DPS acknowledges past and present support in part from grant #2665 and #2934, respectively, from the PVA Research Foundation. PKS is an Alberta Innovates &#8211; Health Solutions Scientist, operating funds were provided by the Leblanc Chair for Spinal Cord Research, University of Calgary.

NOTA: Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida stabilite dal comitato Animal Istituzionale Cura e uso presso l&#39;Università di Louisville, in osservanza delle disposizioni federali. 1. Preparazione di Low Ca 2+ e 2 mM Ca 2 + artificiale liquido cerebrospinale (aCSF) Perfusates <ol><li> Preparare 2x bassa Ca 2+ (0,1 mM) Stock tampone C, 2x normale Ca 2+ (2 mM) Stock Un buffer, e tampone 2x Archivio B come descritto nella Tabella 1. Le singole soluzioni stock consentono modifica del contenuto di ioni (ad esempio, basso o nullo Ca 2+) e può essere conservato a 4 ° C per un mese. </li><li> Per intracardiaca perfusione durante la dissezione, aggiungere 100 ml di 2x basso Ca 2+ della C e 100 ml di 2x Fotografico B in una bottiglia di plastica per rendere basso Ca 2+ 1x aCSF. Mescolare e conservare una notte a 4 ° C o fare fresco. </li><li> Per perfusione ex vivo del midollo spinale durante imagING, aggiungere 500 ml di 2x normale Ca 2+ Stock A e 500 ml di 2x Fotografico B in una bottiglia di vetro da 1 L per generare 1x aCSF. Mescolare e conservare notte a temperatura ambiente o fare fresco. </li><li> Aggiustare il pH del buffer ACSF a 7,4. Mantenendo la aCSF a temperatura ambiente, collocare il basso Ca 2+ aCSF su ghiaccio e poi bolla entrambi i buffer con gas carbogeno (95% O 2; 5% CO 2) per 30 minuti prima dell&#39;uso e continuamente durante la perfusione. </li></ol> 2. Preparazione di Ex Vivo Imaging Camera <ol><li> Avvolgere una coperta di riscaldamento (senza spegnimento automatico) intorno alla bottiglia aCSF e regolare la fiamma al minimo l&#39;impostazione / media. </li><li> Inserire una linea di perfusione aCSF dedicata nella bottiglia collegata ad una pompa di perfusione e in linea riscaldatore che è controllata da una sonda bipolare regolatore di temperatura e retroazione della temperatura, come mostrato nella Figura 1A. </li><li> Fissare un microscopio piatta inserto fase (152 x 102 mm) per la 2-fotoni di eccitazione / confpalco microscopio Ocal dotato di un contenitore di fuoriuscita. </li><li> Mettere un grande camera di perfusione open-bagno (W x L x H; 12 x 24 x 8 mm) nel contenitore fuoriuscita di accogliere e fornire un flusso continuo di fresco ossigenato aCSF al midollo spinale ex vivo (vedi Figura 1B per un ex adeguato Vivo l&#39;imaging disegno della camera). </li><li> Collegare la porta di uscita del metallo del riscaldatore in linea alla camera di ex vivo di immagini utilizzando tubi adatti. Inserire un tampone assorbente sottile sotto della camera ex vivo imaging per aiutare a mantenere la temperatura del buffer / tessuto durante l&#39;imaging. </li><li> Rispettare la camera di ex vivo imaging per il fondo dell&#39;inserto container fuoriuscita / stage con tack appiccicoso rimovibile. La malleabilità del tack appiccicoso consentirà la camera da regolare come necessario per garantire percorso ottico del obiettivo è perpendicolare alla superficie del tessuto. Se necessario, utilizzare un livello Bullseye per regolare la camera. </li><li> Fissare unsonda in linea risposte riscaldatore temperatura vicino alla camera di ingresso del fluido e un tubo di aspirazione in acciaio inox collegato ad una linea di vuoto all&#39;uscita della camera. Supporti a nastro magnetico e appropriato micropipetta sono utili in questo senso. Accendere la sorgente di vuoto. </li><li> Accendere la pompa di perfusione per iniziare a riempire la camera di imaging con aCSF ossigenato. Impostare la pompa di perfusione a 1,5-2 ml al minuto. </li><li> Controllare il volume del aCSF nella camera di imaging regolando la linea del vuoto. È importante che vi sia sufficiente aCSF nella camera di imaging per coprire il segmento del midollo spinale e permettere sufficiente distanza di lavoro tra un obiettivo immersione acqua e la superficie del tessuto. La mielina e gli assoni possono essere negativamente influenzate se il segmento di tessuto non è completamente immerso in fresco ossigenato aCSF porta artefatti per sperimentatore-indotte. </li><li> Regolare il regolatore di temperatura del riscaldatore in linea in modo che la temperatura perfusato nella camera di imaging è temperatura ambiente. