una nuova fase eppendorf tube.This è fortemente raccomandato. </li><li> Il eluati DNA può essere rilevato sia convenzionale PCR quantitativa o real-time PCR (Q-PCR) con primer specifici per ogni sequenza da analizzare. Microlitri 5-10 eluato DNA totale può essere utilizzato per una PCR o Q-PCR reazione. PCR con il controllo di input possono essere effettuate con una diluizione del 5-10 volte del DNA rispetto alla quantità di altri campioni. PCR e Q-PCR condizioni variano, tuttavia, la quantità limitata di materiale di partenza richiede ulteriori cicli di PCR. Per convenzionale PCR, si consiglia di partire con 40 cicli e regolando, se necessario. </li></ol> 10. Rappresentante Risultati Abbiamo usato questo protocollo per eseguire ChIP sia da embrioni E8.5 e E9.5 (Figura 2). I risultati dimostrano che miogenina è presente sul promotore miogenina in E8.5 ed embrioni E9.5. ChIP DNA purificati sono stati analizzati mediante PCR convenzionale (Figura 2A) e quantitativa real-time PCR (Figura 2B). Al contrario, non vi era alcuna indicazione di miogenina legame al promotore miogenina nel sacco vitellino, dove miogenina non si esprime. L&#39;interferone-γ (IFNγ) promotore, che contiene le sequenze corrispondenti nel sito miogenina vincolante, è stato utilizzato come controllo sequenza negativa. Come previsto, miogenina non era legato al promotore IFNγ in nessuno dei campioni di tessuto testato. In E8.5 e 9,5 embrioni, miogenina è specificamente indicato nella somiti (Figura 3, 6,10), che sono i precursori del muscolo scheletrico. Così i risultati indicano che miogenina è legato al promotore miogenina nei metameri nella E8.5 e E9.5. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. E8.5 dissezione dell&#39;embrione. (A) Isolato corno uterino (pannello superiore, maggiore ingrandimento mostrato nel riquadro inferiore). (B) uterino corno tagliato con le forbici per separare i singoli siti di impianto degli embrioni contenenti individuali. (C) Gli embrioni che sporge dal tessuto uterino durante la dissezione. Frecce marchio embrioni ancora coperto da tessuti extra-embrionali. (D) Due E8.5 embrioni della stessa cucciolata. L&#39;embrione di sinistra non ha iniziato il processo di trasformazione. L&#39;embrione a destra è in fase di svolta. Estrema destra - rappresentante degli embrioni E9.5. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Test ChIP dimostrando miogenina vincolante per il promotore miogenina in E8.5 ed embrioni E9.5. (Top) analisi PCR convenzionale su 5 ul di DNA purificato da esperimenti di ChIP utilizzando un anticorpo miogenina o non-specifici IgG è stata eseguita con primers che amplificano una parte del promotore miogenina da -79 a 69 rispetto al sito di inizio della trascrizione che contiene un sito miogenina vincolante trova a -12 o primer che amplificano una parte del promotore IFNγ che contiene una sequenza corrispondente al sito miogenina legame situato ~ 1075 bp a monte del sito di inizio della trascrizione. Le sequenze IFNγ Primer utilizzati sono stati 5&#39;-GCT GAC TCA AGA CCC CGA GGC-3 &#39;e 5&#39;-GGA TGA TGG GGC AGG AGG CC-3&#39;. (In basso) quantitativa in tempo reale analisi PCR dei campioni stessi utilizzati (A). Ili dati sono rappresentati come% di ingresso + / - deviazione standard. <img src="/files/ftp_upload/2677/2677fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Myogenin è specificamente indicato nella somiti di E8.5 e E9.5 embrioni. Montare tutto ibridazione in situ di miogenina mostra specifica espressione di mRNA in somiti. Bar dimensioni in E8.5 immagine - 200 micron. Bar dimensioni in E9.5 immagine - 500 micron.

