Gli autori desiderano ringraziare le fonti di finanziamento: Esercito-UNL Centro per la Meccanica Trauma (DoD / ARO, # W911NF-11-1-0033, PI: Dr. Namas Chandra), Premio Layman UNL (-001 26-1110-0033 , PI: Lim).

1. Coltura cellulare neuronale <ol><li> Cellule del cervello, comprese cellule neuronali, astrociti, e la loro co-coltura può essere utilizzato come modello cellulare. A dimostrazione di fattibilità, pressurizzazione impulsivo delle cellule neuronali linea cellulare viene presentato. </li><li> SH-SY5Y cellule di neuroblastoma umano (ATCC, CRL-2266) sono coltivate su 18 coprioggetto mm di vetro di diametro. Le cellule vengono seminate ad una densità di 3 x 10 3 cellule / cm 2 mediante i mezzi di crescita composto DMEM supplementato con 10% di siero fetale bovino e 1% di penicillina-streptomicina. Vetrini cellule coltivate vengono conservati in 5% CO 2 incubatore umidificato a 37 ° C. </li><li> Per ottenere la differenziazione neuronale delle cellule SH-SY5Y, le cellule vengono trattate con supporti ulteriormente integrato con 10 mM di acido retinoico (RA) per 7 giorni con supporti cambiati ogni due giorni. Il giorno 7, le cellule sono pronte per essere in pressione. </li></ol> 2. Pressurizzazione Attrezzatura: Kolsky Bar <ol><li> Il bar Kolsky, desviluppata da Kolsky 1 nel 1949, è stato utilizzato per misurare le proprietà meccaniche di un materiale ad un tasso di carico molto elevata. L&#39;apparecchiatura consiste di due barre con un campione posto in contatto tra le barre. Un onda d&#39;urto, creata sulla barra incidente, propaga al campione in cui l&#39;onda si divide in un&#39;onda riflessa e trasmessa. Lo stress nel campione è proporzionale alla onda trasmessa. In questo studio, si utilizzano una camera di pressurizzazione cella da interporre tra le due barre del Kolsky set-up. </li><li> Le due barre di lega di alluminio (ogni 6-m) sono sospese da bronzine allineati, e una camera di pressurizzazione in vitro di cellule è inserita tra le barre. Il bar a monte è la barra incidente con una massa di 130 £ fissato su una delle estremità. Un morsetto di attrito è collocato in una posizione che darà la durata di impulso desiderata. Impegnando il morsetto e il serraggio di un jack forbice tra la massa ed un supporto di carico, il morsetto-massa sezione della barra incidente è pre-compressed al livello desiderato. Costringendo un bullone dentata che blocca il morsetto di una rottura improvvisa di un sistema idraulico rilascia la compressione pre-memorizzati rapidamente e genera così un impulso di pressione. Questo si propaga attraverso la barra incidente, spinge il pistone camera di prova, e pressurizza il fluido e le cellule all&#39;interno della camera impulsivamente. La camera di pressurizzazione a sua volta emette un impulso di pressione di moltiplicazione nei bar a valle trasmessi. I ceppi associati con gli impulsi di pressione nelle barre sono misurate con manometri ad alta resistenza estensimetri composti eccitati a 45 volt. I segnali di gauge sono registrate con un oscilloscopio digitale a 1 MHz come una storia di carico. </li><li> La camera di pressurizzazione in vitro di cellule è composto da un cilindro-pistone. Il cilindro ha diametro interno 2,6 cm e 3,8 cm di diametro esterno, e ha un piccolo foro filettato alla base della cavità. Il foro funge da sfiato aria e liquidi in eccesso durante l&#39;installazione cella campione. Il pistone è 7,5 cm di lunghezzaed è realizzato in materiale stessa barra. Il pistone è avvolto con due o tre strati di idraulico (Teflon) del nastro che fungono da guarnizione a basso attrito. La testata è di 32 mm di lunghezza e dispone di due piccole viti in acciaio inox che fissano i vetrini (in cui le cellule sono coltivate) durante il caricamento. </li></ol> 3. Pressurizzazione impulsivo delle cellule neuronali <ol><li> Tutte le parti della camera di pressurizzazione sono sterilizzati usando l&#39;autoclave e sono tenuti sotto luce UV. L&#39;assemblaggio della camera viene eseguito all&#39;interno della cappa coltura cellulare. La vite di sfiato della camera è liberamente impegnata nella presa d&#39;aria alla base della cavità. Pre-riscaldata (37 ° C), mezzi di crescita freschi pipettato nella camera senza fare bolle. Quindi, una cellula-coltura vetrino viene raccolto, ed è posto sul tappo del pistone (cellule rivolti all&#39;esterno). Le piccole viti che tengono sono serrati verso il basso sulla diapositiva per tenerlo in posizione. Il pistone con una cellula-coltura vetrino viene inserito un poco into della cavità della camera, e