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Dissezione di adulti Murine cervicale del midollo spinale <ol><li> Euthanize un adulto 6-10 settimane di età Thy1 -YFP topo transgenico (uso ceppo appropriato che ha l&#39;espressione della proteina fluorescente in radice dorsale neuroni gangliari) iniettando una dose eccessiva del pentobarbital sodico anestesia (200 mg / kg) mediante iniezione intraperitoneale. </li><li> Una volta sotto il corretto livello di anestesia (per esempio, nessuna reazione a pizzico punta e perdita di riflesso corneale), barba accuratamente la pelle sovrastante il midollo spinale e il cervello con i tagliatori chirurgici. Detergere la pelle con betadine e il 70% pastiglie etanolo. </li><li> Spray al torace / addome con il 70% di etanolo, quindi profumato il soggetto transcardiaca utilizzando refrigerata, CarboGen-bolle basso Ca 2+ aCSF. (Vedi Figura 1C per il banco di dissezione suggerito top istituito). </li><li> Come il fegato impallidisce, fissare l&#39;ago perfusione nel cuore con un piccolo clip. Girare il soggetto sopra per accedere al lato dorsale rasata diil soggetto e pulire la zona rasata con il 70% di etanolo. </li><li> Fare un incisione cutanea dorsale lungo la linea mediana a partire dal naso all&#39;hip con le forbici dissezione per esporre il cervello e la colonna vertebrale (Figura 2A). Fissare la preparazione mettendo perni al naso e anca. </li><li> Utilizzando un microscopio di dissezione da questo punto in poi, saldamente tagliare attraverso la superficie dorsale del cranio a livello dei bulbi olfattivi. Inserire una delle punte forbice nei bordi laterali della incisione e taglio lungo i bordi della calotta cranica bilateralmente fino cervelletto. NOTA: Non accise completamente la calotta cranica, come è necessario in seguito a sollevare il tessuto sovrastante dal midollo spinale durante la dissezione (Figura 2B). </li><li> Sollevare la calotta cranica per esporre il cervello. Tagliare delicatamente i bordi destro e sinistro del midollo interparietale (situato il cervelletto) e tirarlo indietro caudale per esporre il tronco cerebrale / midollo spinale (Figura 2C </strong&gt;). </li><li> Usare le forbici fine punta terranno a un angolo di 45 ° rispetto alla superficie della tavola e tagliare le vertebre bilateralmente appena inferiore alle radici nervose posteriori. NOTA: Evitare il contatto con le colonne dorsali bianche luminose. Queste fibre sono quelli che verranno immagine (Figura 2D) e possono essere facilmente danneggiati. </li><li> Sollevare la superficie zucchetto e dorsale della colonna vertebrale, con pinza sottile a punta, tirando delicatamente il tessuto sovrastante in un unico pezzo, come i tagli sono fatti per esporre il midollo spinale. Continuare a tagliare vertebre al livello superiore del torace per isolare un segmento 1-2 cm del midollo cervicale per la successiva formazione immagine (figura 2E). </li><li> Usare le forbici per tagliare il parallelo di tessuto / ossea alla colonna vertebrale e dei tessuti chiari sotto la colonna. Rendere questi tagli come livello possibile. È molto importante che il tessuto sia piatto nella camera in modo che il cavo sia in piano per l&#39;imaging. </li><li> Utilizzare un # 11 bisturi al transetto del tronco cerebrale (oltre ilterminazione delle fibre fasciculus gracili) ea livello toracico superiore per isolare il segmento midollo spinale cervicale (vedere Figura 2F). Usare le forbici per tagliare il tessuto / ossea a questi stessi due punti. Il tessuto isolato dovrebbe contenere i 2/3 della colonna vertebrale, che comprende il tronco cerebrale caudale, l&#39;allargamento cervicale, e del midollo spinale toracico superiore (Figura 2G). </li><li> Porre la colonna vertebrale isolato in una scatola Petri di CarboGen-bollito, raffreddato a basso Ca 2+ aCSF. Se necessario, tagliare il tessuto sotto la colonna vertebrale fino a adagiata nel piatto. </li><li> Trasferire la colonna vertebrale isolata alla camera di imaging ex vivo e aumentare gradualmente la temperatura perfusato più di 1 ora a 36-37 ° C. Mantenere questa temperatura durante l&#39;imaging. </li></ol> 4. Posizionamento di Ex Vivo midollo spinale in Imaging Camera e mielina Etichettatura con Nile Red <ol><li> Fissare adeguatamente la colonna vertebrale in iCamera Maging con un appropriato fetta raccordo tenere premuto modificata con una piattaforma griglia verticale costituita da fili sottili Lycra (rimuovere le