Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Robert Bloch per la sua generosa donazione del laboratorio spaziale e strutture e il dottor Rao Gullapalli e Da Shi nel Nucleo per l&#39;imaging traslazionale a Maryland (C-TRIM) e la Risonanza Magnetica Research Center (MRRC) per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dalle concessioni di RML dal National Institutes of Health (K01AR053235 e 1R01AR059179) e dalla Distrofia Muscolare (# 4278), e da una sovvenzione alle JAR dalla Fondazione Jain.

1. Modello in vivo lesioni e la misura di coppia isometrica. <ol><li> Queste procedure possono essere usati per i ratti o topi 7,17,18. Per iniziare, posizionare il supina animale in anestesia inalatoria (~ 4-5% isoflurano per l&#39;induzione in una camera di induzione, allora ~ 2% isoflurano tramite un nosecone per la manutenzione), utilizzando un vaporizzatore di precisione (gatto # 91103, Vet Equip, Inc, Pleasanton , CA). Applicare la crema oftalmica sterile (Unguento Vet Paralube, PharmaDerm, Floham Park, NJ) per ciascun occhio per proteggere le cornee si secchi. Durante la procedura, l&#39;animale è tenuto caldo mediante l&#39;uso di una lampada di calore posto all&#39;esterno della gabbia e conservati almeno 6 pollici dagli animali in ogni momento. </li><li> Preparazione della cute dalla depilazione e dalla pulizia con alternanza di macchie di Betadine e il 70% di alcol per evitare che i batteri della pelle semina nel tessuto molle o osseo. Confermare l&#39;anestesia adeguata per la mancanza di un riflesso tendineo profondo (nessun ritiro piede in risposta a pizzicare il piede). Un ago viene posizionato manualmente attraverso la tibia prossimale al fine di stabilizzare l&#39;arto sul rig (25G o 27G per il mouse). L&#39;ago non deve entrare il vano anteriore della gamba. </li><li> Bloccare l&#39;ago in una posizione fissa, in modo che l&#39;animale è in posizione supina e le dita si trovano ad affrontare verso l&#39;alto. Un dispositivo su misura viene utilizzato per proteggere l&#39;ago e quindi stabilizzare la gamba. </li><li> Posizionare il piede dell&#39;arto su una custom-lavorati pedana (Figura 1). L&#39;asse della pedana è collegata ad un motore passo-passo (modello T8904, Tecnologie NMB, Chatsworth, CA) e un sensore di coppia (modello QWFK-8M, Sensotec, Columbus, OH). Il piede deve inizialmente essere allineata in modo che sia ortogonale alla tibia, come in Figura 1. </li><li> Utilizzare elettrodi transcutanea (723.742, Harvard Apparatus, Cambridge, MA) o elettrodi sottocutanei (J05 aghi elettrodi ad ago, 36BTP, Alimentazione elettrodi Jari, Gilroy, CA) per stimolare il nervo peroneale in prossimità del collo del perone, in cui il nervo si trova in una posizione superficiale. Confermare visivamente dorsiflessione isolato eseguendo una serie di contrazioni (0,1 ms impulso per il mouse e 1 impulso ms per il ratto) prima che il piede è assicurato. Una volta che il piede è fissato alla pedana con del nastro adesivo, un aumento di ampiezza contrarsi in risposta ad un aumento della tensione conferma che i muscoli opposti (plantarflexors) non vengono stimolati contemporaneamente. </li><li> Prima di lesioni, e nei punti di tempo selezionato dopo un infortunio, la forza massima capacità di produzione dei flessori dorsali è registrata come &quot;coppia massima isometrica&quot; ​​(coppia senza un cambiamento di lunghezza del muscolo). Misure di coppia vengono eseguite sulla piattaforma stessa che viene utilizzata per indurre lesioni. Prima di registrare una coppia massima isometrica, l&#39;ampiezza degli impulsi è regolata per ottimizzare la tensione contrazione e la posizione ottimale della caviglia è determinata da contrazioni dando a diverse lunghezze dei flessori dorsali. Dopo aver ottenuto una coppia-angolo di curva per determinare la lunghezza ottimale dei flessori dorsali (lunghezza di riposo, alias Lo), una trama frequenza di coppia si ottiene aumentando progressivamente la frequenza degli impulsi durante un treno di impulsi 200 ms. Una massima contrazione tetanica fuso si ottiene di solito al 90-100 Hz. Tre contrazioni separata e contrazioni tetaniche sono registrati e salvati per ulteriori analisi. </li><li> Utilizzare il software commerciale a (Labview versione 8.5 di National Instruments, Austin, TX) per sincronizzare l&#39;attivazione contrattile, insorgenza di rotazione della caviglia, e la coppia di raccolta dati. La stimolazione dei muscoli flessori