Il misurato per cui viene utilizzato per eseguire un efficiente sequenziamento ChIP di proteine estere e non estere nel tessuto lipidico marrone isolato dal topo. Il principale vantaggio della tecnica è che il protocollo è stato ottimizzato per un'efficace immunoprecipitazione del complesso associato alla cromatina dal tessuto lipidico. Prima dell'incisione, spruzzare il topo eutanasiato con il 70% di etanolo.
Posizionare il mouse con la schiena rivolta verso l'alto, quindi fare un'incisione lungo il collo. Successivamente, situato BAT direttamente sotto la pelle tra le spalle e rimuovere con cura il sottile strato di grasso bianco. Collegare rà mente ogni bat pad in 10 millilitri di PBS contenenti l'1% di formaldeide per 15 minuti a 150 giri/min a temperatura ambiente.
Dopo 15 minuti, dissetare il cross-linking aggiungendo 2,5 glicina molare alla BAT, con una concentrazione finale di 125 millimolare. Posizionarlo su uno shaker per cinque minuti, ruotando a 150 giri/min a temperatura ambiente. Successivamente, trasferire il bat pad a 500 microlitri di tampone di lisi ipotonica e aggiungere due perline in acciaio inossidabile per ogni bat pad.
Quindi, utilizzare un omogeneizzatore di tessuti a base di perline per distruggere il tessuto. Inizia con cinque minuti alla massima potenza. Se necessario, prolungare il tempo fino a quando il tessuto non è omogeneizzato e le singole cellule sono separate.
Trasferire il campione in un nuovo tubo e centrifugare a quattro gradi Celsius a 16.000 G per 10 minuti. Dopo 10 minuti, trasferire il supernatante in un nuovo tubo e mantenere il pellet cellulare sul ghiaccio. Centrifugare il supernatante a quattro gradi Celsius a 16.000 G per 10 minuti per prevenire la perdita di cellule galleggianti.
Quindi, scartare il supernatante finale e sospendere di nuovo entrambi i pellet cellulari insieme in 300 microlitri di tampone di lisi SDS con un inibitore della proteasi una volta. Incubare sul ghiaccio per 10 minuti. Successivamente, sonicare i lysati per generare frammenti di DNA lunghi da 200 a 500 coppie di basi.
Dopo la sonicazione, rimuovere i detriti per centrifugazione per 10 minuti a 16.000 G a quattro gradi celsius. Per eseguire l'immunoprecipitazione, tenere da parte l'1% della soluzione di cromatina come ingresso ChIP e mantenere gli ingressi durante la notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, aggiungere l'anticorpo ChIP a un millilitro di soluzione di cromatina ed eseguire l'immunoprecipitazione parallela con igG pre-immune corrispondente o IgG normale della stessa specie.
In alternativa, salvare un millilitro di soluzione di cromatina per un controllo senza anticorpi. Incubare durante la notte a quattro gradi Celsius con rotazione. Per raccogliere i complessi immunitari, aggiungere 50 microlitri di proteina A agarosio 50% liquami ai complessi immunitari e incubare per un'ora a quattro gradi Celsius con rotazione a 150 RPM.
Dopo un'ora, pellet le perline per centrifugazione per un minuto a 1000 volte G a quattro gradi Celsius. Eseguire lavaggi sequenziali delle perline su colonne filtranti centrifughe PVDF da 0,45 micrometri con buffer di crescente rigore trasferendo prima le perline nelle colonne con 500 microlitri di tampone di lavaggio a basso contenuto di sale. Quindi, pelletare le perline nelle colonne per tre minuti a 2500 G.Scartare il flusso.through.
Ripetere il lavaggio con un alto tampone di lavaggio del sale secondo le procedure di lavaggio a basso contenuto di sale. Quindi, ripetere le procedure con cloruro di litio e infine con one times TE. Una volta completati i lavaggi, eludere i complessi immunitari aggiungendo 300 microlitri di tampone di eluizione alle perline pelletate nelle colonne. Incubarli a temperatura ambiente per 30 minuti su uno shaker a 400 giri/min.
Successivamente, raccogliere l'elute facendo girare le colonne per tre minuti a 2500 G in un tubo fresco. Invertire i collegamenti incrociati incubando l'eluto e gli input raccolti a 65 gradi Celsius durante la notte. Per recuperare il DNA, aggiungere 300 microlitri di fenolo cloroformio AIA all'eluto e ingressi con un rapporto uno-a-uno e vortice per 10 secondi.
Quindi, spin down a 21.000 G a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Conservare il pellet e scartare il supernatante. Lavare il pellet con un millilitro di 70% di etanolo freddo.
Quindi gira verso il basso a 21.000 G a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e asciugare all'aria il pellet. Sospendere di nuovo il pellet in 70 microlitri di acqua priva di DNAsi per ulteriori procedure.
Ecco un esempio di CHIP Q PCR che utilizza BAT isolato da topi knockout GPS2-A. Poiché il GPS2 è stato trovato necessario per l'espressione di geni mitocondriali codificati nucleari in diverse linee cellulari, il reclutamento di GPS2 è stato testato su due specifici geni mitocondriali codificati nucleare. NDUFV1 e TOMM20 in BAT da topi come esempi di un tessuto altamente arricchito nei mitocondri.
L'occupazione del promotore GPS2 è stata confrontata nei topi knockout GPS2-A e nei compagni di lettera di tipo selvaggio. Una diminuzione prevista è stata osservata nel legame GPS2 sui geni bersaglio selettivi nella BAT da topi knockout GPS2-A. Utilizzando il protocollo qui descritto, un aumento del legame dell'RNA polimerasi due e il segno istono repressivo, H3K9ME3, è stato registrato nella BAT da topi knockout GPS2-A rispetto ai compagni di lettera di tipo selvaggio.
Questi risultati confermano il reclutamento di GPS2 su determinati geni mitocondriali codificati nucleari e mostrano che gps2 è necessario per prevenire l'accumulo di H3K9ME3 e quindi necessario per lo stallo dell'attività trascrizionale del polo due sui promotori bersaglio. Il protocollo qui descritto, anche se specificamente ottimizzato per il tessuto adiposo marrone, rappresenta uno strumento prezioso per eseguire il ChIP da altri tessuti murini e umani. Non dimenticare che lavorare con il fenocloroforme può essere estremamente pericoloso.
Pertanto, è estremamente importante operare sempre sotto la cappa dei fumi durante l'utilizzo di questo reagente.