discussioni centrali della piattaforma di rete per consentire lo spazio per il midollo spinale; vedi Figura 3A). </li><li> Scongelare una aliquota di Nile Red (5 stock mM in DMSO e 0,22 micron filtrato; possono essere memorizzate per 1 mese a 4 ° C, o 6 mesi a -20 ° C al buio). Appena prima di aggiungere Nilo Red alla camera di imaging, ridurre la portata della pompa di perfusione e regolare la linea del vuoto per assicurare il fluido nella camera comprende sempre il midollo spinale. </li><li> Aggiungere 5-10 ml di soluzione madre Nile Red alla camera di imaging verso la fine caudale del cavo (Figura 3B). Utilizzare una pipetta 1 ml di mescolare delicatamente Nile Red in tutta la camera. Lasciare Nile Red di rimanere in camera per 1-2 minuti, quindi inserire la linea del vuoto indietro e regolare la pompa di perfusione a 1,5-2 ml al minuto di perfusione continuamente il midollo spinale. </li><li> Sollevare con cautela palco microscopioe allineare l&#39;obiettivo con il centro del segmento del midollo spinale e medialmente sulle colonne dorsali finché l&#39;obiettivo ad immersione acqua è circa 10 mm dalla superficie del aCSF nella camera. Usate il microscopio volante fuoco revolver per portare lentamente l&#39;obiettivo verso il basso fino a toccare leggermente la superficie del aCSF. Utilizzare una sorgente luminosa epifluorescente concentrare le colonne dorsali nel campo di vista (Figura 3C). </li></ol> 5. Ex Vivo Imaging del cavo del mouse spinale con TPLSM e laser-indotta Spinal Cord Injury (Lisci) NOTA: La vena posteriore fornisce un marcatore utile per centrare il tessuto come le fibre Fasciculus gracili (provengono dal corpo cellulare dei gangli spinali e salire da T6 e sotto lungo la linea mediana del midollo spinale) in parallelo con questo vaso sanguigno. Le spesse YFP + cervicale proiezioni radici dorsali forniscono anche un indicatore utile come fibre salire e scendere lateralmente alla YFibre FP + Fasciculus gracile che sono più piccoli di diametro. <ol><li> Una volta che il tessuto del midollo spinale è allineato in modo appropriato, passare alla modalità di scansione laser per eseguire l&#39;imaging di base degli ascendenti fasciculus gracile fibre mieliniche. Per eccitare sia YFP e Nilo Red, utilizzare una sorgente laser a due fotoni sintonizzati a 950 nm (~ 17 mW misurata all&#39;uscita di un 25X, 1.1 obiettivo NA) e dicroici appropriate (DM) e filtri passa-banda per isolare l&#39;emissione fluorescente dei fluorofori (usiamo 525/50 DM560, DM640 600/60, 685/70 e, per separare YFP e Nilo rosso al giallo-arancio, rosso e canali estesi, rispettivamente). <ol><li> Se più del 3% degli assoni mostrano sferoidi assonali durante l&#39;imaging di base (30-60 min), eliminare la preparazione a causa di artefatti sperimentatore-indotta. </li></ol></li><li> Indurre un Lisci ingrandendo il campo visivo a 30.3X (per creare un diametro ablazione ~ 20 micron). Tune il laser a 800 nm, e aumentare la potenza del laser a ~ 110 mWil campione. Lasciare 5 completo campo delle scansioni vista laser per garantire le fibre sono completamente recisi. </li><li> Confermare Lisci modificando le impostazioni laser alle impostazioni di imaging (950 nm, 17 MW a campione, 2.08X) e scansionare il tessuto di visualizzare l&#39;ablazione. Verificare il diametro dell&#39;ablazione e che gli assoni ablazione primari sono completamente sezionato (vedere Figura 3D). Utilizzare le impostazioni di time-lapse sul microscopio combinato con z cattura per registrare la risposta dinamica di assoni e mielina per infortunio fino a 8-10 + hr dopo l&#39;infortunio. NOTA: Se l&#39;ablazione è incompleta (cioè, transection incompleta di fibre), scartare la preparazione, la determinazione dei meccanismi di lesioni primarie e secondarie saranno confusi. Inoltre, isolati segmenti del midollo spinale possono essere esposte fino a 24 ore post-Lisci con solo lieve a moderata danno tissutale Lisci-indipendente. </li></ol>