il gruppo è inclinato con lo sfiato essendo nel punto più alto. La vite di sfiato viene rimosso e il pistone viene spinto nella prima cavità costringendo le bolle d&#39;aria, il liquido in eccesso. Un segno di riferimento o una maschera viene utilizzato come guida per garantire lo stesso volume di cultura media per ogni test. La dimensione assiale del supporto della camera è di circa 6 mm. Disinfettare la vite di sfiato e sostituirlo per rendere l&#39;acqua camera di tenuta. La camera non dovesse perdere in questa carico statico, se lo fa, la pellicola Teflon deve essere sostituito o rinforzato. </li><li> A questo punto, il sistema bar Kolsky è resettato. La massa pesante viene spostato nella posizione originale e un bullone di bloccaggio sostituisce l&#39;usato (rotto) uno. Inserire la nuova vite di bloccaggio con l&#39;idraulica a circa 200 psi. Utilizzare il jack forbici per comprimere il pre-caricamento sezione della barra incidente fino ad una pressione di poco superiore al valore desiderato, e poi marcia indietro per innestare la frizione pienavite di Jack. L&#39;acquisizione dei dati è ora in funzione. </li><li> L&#39;assemblato camera di pressurizzazione cella è montata nel sistema. Esso è collocato in un blocco V supportato da laboratorio piccola forbice jack e allineato con le due barre. Ingrassare ogni interfaccia con uno strato di grasso leggero e strofinare le superfici intestatura insieme per eliminare eventuali vuoti d&#39;aria tra i due. </li><li> Il test è ora pronto per procedere. Il bullone di bloccaggio pinza è costretto a rompere in fretta pompando il driver idraulico pinza. Il morsetto separerà e l&#39;acquisizione dei dati deve visualizzare i risultati. La storia pressurizzazione cella è determinato dalle misurazioni del calibro bar trasmesso. Se la barra di trasmissione utilizzato è abbastanza lungo, questa dovrebbe essere solo dal primo disturbo al punto in cui le misurazioni mostrano una pressione negativa. La durata dell&#39;impulso trasmesso può essere più breve impulso incidente se una bolla viene intrappolato. L&#39;entità non può raggiungere quella dell&#39;impulso incidente, ma dovrebbe avere una sufficiente long pianoro prima dello scarico. Altrimenti, sia una bolla d&#39;aria grande nella camera stagna o un disallineamento tra il gruppo e un bar potrebbe essersi verificato. </li><li> La camera di pressurizzazione cella viene quindi rimosso e smontato all&#39;interno della cappa coltura cellulare. La vite di sfiato viene rimosso e il pistone viene tirato libera della camera. La cellula-coltura vetrino viene prelevato dalla testa del pistone. </li></ol> 4. La valutazione del comportamento sotto pressione cellulare <ol><li> Dopo la pressurizzazione, le cellule possono essere ispezionati immediatamente o ulteriormente incubate per successivo esame. Con adeguati processi di funzionamento asettici, a più lungo termine post-incubazione è possibile. </li><li> Cellule in pressione può essere esaminato da tutte le tecniche di biologia molecolare e cellulare. In particolare per la pressurizzazione delle cellule neuronali, per studiare la fisiologia cellulare e molecolare in condizioni TBI, saggi di valutazione di pressione indotti cambiamenti nella crescita dei neuriti, il cambiamento dei microtubuli del citoscheletro, expre gene neuronalession, apoptosi, ecc, possono essere eseguite. Come campioni di cellule di controllo, cellule che sono coltivate stesso, mantenuto all&#39;interno della camera di pressurizzazione per lo stesso periodo, ma non in pressione vengono utilizzati (cosiddetta, camera di controllo). </li><li> Per valutare i cambiamenti nella crescita dei neuriti, cellule di controllo pressione e la camera sono esaminati al microscopio ottico subito dopo la pressurizzazione e il 1 ° e 24 ore di post-incubazione. Un esempio di immagini di cellule neuronali sono riportati nella sezione &quot;Rappresentante dei risultati&quot; (Figura 2). La variazione di lunghezza dei neuriti può essere quantificato mediante colorazione immunofluorescente actina e analisi d&#39;immagine. Cellule vengono fissate con 4% w / v soluzione di paraformaldeide, sciacquato con 0,05% v / v Tween-20 tampone di lavaggio, e permeabilizzate con v / v 0,1% Triton X-100 soluzione. Dopo il bloccaggio con un 1% w / v di albumina sierica bovina, le cellule vengono incubate con tetrametilrodamina isotiocianato (TRITC)-coniugato falloidina. Immagini immunofluorescenza delle cellule sono effettuate utilizzando un fluorescentemicroscopio e le lunghezze dei neuriti di cellule pressione e controllo vengono quantificati utilizzando il software ImageJ (NIH). </li><li> I neuriti possono essere identificati come assoni o dendriti. Per valutare le variazioni morfologiche assoni o dendriti, gli esperimenti descritti sopra possono essere ripetute utilizzando anticorpi specifici ciascuna struttura, cioè, neurofilamenti (NF) anticorpo per assoni e proteina associata ai microtubuli (MAP2) anticorpali per dendriti. </li><li> Microtubuli sono uno dei componenti chiave citoscheletrici di neuroni, e il danno ai microtubuli è stato usato come marcatore di danno neuronale. 