dorsali si verifica quando il computer controllato motore si muove contemporaneamente la pedana in flessione plantare, dando luogo ad una contrazione allungamento (chiamato anche contrazione &quot;eccentrica&quot;, che causa lesioni del muscolo). Il protocollo specifica dipende dalla grandezza desiderata di lesioni voluta dallo sperimentatore. L&#39;entità di lesioni o danni ai tessuti, può essere regolata attraverso la manipolazione di variabili come la velocità angolare, i tempi di attivazione muscolare, gamma di movimento, e il numero di contrazioni allungamento. </li><li> Per indurre lesioni, sovrapporre una contrazione allungamento su una contrazione isometrica massimale, variando il range di movimento, la velocità di allungamento, ed i tempi di stimolazione, se necessario. Ad esempio, una contrazione isometrica massimale si ottiene nel flessori dorsali e dopo 200 ms sono allungati a una velocità selezionata per approssimare il movimento normale (900 ° / sec). Abbiamo precedentemente dimostrato che l&#39;attivazione prima che il movimento e il grado di allungamento sono fattori importanti per ottenere un infortunio 14. La maggior parte della coppia prodotta dal flessori dorsali è da TA 11 e abbiamo dimostrato in precedenza che questo modello si traduce in danni per questo muscolo 5,13-15. Il TA rimane stimolato in tutto allungamento. </li><li> Dopo l&#39;infortunio, l&#39;animale viene rimossa dall&#39;apparecchio. Il perno è tibialerimosso, la gamba è ancora pulita, e l&#39;animale viene restituito alla gabbia (posto su una temperatura controllata blocco riscaldante a 37 ° C) e monitorata fino al recupero. Ciò include attendere l&#39;animale è sveglio e mobile. Gli animali soffrono nessun dolore osservabile durante la procedura e non ci sono cambiamenti visibili nella deambulazione (ad esempio, zoppia) dopo la lesione indotta da contrazioni allungamento. Tuttavia opportuno anti-dolore il trattamento viene somministrato successivamente (buprenorfina 0,05-0,1 mg / kg ogni 12 ore per 48 ore dopo l&#39;intervento chirurgico). </li></ol> 2. Nella misura in situ di tensione muscolare generale. <ol><li> L&#39;animale è preparato e la tibia è stabilizzato come descritto sopra nella sezione 1.1 con 1.3. Tutta la strumentazione è accesa almeno 30 minuti prima del test per la corretta calibrazione e di ridurre al minimo deriva termica del trasduttore di forza. </li><li> Incise anteriore pelle alla caviglia e recidere il tendine del muscolo tibiale anteriore (TA). Con attenzione cravatta 4,0 Ethicon seta non riassorbibile sutura al tendine e allegare la sutura Vicryl alla cella di carico tramite l&#39;apposita S-gancio (peso = 0,1 g), modello FT03, Strumenti Erba, Providence, RI). In alternativa, una fascetta personalizzata (peso = 0,5 g) può essere utilizzato per fissare il tendine per la sutura Vicryl (Figura 2). </li><li> La cella di carico è montato un micromanipolatore (manipolatore Kite, World Precision Instruments Inc, Sarasota, FL) in modo che il TA può essere regolata in lunghezza di riposo e allineati correttamente (una linea retta di tiro tra l&#39;origine e l&#39;inserimento). La TA è protetto da raffreddamento da una lampada di calore e di disidratazione da oli minerali. I segnali dalla cella di carico (calibrato prima di ogni prova) sono alimentati tramite un amplificatore DC (modello P122, Strumenti Erba, Providence, RI) ad un A / D a bordo devono essere raccolti e memorizzati dal software di acquisizione (PolyVIEW versione 2.1, Strumenti Grass , Providence, RI). </li><li> Collegare il TA per la cella di carico e applicare contrazioni singolo (impulso rettangolare di 1 ms) a lunghezze muscolari per determinare L 0. Lunghezza muscolare a riposo, misurata mediante pinze, è definita come la distanza tra la tuberosità tibiale e la giunzione miotendinea. A questa lunghezza, aumentare gradualmente l&#39;ampiezza di impulsi e quindi la frequenza degli impulsi di stabilire un rapporto di forza-frequenza. Una contrazione massimo fusa tetanica si ottiene a circa 90-100Hz (300 ms durata treno composto di 0,1 ms o impulsi di 1 ms). Utilizzare il 150% della massima intensità di stimolazione per attivare il TA al fine di indurre la massima attivazione contrattile (P 0). Massima contrazioni tetaniche può essere eseguito più volte ed espressi come percentuale di P 0, fornendo un indice di stanchezza in qualsiasi punto desiderato per tempo. </li></ol> 3. RM in vivo e / o spettroscopia