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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+of+the+myogenin+basic+region+identifies+an+ancient+protein+motif+critical+for+activation+of+myogenesis.">Mutagenesis of the myogenin basic region identifies an ancient protein motif critical for activation of myogenesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88, 5675-5679 (1991).</li><li>Lassar, A. B., Davis, R. L., Wright, W. E., Kadesch, T., Murre, C., Voronova, A., Baltimore, D., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+activity+of+myogenic+HLH+proteins+requires+hetero-oligomerization+with+E12/E47-like+proteins+in+vivo.">Functional activity of myogenic HLH proteins requires hetero-oligomerization with E12/E47-like proteins in vivo.</a> Cell. 66, 305-315 (1991).</li><li>Chakraborty, T., Brennan, T. J., Li, L., Edmondson, D., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inefficient+homooligomerization+contributes+to+the+dependence+of+myogenin+on+E2A+products+for+efficient+DNA+binding.">Inefficient homooligomerization contributes to the dependence of myogenin on E2A products for efficient DNA binding.</a> Mol Cell Biol. 11, 3633-3641 (1991).</li><li>Cserjesi, P., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+induces+the+myocyte-specific+enhancer+binding+factor+MEF-2+independently+of+other+muscle-specific+gene+products.">Myogenin induces the myocyte-specific enhancer binding factor MEF-2 independently of other muscle-specific gene products.</a> Mol Cell Biol. 11, 4854-4862 (1991).</li><li>Braun, T., Arnold, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+four+human+muscle+regulatory+helix-loop-helix+proteins+Myf3-Myf6+exhibit+similar+hetero-dimerization+and+DNA+binding+properties.">The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties.</a> Nucleic Acids Res. 19, 5645-5651 (1991).</li><li>Serna, d. e. l. a., L, I., Ohkawa, Y., Berkes, C. A., Bergstrom, D. A., Dacwag, C. S., Tapscott, S. J., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MyoD+targets+chromatin+remodeling+complexes+to+the+myogenin+locus+prior+to+forming+a+stable+DNA-bound+complex.">MyoD targets chromatin remodeling complexes to the myogenin locus prior to forming a stable DNA-bound complex.</a> Mol Cell Biol. 25, 3997-4009 (2005).</li><li>Blais, A., Tsikitis, M., Acosta-Alvear, D., Sharan, R., Kluger, Y., Dynlacht, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+initial+blueprint+for+myogenic+differentiation.">An initial blueprint for myogenic differentiation.</a> Genes Dev. 19, 553-569 (2005).</li><li>Cao, Y., Kumar, R. M., Penn, B. H., Berkes, C. A., Kooperberg, C., Boyer, L. A., Young, R. A., Tapscott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+gene-specific+analyses+show+distinct+roles+for+Myod+and+Myog+at+a+common+set+of+promoters.">Global and gene-specific analyses show distinct roles for Myod and Myog at a common set of promoters.</a> EMBO J. 25, 502-511 (2006).</li><li>Ohkawa, Y., Yoshimura, S., Higashi, C., Marfella, C. G., Dacwag, C. S., Tachibana, T., Imbalzano, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myogenin+and+the+SWI/SNF+ATPase+Brg1+maintain+myogenic+gene+expression+at+different+stages+of+skeletal+myogenesis.">Myogenin and the SWI/SNF ATPase Brg1 maintain myogenic gene expression at different stages of skeletal myogenesis.</a> J Biol Chem. 282, 6564-6570 (2007).</li><li>Davie, J. K., Cho, J. H., Meadows, E., Flynn, J. M., Knapp, J. R., Klein, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+gene+selectivity+of+the+myogenic+basic+helix-loop-helix+transcription+factor+myogenin+in+embryonic+muscle.">Target gene selectivity of the myogenic basic helix-loop-helix transcription factor myogenin in embryonic muscle.</a> Dev Biol. 311, 650-664 (2007).</li><li>Metivier, R., Penot, G., Hubner, M. R., Reid, G., Brand, H., Kos, M., Gannon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor-alpha+directs+ordered,+cyclical,+and+combinatorial+recruitment+of+cofactors+on+a+natural+target+promoter.">Estrogen receptor-alpha directs ordered, cyclical, and combinatorial recruitment of cofactors on a natural target promoter.</a> Cell. 115, 751-763 (2003).</li><li>Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Current Protocols in Molecular Biology. , (2010).</li></ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla University of Massachusetts Medical School IACUC.