2 microtubuli possono essere visualizzati utilizzando il immunofluorescently β-tubulina. Cellule vengono fissate dopo 0 e 24 h post-pressurizzazione, colorati con β-tubulina, e osservato al microscopio a fluorescenza. </li><li> Per valutare l&#39;effetto di pressurizzazione impulsivo sull&#39;espressione genica neuronale apoptotica, RNA totale viene estratto da cellule pressione e controllo. Genespressione e può essere esaminato eseguendo quantitativa RT-PCR o real-time RT-PCR, simile ai nostri protocolli pubblicati. 3 </li></ol> 5. Rappresentante dei risultati: <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Un esempio di profilo di pressione applicata alle cellule all&#39;interno della camera di pressurizzazione. L&#39;apparato bar Kolsky genera successo 2 livello MPa, singolo impulso pressurizzazione tipo impulsivo con una durata di circa 0,7 ms. <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. Un esempio di risposta cellulare neuronale della pressurizzazione impulsivo. SH-SY5Y esposte a pressurizzazione impulsivo a 2 MPa mostra distinta neurite / assone rottura rispetto a cellule di controllo della camera. 6. Difficoltà e soluzioni <ol><li> Camera di tenuta è uno dei principali ostacoli da superare. È found che i dischi di grandi dimensioni con o-ring hanno un problema di scriccatura e maggiore attrito. Al fine di eliminare gli effetti di attrito, così come impedire sgorbiatura, un semplice metodo di nastratura pistone idraulico con nastro di teflon viene utilizzato. Questo risolve i problemi e produce livello di pressione desiderato e durata. </li><li> Sotto pressione il comportamento delle cellule neuronali, in particolare in sede di valutazione secondaria meccanismo di trauma cranico o di effetti a lungo termine, devono essere esaminati dopo un lungo tempo di post-incubazione. La cella contenente camera è esposta a potenziali condizioni non sterili mentre si sposta al bar Kolsky, pressurizzazione, e tornando alla cappa coltura cellulare. Con pre-sterilizzazione dei pezzi da camera e il funzionamento corretto per il montaggio / smontaggio della cellula-colta vetrino e la camera all&#39;interno della cappa di coltura cellulare, a più lungo termine post-incubazione è possibile fino a diverse settimane. </li><li> La riproducibilità dei dati è un parametro importante per cellulari esperimenti di stimolazione meccanica. Per il nostro dispositivo, il reproducibility in risposta neuronale è determinato come desiderato profilo impulsivo pressurizzazione, sia sul livello di pressione e durata, si ottiene ripetutamente. Dal registriamo il profilo di pressione ottenuti per ogni pressurizzazione, i dati di risposta delle celle di profilo di pressione indesiderato può essere escluso manualmente in seguito. </li><li> Le fasi di pressurizzazione intero, compreso l&#39;assemblaggio della camera, il trasferimento e montare nella barra Kolsky, pressurizzazione, il trasferimento-back, e la camera di smontaggio, in meno di 10 minuti. La slitta cella successiva coltivate può essere pressurizzata immediatamente dopo la pressurizzazione precedente. Così, il numero sufficiente di esperimenti di pressurizzazione può essere completato in modo efficiente. Il nostro set-up utilizza 18 millimetri di diametro coprioggetto. Un esperimento pressurizzazione non fornisce sufficienti proteine ​​per Western immunoblotting causa delle dimensioni del substrato (e in parte anche perché alcune delle cellule pressurizzati sono morti). Circa tre esperimenti di pressurizzazione ripetuti fornire quantità di proteine ​​necessaria per immunoblOtting. Ancora, la riproducibilità viene controllato ogni volta con il profilo di pressione. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+mechanical+properties+of+materials+at+very+high+rates+of+loading.">An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading.</a> Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).