dei muscoli scheletrici roditori. Tutte le MRI e MRS viene eseguita su un Biospin Bruker (Billerica, MA) 7,0 Tesla sistema RM dotato di un inserto 12 centimetri gradiente (660 mT / m massima pendenza, 4570 T / m / s slew rate massimo) in esecuzione ParaVision software 5.0. <ol><li> L&#39;animale è anestetizzato con vaporizzato isoflurano come descritto sopra al punto 1.1. Un sistema MR-compatibile piccoli animali di monitoraggio e gating (SA Instruments, Inc.) è utilizzato per monitorare il tasso di respirazione e la temperatura corporea. La temperatura corporea del mouse è mantenuta a 36-37 ° C con un circolatore acqua calda. Una misura titolare viene utilizzato per posizionare il mouse in posizione supina con le gambe parallele al foro del magnete dal ginocchio al piede. Un quattro canali di sola ricezione bobina di superficie è collocato all&#39;interno di una 1H 72 millimetri risonatore lineare. La bobina risonatore è sintonizzato e confrontati con i campioni. </li><li> MR Imaging: dopo localizzatori, le scansioni vengono eseguite le seguenti MR: T1 pesate rapida acquisizione con la valorizzazione di rilassamento (RARE) con i seguenti parametri: TE = 9,52 ms, TR = 1800, eco lunghezza dei treni = 4, nel piano risoluzione 100x100 micron , e lo spessore fetta = 750 micron. Dual-eco PD/T2 RARE: TE = 19.0/57.1 ms, TR = 5000 ms, lunghezza del treno eco = 4, nel piano risoluzione 100x100 micron, e spessore fetta = 750 micron. Spin echo (SE) del tensore di diffusione dei dati immagine utilizzando 12 non collineari direzioni: valore-b = 350 s / mm -2, TE = 26 ms, TR = 4500 ms, nel piano risoluzione 150x150 micron, e spessore fetta = 750 micron . Multi-slice multi-echo (MPMI) T2 dati cartografici parametrici utilizzando 16 TE = 11,4 ms a 182,5 ms con ΔTE = spessore 11,4 ms, TR = 10000 ms, nel piano risoluzione 150x150 micron, e fetta = 750 micron. </li><li> Elaborazione delle immagini: tensore di diffusione e trattografia ricostruzione viene eseguita utilizzando TrackVis (Martinos Center for Biomedical Imaging; Massachusetts General Hospital, Boston, MA) per creare diffusività media (DM), anisotropia frazionaria (FA), immagini e mappe trattografia. Mappatura T2 viene eseguita utilizzando software personalizzato scritto in MAT<html> LAB (The MathWorks, Natick, MA) con non-lineare dei minimi quadrati per adattare i dati misurati per ogni pixel l&#39;equazione canonica segnale T2. Regioni di interesse vengono effettuate misurazioni per valutare i valori dei parametri all&#39;interno del TA. </li><li> Spettroscopia 1H: shimming automatica è eseguita su un x 1 1 x 4 mm 3 voxel nel TA. Un punto risolta spettroscopia (PRESS) sequenza di impulsi (TR / TE = 2000/18 ms) viene utilizzato per acquisire gli spettri del voxel stesso con 1024 medie. L&#39;acquisizione dei dati è di 34 minuti su ogni gamba. Dati spettrali sono trattati con i 16 pacchetti LCModel. 31P spettroscopia: un dual-tuned (1H, 31P) bobina di superficie è utilizzato per eseguire non localizzato (utilizzando un singolo impulso esperimento) o spettroscopia localizzata utilizzando l&#39;immagine selezionata in vivo spettroscopia (ISIS) sequenza di impulsi. </li></ol> 4. La raccolta e la conservazione dei muscoli. TA sono raccolte dopo, alla fine degli esperimenti, pesato, scatto congelato in azoto liquido, e poi conservati a -80 ° C. Questa operazione può essere eseguita in qualsiasi momento dopo il esperimenti in vivo. I muscoli sono raccolte subito dopo gli esperimenti in situ, in quanto si tratta di una procedura terminale. Per informazioni dettagliate studi morfologici, l&#39;animale è fissato con 4% paraformaldeide tramite perfusione attraverso il ventricolo sinistro. 5. Rappresentante dei risultati. La figura 3 mostra i dati rappresentativi da un topo in area apparato vivo La vivo in un apparecchio viene utilizzato per ottenere una coppia massima generata dai muscoli flessori dorsali;. Ma è anche usato per indurre lesioni a questi stessi muscoli. A causa della lunghezza-tensione rapporto di muscoli, di coppia massima isometrica si verifica in genere quando l&#39;articolazione della caviglia è posizionato a circa 20 ° di plantarflessione (con il piede in posizione ortogonale alla tibia considerato 0 °). Dopo la coppia massima isometrica si ottiene, il piede può poi essere inserito in qualsiasi posizione per iniziare il protocollo di lesioni. La Figura 3 rappresenta un protocollo di lesioni di 30 ripetizioni con un arco di