Nel protocollo ChIP descritto, ci mostrano che la miogenina regolatore miogenico è associato con il promotore miogenina nel tessuto muscolare scheletrico precursore presenti nel singolo E8.5 ed embrioni E9.5. Precedenti studi hanno ampiamente caratterizzato miogenina vincolante alla casella E contenenti sequenze, a partire dalla iniziale esperimenti in vitro spostamento gel utilizzando in vitro tradotto o batteri prodotto DNA radiomarcato miogenina e codifica la quota di competenza di sequenze geniche...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>ChIP Assay Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Upstate Cell Signaling Solutions, Millipore</td>
<td>17-295</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Collagenase Type II</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>17101015</td>
<td>Dilution by 1 x PBS</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s modified eagle medium (DMEM) </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>12100-061</td>
<td>High glucose content</td>
</tr>
<tr>
<td>Dulbecco&#x2019;s phosphate buffered saline 1X (DPBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>14190-144</td>
<td>Calcium chloride free, Magnesium chloride free</td>
</tr>
<tr>
<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mediatech, Inc.</td>
<td>35-010-CV</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Gel extraction kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QIAquick</td>
<td>28704</td>
<td>50 reaction kit</td>
</tr>
<tr>
<td>Penicillin/streptomycin stock solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Gibco Labs, Invitrogen</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>5000 &mu;g/ml concentration</td>
</tr>
<tr>
<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>P8340</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Salmon sperm DNA /Protein A agarose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>16-157</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>myogenin antibody</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td>
<td>sc-576</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Normal rabbit IgG</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>12-370</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Platinum PCR Supermix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11306-016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GoTaq Q-PCR master mix</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Promega</td>
<td>A6001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chromatin immunoprecipitation assay for tissue-specific genes using early-stage mouse embryos

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) è un potente strumento per identificare le proteine: interazioni della cromatina che avvengono nel contesto delle cellule viventi 1-3. Questa tecnica è stata ampiamente sfruttato nelle cellule colture di tessuti, e in misura minore, nel tessuto primario. L&#39;applicazione di ChIP al tessuto embrionale di roditori, soprattutto nei momenti iniziali dello sviluppo, è complicata dalla limitata quantità di tessuto e l&#39;eterogeneità dei tipi di cellule e tessuti nell&#39;embrione. Qui vi presentiamo un metodo per eseguire ChIP con una giornata dissociata embrionale 8,5 (E8.5) degli embrioni. Cromatina tosata da un unico embrione E8.5 possono essere suddivisi in fino a cinque aliquote, che permette di materiale sufficiente l&#39;investigatore per i controlli e per lo studio di proteine ​​specifiche: le interazioni della cromatina. Abbiamo utilizzato questa tecnica per iniziare a documentare proteine: interazioni della cromatina durante la specificazione dei programmi di geni tessuto-specifica espressione. L&#39;eterogeneità dei tipi di cellule in un embrione limita necessariamente l&#39;applicazione di questa tecnica perché il risultato è l&#39;individuazione di proteine: interazioni della cromatina senza distinguere se le interazioni avvengono in tutto, un sottoinsieme di, o un tipo di cellula (s). Tuttavia, l&#39;esame dei geni tessuto-specifici durante o dopo la comparsa di tessuto-specifica dell&#39;espressione genica è fattibile per due motivi. In primo luogo, immunoprecipitazione di fattori specifici del tessuto isola necessariamente cromatina dal tipo di cellula in cui si esprime il fattore. In secondo luogo, immunoprecipitazione di coattivatori e istoni contenente modificazioni post-traduzionali che sono associati con l&#39;attivazione del gene deve essere trovata solo a geni e sequenze regolatrici del tipo di cellula in cui il gene è o è stato attivato. La tecnica dovrebbe essere applicabile allo studio degli eventi più geni tessuto-specifici di attivazione. Nell&#39;esempio descritto di seguito, abbiamo utilizzato embrioni di topo E8.5 e E9.5 per esaminare fattore vincolante ad un muscolo scheletrico promotore del gene specifico. Somiti, che sono i tessuti precursore da cui i muscoli scheletrici del tronco e degli arti si formano, sono presenti E8.5-9.5 4,5. Myogenin è un fattore normativo necessario per la differenziazione del muscolo scheletrico 6-9. I dati dimostrano che miogenina è associato proprio promotore di E8.5 e E9.5 embrioni. Perché miogenina è espresso solo in somiti in questa fase di sviluppo 6,10, i dati indicano che le interazioni con miogenina proprio promotore si sono già verificati nelle cellule precursori del muscolo scheletrico in E8.5 embrioni.