</li><li>Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+breaking+of+microtubules+in+axons+during+dynamic+stretch+injury+underlies+delayed+elasticity,+microtubule+disassembly,+and+axon+degeneration.">Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration.</a> FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).</li><li>Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+expression+and+osteopontin+regulation+in+human+fetal+osteoblastic+cells+mediated+by+substratum+surface+characteristics.">Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics.</a> Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).</li><li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+approaches+for+studying+blast-induced+traumatic+brain+injury.">In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).</li><li>Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explosive+blast+neurotrauma.">Explosive blast neurotrauma.</a> J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).</li><li>Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+percussion+barotrauma+chamber:+a+new+in+vitro+model+for+traumatic+brain+injury.">Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury.</a> J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).</li><li>VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure.">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).</li><li>Huang, H., Feng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+dynamic+tribological+response+of+closed+fracture+surface+pairs+by+Kolsky-bar+compression-shear+experiment.">A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment.</a> Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).</li><li>Song, B., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+Hopkinson+pressure+bar+techniques+for+characterizing+soft+materials.">Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials.</a> Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Molti in vitro tecniche sperimentali sono stati tentati per lo studio delle cellule danno cerebrale in condizioni TBI. Tra questi neuroni / astrociti stretching, il flusso indotto shear stress, calo di peso, lacerazione stilo, laser transezione, litotripsia, ecc 4,5 E &#39;stato ipotizzato che la breve durata sovrapressione è un fattore dominante fisica per trauma cranico. 6,7 Specialmente , l&#39;onda d&#39;urto dell&#39;esplosione TBI ha una durata di impulso di un ordine di millisecondi. 4 Sulla base di questa ipotesi ed osservazione, camera barometro capace di pressurizzazione transitoria è stato sviluppato e utilizzato per valutare il comportamento delle cellule cerebrali in condizioni TBI. Per esempio, nella camera di fluido percussioni barotrauma un impulso di pressione con 20-30 ms lunga durata ed una pressione di picco fino a 0,5 MPa stato utilizzato per esaminare il comportamento umano cellule gliali sotto TBI. 6 Recentemente, VandeVord et al. 7 metallo usato palla camera barometro colpisce di esaminare la cella astrociticomportamento sotto TBI ma la sfera di metallo che colpisce prodotti impulsi di pressione più. In questo studio, abbiamo sviluppato un nuovo dispositivo di pressurizzazione cella che genera un solo impulso di pressurizzazione tipo impulsivo. Il dispositivo è stato sviluppato in base barra Kolsky set-up, che è stato usato come materiale di un apparato di test nei nostri 8 e di altri studi. 1,9 La barra Kolsky di funzionalità di test materiale a regime di carico molto elevato è stato modificato per essere in grado di applicare impulso singolo sovrapressione tipo alle cellule coltivate all&#39;interno della camera di pressurizzazione (Figura 1). Potremmo controllare con successo l&#39;ampiezza e la durata della sovrapressione impulsivo. Come una risposta cellulare rappresentante, abbiamo dimostrato che a 2 MPa cellule neuronali SH-SY5Y visualizzare neurite significativa e perdita assonale rispetto alle cellule non pressurizzate camera di controllo. In conclusione, abbiamo sviluppato un nuovo apparato di pressurizzazione impulsivo cella utilizzando un apposito Kolskydispositivo di bar e dimostrato il suo potenziale utilizzo nelle indagini risposta neuronale delle cellule in condizioni TBI. Abbiamo anche notare che questa tecnica è molto versatile in qualsiasi tipo di cellule può essere esposto a pressioni impulsive a vari livelli e la durata. Pertanto, il dispositivo può essere utilizzato per studiare l&#39;impulsivo pressione indotta comportamento cellulare meccanotrasduzione, non solo per ferire le cellule ma anche per stimolare le cellule positivamente nella loro funzione e determinazione fato.