movimento da 0 ° - 70 °. Si noti il ​​calo costante di coppia generato dalla fase isometrica (freccia piena) e la fase di allungamento (freccia aperta) durante la contrazione indotta dal protocollo di lesioni. La coppia è registrato in unità di Nmm, ma il valore assoluto dipende dalla taglia dell&#39;animale e la sua condizione (per esempio, il muscolo infortunato, muscolo affaticato, o muscolo manca una certa proteina a causa della ricombinazione omologa). La Figura 4 mostra i dati rappresentativi da un topo nel nell&#39;apparato situ. Il nostro apparato in situ non comporta allungamento contrazioni, anzi, ci permette di isolare, allineare correttamente, e misurare la tensione massima prodotta da un muscolo individuale a una lunghezza nota. Figura 4 mostra la progressiva perdita di forza che si verifica durante una prova di fatica in un muscolo tibiale anteriore di un topo. In questo esempio particolare, le contrazioni titanico sono stati eseguiti una volta al secondo per 5 minuti. Tensione (forza) è tipicamente registrato in Newton (o grammi), ma come coppia, il valore assoluto dipende dalle dimensioni e dalle condizioni dell&#39;animale. Perché il peso muscolare si ottiene immediatamente dopo questa procedura, la forza può essere normalizzata (chiamata &quot;forza specifica&quot;) a sezione trasversale del muscolo. La Figura 5 mostra i dati rappresentativi in imaging in vivo di un mouse, ad esempio T1 pesate e T2 mappatura parametrica (A), trattografia 3D imaging del tensore di diffusione (B), 1 H spettroscopia (C), e 31 spettroscopia P. Ulteriori dettagli sono disponibili nella leggenda figura. <img src="/files/ftp_upload/2782/2782fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1: in apparato vivo .* Per produrre il pregiudizio, la tibia è stabilizzato e il piede attaccato ad un motore piatto. Le dorsali della caviglia sono stimolati attraverso il nervo peroneale, mentre la pedana costringe il piede in flessione plantare (freccia tratteggiata). * Lovering &amp; De Deyne, Biomeccanica J 2005, usato con permesso. <img src="/files/ftp_upload/2782/2782fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2: In apparato situ La cella di carico è montato un micromanipolatore in modo che il TA può essere regolata in lunghezza di riposo e allineati correttamente nel X, Y e Z. Il tendine distale del TA è collegato alla cella di carico e contrazioni singole sono indotte a lunghezze muscolari differenti per determinare L 0. Una contrazione tetanica massima si ottiene per determinare la massima attivazione contrattile (P 0). Massima tensione tetanica può essere eseguito più volte ed espressi come percentuale di P 0, fornendo un indice di fatica in un punto desiderato per tempo. 782/2782fig3.jpg &quot;alt =&quot; Figura 3 &quot;/&gt; Figura 3: i dati in coppia da registrazioni rappresentante apparato traccia vivo di coppia da allungamento contrazioni nel ratto. In questo esempio particolare, i muscoli sono stimolati per 200 millisecondi per indurre una contrazione isometrica di picco (freccia piena) prima di allungamento (freccia aperta) dalla pedana attraverso un arco di 70 ° di movimento ad una velocità angolare di 900 ° / s. <img src="/files/ftp_upload/2782/2782fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4: dati di tensione da dati in situ rappresentante apparato che mostra il declino della massima tensione isometrica tetanica durante la stimolazione ripetuta del muscolo tibiale anteriore (TA) in un topo. In questo esempio, il TA è stato isolato, corretto per la lunghezza ottimale (L 0), poi stimolati con una contrazione di 200 ms tetanica una volta al secondo per 5 minuti. <img src="/files/ftp_upload/2782/2782fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5: imaging in vivo A: le immagini mostrano trasversale (assiale) sezioni di pesata in T1 e T2 mappatura parametrica dal muscolo tibiale anteriore (TA). La casella tratteggiata rossa circonda la TA per mostrare un aumento maggiore T2 nel feriti (lato sinistro) rispetto indenne (lato destro) B:.. Rappresentante trattografia 3D imaging del tensore di diffusione (DTI) C: Il 1 H spettro di un TA del mouse mostra diverse risonanze rilevabile lipidi; differenziazione tra intramyocellular (IMCL) e extramyocellular lipidi (EMCL) picchi si ottiene con questo metodo D: Il P 31 MR spettro del TA ratto mostra fosfocreatina (PCr), fosfato inorganico (Pi), e le tre. risonanze (α, β, γ) di adenosina 5&#39;-trifosfato (ATP).