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Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Ci mostrano una immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) metodo per identificare interazioni tra fattori di geni tessuto-specifici durante o dopo l&#39;insorgenza di tessuto-specifica dell&#39;espressione genica nei tessuti embrionali di topo. Questo protocollo dovrebbe essere ampiamente applicabile per lo studio di tessuto-specifica l&#39;attivazione del gene, come si verifica durante il normale sviluppo embrionale.

Saggio di immunoprecipitazione della cromatina per geni tessuto-specifici utilizzando nella fase iniziale di embrioni di topo

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...

chromatin-immunoprecipitation-assay-for-tissue-specific-genes-using

Research

JoVE Journal

Biology

18.0K Views.  University of Massachusetts Medical School. Ci mostrano una immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) metodo per identificare interazioni tra fattori di geni tessuto-specifici durante o dopo l'insorgenza di tessuto-specifica dell'espressione genica nei tessuti embrionali di topo. Questo protocollo dovrebbe essere ampiamente applicabile per lo studio di tessuto-specifica l'attivazione del gene, come si verifica durante il normale sviluppo embrionale.

Video: Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Placing Growth Factor-Coated Beads on Early Stage Chicken Embryos

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development. These proteins have been shown to be critical for cell fate determination, cell migration, and formation of neural circuits. Neuronal induction and patterning involve bone morphogenetic protein (BMP), sonic hedgehog (SHH), fibroblast growth factor (FGF), among others. In particular, the expression pattern of Fgf8 is in close proximity to regions expressing BMP4 and SHH. This expression pattern is consistent with developmental interactions that facilitate patterning in the telencephalon.

Here we provide a visual demonstration of a method in which an in ovo preparation can be used to test the effects of Fgfs in the formation of the forebrain. Beads are coated with protein and placed in the developing neural tube to provide sustained exposure. Because the procedure uses small, carefully placed beads, it is minimally invasive and allows several beads to be placed within a single neural tube. Moreover, the method allows for continued development so that embryos can be analyzed at a more mature stage to detect changes in anatomy and in neural patterning. This simple but useful protocol allows for real time imaging. It provides a means to make spatially and temporally limited changes to endogenous protein levels.

A variety of growth factors and proteins interact to induce cells to take on different cell fates during development. Here we demonstrate the use of an in ovo preparation to address possible interactions between different proteins in development by placing beads on E2.5 chick embryos.

Posizionamento Growth Factor-Coated Perline su embrioni di pollo Stadio

The neural tube expresses many proteins in specific spatiotemporal patterns during development.   These proteins have been shown to be critical for cell ...

Ricerca

Biologia

A Chromatin Assay for Human Brain Tissue

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental factors that might result in epigenetic alterations of gene expression and other molecular pathology. Traditionally, however, expression studies in postmortem brain were confined to quantification of mRNA or protein. The limitations encountered in postmortem brain research   such as variabilities in autolysis time and tissue integrities   are also likely to impact any studies of higher order chromatin structures. However, the nucleosomal organization of genomic DNA   including DNA:core histone binding - appears to be largely preserved in representative samples provided by various brain banks. Therefore, it is possible to study the methylation pattern and other covalent modifications of the core histones at defined genomic loci in postmortem brain. Here, we present a simplified native chromatin immunoprecipitation (NChIP) protocol for frozen (never-fixed) human brain specimens. Starting with micrococcal nuclease digestion of brain homogenates, NChIP followed by qPCR can be completed within three days. The methodology presented here should be useful to elucidate epigenetic mechanisms of gene expression in normal and diseased human brain.

Until recently, expression studies on human brain were limited to quantification of RNA or protein. With the chromatin immunoprecipitation techniques described in this paper, it will be possible to map histone methylation and other epigenetic regulators of gene expression in postmortem brain.