<ul><li> SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) cellule di neuroblastoma umano </li><li> 18 mm di diametro in vetro coprioggetti </li><li> Mezzi di coltura cellulare: DMEM, 10% di siero fetale bovino, 1% di penicillina-streptomicina </li><li> L&#39;acido retinoico (10 micron) per indurre la neurogenesi </li><li> Kolsky bar dispositivo di pressurizzazione impulsivo </li><li> Pistone-cilindro cella camera di pressurizzazione </li><li> Viti in acciaio inox per il fissaggio coprioggetto cellule coltivate sul pistone </li><li> Grasso per interfacce tra cellule da camera e Kolsky bar </li><li> Forniture generali di biologia molecolare per la valutazione della risposta delle cellule della pressurizzazione (fissativo, anticorpi, colorante fluorescente, forniture PCR, ecc) </li></ul>

impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study

Un romanzo impulsivo esperimento pressurizzazione cella è stato sviluppato utilizzando un dispositivo bar Kolsky per indagare esplosione indotta da lesione traumatica cerebrale (TBI). Dimostriamo in questo articolo video come perfetto TBI-rilevante pressurizzazione impulsivo viene applicata alle cellule neuronali in vitro. Questo è ottenuto utilizzando ben controllati impulso di pressione creata da un dispositivo specializzato Kolsky bar, con la storia completa pressione all&#39;interno della camera di pressurizzazione cella registrata. Pressurizzati cellule neuronali sono controllati immediatamente dopo la pressurizzazione, o ulteriormente incubato per esaminare a lungo termine effetti di pressurizzazione impulsivo su neurite / assonale conseguenza, l&#39;espressione genica neuronale, apoptosi, ecc abbiamo osservato che la pressurizzazione impulsivo a circa 2 MPa induce distinta relativa perdita dei neuriti alle cellule non pressurizzate. La nostra tecnica prevede un nuovo metodo per studiare i meccanismi molecolari / cellulari di esplosione TBI, con pressurizzazione impulsivo delle cellule cerebrali a ben controllati prEssure ampiezza e la durata.

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Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

Un romanzo impulsivo esperimento pressurizzazione cella è stato sviluppato utilizzando un dispositivo bar Kolsky di investigare i meccanismi molecolari / cellulari di blast-indotta lesione cerebrale traumatica.

Pressurizzazione impulsivo delle cellule neuronali per lo studio traumatica lesione cerebrale

A novel impulsive cell pressurization experiment has been developed using a Kolsky bar device to investigate blast-induced traumatic brain injury (TBI). ...

impulsive-pressurization-neuronal-cells-for-traumatic-brain-injury

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.1K Views.  University of Nebraska-Lincoln. Un romanzo impulsivo esperimento pressurizzazione cella è stato sviluppato utilizzando un dispositivo bar Kolsky di investigare i meccanismi molecolari / cellulari di blast-indotta lesione cerebrale traumatica.