<ol>
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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

&quot;Danno muscolare&quot; è stato definito e misurato in molti modi. Danni strutturali è evidente in reperti istologici 6,9, ma un problema con molti dei marcatori biologici per valutare lesioni muscolari, compresi quelli utilizzati in studi su animali, è che di solito non sono correlati con la perdita della forza. Danno muscolare è spesso definite nel contesto del test utilizzato per esaminare e trovare nessuno può spiegare le variazioni di contrattilità dopo l&#39;infortunio. Dal piena funzione cont...

(Tutto l&#39;equipaggiamento è lo stesso per topi e ratti ad eccezione della pedana) <ul><li> BUD Value Line Cabinet (Newark, 06M4718) </li><li> Multifunzione l / O USB-6221M (National Instruments, 779808-01) </li><li> Stepper motor controller (Newark, 16M4189) </li><li> Stepper Motor (Newark, 16M4198) </li><li> Amplificatore Strain Gauge (Honeywell, Sensotec, DV-05) </li><li> Sensore di coppia (Honeywell, QWLC-8M) </li><li> Pedana e dispositivo di stabilizzazione (su misura, in attesa di brevetto) </li></ul>

an in vivo rodent model of contraction-induced injury and non-invasive monitoring of recovery

Tensioni muscolari sono uno dei disturbi più comuni trattati dai medici. Una lesione muscolare è di solito diagnosticata dalla storia del paziente e esame fisico da solo, ma la presentazione clinica può variare notevolmente a seconda della entità del danno, tolleranza al dolore del paziente, ecc Nei pazienti con lesioni muscolari o malattia muscolare, la valutazione del danno muscolare è in genere limitata ai segni clinici, come la tenerezza, la forza, la gamma di movimento e, più recentemente, studi di imaging. Marcatori biologici, come i livelli sierici di creatina chinasi, sono in genere elevata con lesioni muscolari, ma i loro livelli non sono sempre correlate con la perdita di produzione di forza. Questo è ancora vero di reperti istologici da animali, che forniscono una &quot;misura diretta&quot; del danno, ma non tengono conto di tutti la perdita della funzione. Alcuni hanno sostenuto che la misura più completa della salute generale del muscolo in forza contrattile. Perché il danno muscolare è un evento casuale che si verifica in una varietà di condizioni biomeccaniche, è difficile da studiare. Qui, descriviamo un modello in vivo su animali per misurare la coppia e per la produzione di un infortunio muscolare affidabile. Abbiamo anche descrivere il nostro modello di misurazione della forza di un muscolo isolato in situ. Inoltre, si descrive la nostra procedura di piccoli animali risonanza magnetica.

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An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

Un<em&gt; In vivo</emModello animale&gt; di lesioni è descritta. Il metodo sfrutta la posizione sottocutaneo del nervo peroneale. Velocità, tempi di attivazione muscolare, e arco di movimento sono tutti pre-determinato e sincronizzati con il software commerciale. Cambiamenti lesioni post sono monitorati<em&gt; In vivo</em&gt; Utilizzando RM / spettroscopia.

Un In vivo Modello di roditore della contrazione indotta Lesioni e monitoraggio non invasivo di recupero

Muscle strains are one of the most  common complaints treated by physicians. A muscle injury is typically diagnosed from the patient history and  physical ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

13.7K Views.  University of Maryland School of Medicine. Un In vivo di lesioni è descritta. Il metodo sfrutta la posizione sottocutaneo del nervo peroneale. Velocità, tempi di attivazione muscolare, e arco di movimento sono tutti pre-determinato e sincronizzati con il software commerciale. Cambiamenti lesioni post sono monitorati In vivo Utilizzando RM / spettroscopia.