Un saggio cromatina per tessuto cerebrale umano

Chronic neuropsychiatric illnesses such as schizophrenia, bipolar disease and autism are thought to result from a combination of genetic and environmental ...

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are characterized by two fundamental properties: self-renewal and multipotency that allows a stem cell to differentiate into virtually any cell type 1. The progression stem cell to differentiated cell is characterized by loss of multipotency, structural and morphological changes and the hierarchic activity of transcription factors and signaling molecules, whose activities establish and maintain cell-type specific gene expression patterns. At the molecular level, cell differentiation involves dynamic changes of the structure and composition of chromatin and the detection of those dynamic changes can provide valuable insights into the functional features of stem cells and the cell differentiation process 2,3. Chromatin is a highly compacted DNA-protein complex that forms when cells package chromosomal DNA with proteins, mainly histones 4. Stemcellness and cell differentiation has been correlated with the presence of specific arrays of regulatory proteins such as epigenetic factors, histone variants, and transcription factors 2,3,5.
 Chromatin immunoprecipitation (ChIP) provides a valuable method to monitor the presence of RNA, proteins, and protein modifications in chromatin 6,7. The comparison of chromatin from different cell types can elucidate dynamic changes in protein-chromatin associations that occur during cell differentiation.
Chromatin immunoprecipitation involves the purification of in vivo cross-linked chromatin. The isolated chromatin is reduced to smaller fragments by enzymatic digestion or mechanical force. Chromatin fragments are precipitated using specific antibodies to target proteins or protein and DNA modifications. The precipitated DNA or RNA is purified and used as a template for PCR or DNA microarray based assays. Prerequisites for a successful ChIP are high quality antibodies to the desired antigen and the availability of chromatin from control cells that do not express the target molecule. ChIP can correlate the presence of proteins, protein and RNA modifications, and RNA with specific target DNA, and depending on the choice of outread tool, detects the association of target molecules at specific target genes or in the context of an entire genome. The comparison of the distribution of proteins in the chromatin of differentiating cells can elucidate the dynamic changes of chromatin composition that coincide with the progression of cells along a cell lineage.

The differentiation of ESC coincides with cell-type specific changes in the structure and composition of chromatin. The detection of those changes provides valuable insights into the mechanisms that define stemcellness and cell differentiation. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) represents a valuable method to dissect the molecular mechanisms underlying stem cell differentiation.

Immunoprecipitazione della cromatina di cellule staminali embrionali umane

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) per analisi modifica dinamica Histone nell&#39;espressione genica attivata nelle cellule umane

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics: Rilevamento delle alterazioni numeriche e strutturali in tutti i 24 cromosomi umani simultaneamente utilizzando un nuovo metodo di analisi FISH OctoChrome

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) using Drosophila tissue

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at different developmental stages. Epigenetic regulation contributes to a broad spectrum of biological processes, including cellular differentiation during embryonic development and homeostasis in adulthood. A critical strategy in epigenetic studies is to examine how various histone modifications and chromatin factors regulate gene expression. To address this, Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) is used widely to obtain a snapshot of the association of particular factors with DNA in the cells of interest.
ChIP technique commonly uses cultured cells as starting material, which can be obtained in abundance and homogeneity to generate reproducible data. However, there are several caveats: First, the environment to grow cells in Petri dish is different from that in vivo, thus may not reflect the endogenous chromatin state of cells in a living organism. Second, not all types of cells can be cultured ex vivo. There are only a limited number of cell lines, from which people can obtain enough material for ChIP assay.
Here we describe a method to do ChIP experiment using Drosophila tissues. The starting material is dissected tissue from a living animal, thus can accurately reflect the endogenous chromatin state. The adaptability of this method with many different types of tissue will allow researchers to address a lot more biologically relevant questions regarding epigenetic regulation in vivo1, 2. Combining this method with high-throughput sequencing (ChIP-seq) will further allow researchers to obtain an epigenomic landscape.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP using Drosophila tissue

Recently high-throughput sequencing technology has greatly increased sensitivity of Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) experiment and prompted its application using purified cells or dissected tissue. Here we delineate a method to use ChIP technique with Drosophila tissue, which can address the endogenous chromatin state in a well-characterized biological system.

Immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) con Drosophila Tessuto

Epigenetics remains a rapidly developing field that studies how the chromatin state contributes to differential gene expression in distinct cell types at ...

Efficient Chromatin Immunoprecipitation using Limiting Amounts of Biomass

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used method for determining the interactions of different proteins with DNA in chromatin of living cells. Examples include sequence-specific DNA binding transcription factors, histones and their different modification states, enzymes such as RNA polymerases and ancillary factors, and DNA repair components. Despite its ubiquity, there is a lack of up-to-date, detailed methodologies for both bench preparation of material and for accurate analysis allowing quantitative metrics of interaction. Due to this lack of information, and also because, like any immunoprecipitation, conditions must be re-optimized for new sets of experimental conditions, the ChIP assay is susceptible to inaccurate or poorly quantitative results.
Our protocol is ultimately derived from seminal work on transcription factor:DNA interactions1,2 , but incorporates a number of improvements to sensitivity and reproducibility for difficult-to-obtain cell types. The protocol has been used successfully3,4 , both using qPCR to quantify DNA enrichment, or using a semi-quantitative variant of the below protocol.
This quantitative analysis of PCR-amplified material is performed computationally, and represents a limiting factor in the assay. Important controls and other considerations include the use of an isotype-matched antibody, as well as evaluation of a control region of genomic DNA, such as an intergenic region predicted not to be bound by the protein under study (or anticipated not to show changes under the experimental conditions). In addition, a standard curve of input material for every ChIP sample is used to derive absolute levels of enrichment in the experimental material. Use of standard curves helps to take into account differences between primer sets, regardless of how carefully they are designed, and also efficiency differences throughout the range of template concentrations for a single primer set. Our protocol is different from others that are available5-8 in that we extensively cover the later, analysis phase.

We describe a robust method for chromatin immunoprecipitation using primary T cells. The method is founded on standard approaches, but uses a specific set of conditions and reagents that improve efficiency for limited a quantities of cells. Importantly, a detailed description of the data analysis phase is presented.

Efficiente immunoprecipitazione della cromatina utilizzando Limitare quantità di biomassa

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a  widely-used method for determining the interactions of different proteins with  DNA in chromatin of living ...

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing (ChIP-seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation (ChIP) and massively parallel sequencing can be utilized to identify the repertoire of mammalian DNA sequences bound by transcription factors in vivo. "Next-generation" genome sequencing technologies provide 1-2 orders of magnitude increase in the amount of sequence that can be cost-effectively generated over older technologies thus allowing for ChIP-seq methods to directly provide whole-genome coverage for effective profiling of mammalian protein-DNA interactions.
For successful ChIP-seq approaches, one must generate high quality ChIP DNA template to obtain the best sequencing outcomes. The description is based around experience with the protein product of the gene most strongly implicated in the pathogenesis of type 2 diabetes, namely the transcription factor transcription factor 7-like 2 (TCF7L2). This factor has also been implicated in various cancers.
Outlined is how to generate high quality ChIP DNA template derived from the colorectal carcinoma cell line, HCT116, in order to build a high-resolution map through sequencing to determine the genes bound by TCF7L2, giving further insight in to its key role in the pathogenesis of complex traits.

Generation of High Quality Chromatin Immunoprecipitation DNA Template for High-throughput Sequencing ChIP-seq

The combination of chromatin immunoprecipitation and ultra-high-throughput sequencing (ChIP-seq) can identify and map protein-DNA interactions in a given tissue or cell line. Outlined is how to generate a high quality ChIP template for subsequent sequencing, using experience with the transcription factor TCF7L2 as an example.

Generazione di immunoprecipitazione della cromatina Template DNA di alta qualità per high-throughput sequencing (ChIP-Seq)

ChIP-sequencing (ChIP-seq) methods directly  offer whole-genome coverage, where combining chromatin immunoprecipitation  (ChIP) and massively parallel ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Isolamento efficiente e rapida di embrioni nelle prime fasi di<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Semi

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Imaging semi-automatico di fluorescenza tessuto-specifica in embrioni di zebrafish

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...