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Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

Superfici Micropatterned per studiare le interazioni acido ialuronico con le cellule tumorali

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Ricerca

Bioingegneria

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Trapianto di progenitori miogenici pluripotenti derivati da cellule staminali indotte simili a mesoangioblasti nei modelli di topo di rigenerazione muscolare

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

A Novel tridimensionale del flusso Camera dispositivo per studiare Chemokine-diretto stravaso di cellule circolanti in condizioni di flusso fisiologici

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Utilizzando Chips microfluidica per l&#39;imaging dal vivo e studio delle risposte lesioni in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

Luminescence Resonance Energy Transfer allo Studio conformazionale Cambiamenti nella membrana proteine ​​espresse in cellule di mammifero

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Training Persons with Spinal Cord Injury to Ambulate Using a Powered Exoskeleton

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper extremity function and are able to maintain upright balance using forearm crutches. To ambulate in an exoskeleton, the user must acquire the ability to maintain balance while standing, sitting and appropriate weight shifting with each step. This can be a challenging task for those with deficits in sensation and proprioception in their lower extremities. This manuscript describes screening criteria and a training program developed at the James J. Peters VA Medical Center, Bronx, NY to teach users the skills needed to utilize these devices in institutional, home or community environments. Before training can begin, potential users are screened for appropriate range of motion of the hip, knee and ankle joints. Persons with SCI are at an increased risk of sustaining lower extremity fractures, even with minimal strain or trauma, therefore a bone mineral density assessment is performed to reduce the risk of fracture. Also, as part of screening, a physical examination is performed in order to identify additional health-related contraindications. 
Once the person has successfully passed all screening requirements, they are cleared to begin the training program. The device is properly adjusted to fit the user. A series of static and dynamic balance tasks are taught and performed by the user before learning to walk. The person is taught to ambulate in various environments ranging from indoor level surfaces to outdoors over uneven or changing surfaces. Once skilled enough to be a candidate for home use with the exoskeleton, the user is then required to designate a companion-walker who will train alongside them. Together, the pair must demonstrate the ability to perform various advanced tasks in order to be permitted to use the exoskeleton in their home/community environment.

Training a person with paralysis to ambulate using a powered exoskeleton may present challenges. The goals are to present the candidate selection criteria and the training procedures for exoskeletal-assisted walking and other mobility skills that can be progressed as the participant's skill level improves.

Formazione Le persone con lesioni del midollo spinale di deambulare Utilizzando un esoscheletro

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

Tessutale tridimensionale allineato Astrocyte reti per ricapitolare i meccanismi dello sviluppo e facilitare la rigenerazione del sistema nervoso

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

Sciogliere elettrofilatura scrittura di scaffold tridimensionale Poly(ε-caprolactone) con morfologie controllabile per applicazioni di ingegneria del tessuto

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for movement disorders and is being applied to a growing number of disorders. Computational modeling has been successfully used to predict the clinical effects of DBS; however, there is a need for novel modeling techniques to keep pace with the growing complexity of DBS devices. These models also need to generate predictions quickly and accurately. The goal of this project is to develop an image processing pipeline to incorporate structural magnetic resonance imaging (MRI) and diffusion weighted imaging (DWI) into an interactive, patient specific model to simulate the effects of DBS. A virtual DBS lead can be placed inside of the patient model, along with active contacts and stimulation settings, where changes in lead position or orientation generate a new finite element mesh and solution of the bioelectric field problem in near real-time, a timespan of approximately 10 seconds. This system also enables the simulation of multiple leads in close proximity to allow for current steering by varying anodes and cathodes on different leads. The techniques presented in this paper reduce the burden of generating and using computational models while providing meaningful feedback about the effects of electrode position, electrode design, and stimulation configurations to researchers or clinicians who may not be modeling experts.

The goal of this project is to develop an interactive, patient-specific modeling pipeline to simulate the effects of deep brain stimulation in near real-time and provide meaningful feedback as to how these devices influence neural activity in the brain.

Tratti della fibra di un neurone di targeting per la terapia di stimolazione cerebrale profonda utilizzando modelli interattivi, specifico per ogni paziente

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

Acido ialuronico base di idrogel per cultura 3-dimensionale delle cellule di Glioblastoma paziente-derivato

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...