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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+cellular+imaging+of+entire+cortical+columns+in+awake+mice+using+microprisms.">Chronic cellular imaging of entire cortical columns in awake mice using microprisms.</a> Neuron. 80, 900-913 (2013).</li><li>Nimmerjahn, A., Mukamel, E. A., Schnitzer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+behavior+activates+Bergmann+glial+networks.">Motor behavior activates Bergmann glial networks.</a> Neuron. 62, 400-412 (2009).</li><li>Tsutsui, S., Stys, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+injury+to+axons+and+myelin.">Metabolic injury to axons and myelin.</a> Exp Neurol. 246, 26-34 (2013).</li><li>Matute, C., Ransom, B. 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K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axonal+injury:+internodal+nanocomplexes+and+calcium+deregulation.">Mechanisms of axonal injury: internodal nanocomplexes and calcium deregulation.</a> Trends Mol Med. 16, 160-170 (2010).</li><li>Wang, H., Fu, Y., Zickmund, P., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+anti-stokes+Raman+scattering+imaging+of+axonal+myelin+in+live+spinal+tissues.">Coherent anti-stokes Raman scattering imaging of axonal myelin in live spinal tissues.</a> Biophys J. 89, 581-591 (2005).</li><li>Beirowski, B., Nogradi, A., Babetto, E., Garcia-Alias, G., Coleman, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+axonal+spheroid+formation+in+central+nervous+system+Wallerian+degeneration.">Mechanisms of axonal spheroid formation in central nervous system Wallerian degeneration.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 69, 455-472 (2010).</li><li>Shi, R., Asano, T., Vining, N. C., Blight, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+membrane+sealing+in+injured+mammalian+spinal+cord+axons.">Control of membrane sealing in injured mammalian spinal cord axons.</a> J Neurophysiol. 84, 1763-1769 (2000).</li><li>Stirling, D. P., Cummins, K., Wayne Chen, ., R, S., Stys, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axoplasmic+reticulum+Ca(2+)+release+causes+secondary+degeneration+of+spinal+axons.">Axoplasmic reticulum Ca(2+) release causes secondary degeneration of spinal axons.</a> Ann Neurol. 75, 220-229 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Descriviamo un metodo dell&#39;imaging ex vivo midollo spinale assoni mielinizzati (cioè, fasciculus gracile) combinata con una lesione del midollo spinale indotta da laser per studiare la progressione dinamica sia degenerazione assonale mieliniche primaria e secondaria nel tempo. Ex vivo immagini della superficie di midollo spinale supera molte delle complicazioni associate con l&#39;imaging in vivo come artefatti di movimento e il potenziale di ipossia sperimentatore indotta durant...

La degenerazione degli assoni è una causa importante di morbilità abbracciano diverse condizioni neurologiche tra cui neurotrauma, ictus, autoimmuni e malattie neurodegenerative. A differenza del sistema nervoso periferico (PNS), sistema nervoso centrale (SNC) assoni hanno una limitata capacità di rigenerare volta feriti causa sia barriere intrinseche ed estrinseche (cioè, molecole inibitrici della crescita assonale prodotti durante la formazione di cicatrici e liberato durante mielina degenerazione) 1 -7. Sebbene molti di questi ostacoli sono stati ampiamente esplorato, interventi terapeutici mirati per prevenire CNS degenerazione assonale, promuovere la rigenerazione assonale robusto, e ripristinare connectively funzionale, restano limitati. Gli assoni una volta separati dal loro soma subiscono un processo di degenerazione stereotipata nota come degenerazione walleriana che è caratterizzata da gonfiore assonale, formazione sferoidale ed eventuale frammentazione (rivisto in 8). Incontrasto, il moncone prossimale che rimane in continuità con la soma di un assone periferiche transected, forma una tumefazione alla sua estremità, muore al nodo più vicino di Ranvier, e può quindi avviare la crescita formazione cono, un prerequisito vitale necessario per la successiva rigenerazione assonale 9-11. Al contrario, le terminazioni degli assoni prossimali di molti assoni centrali caratteristica forma &quot;endbulbs&quot; o lampadine retrazione, non riescono a formare coni di crescita, e invece rientrare dal sito della lesione dove rimangono per mesi dopo l&#39;infortunio 12-15. Oltre al danno assonale primario, ulteriore danno assonale / perdita può verificarsi anche a assoni che sono stati in gran parte risparmiata dalla lesione iniziale. Questa perdita assonale ritardato di assoni inizialmente risparmiati viene definita degenerazione assonale secondaria. Questa risposta inerente assoni del SNC al danno rende la rigenerazione assonale funzionale un obiettivo ancora più difficile da raggiungere nel cervello e nel midollo spinale. Anche se hallmarks di danno assonale (ad esempio, la formazione sferoide, lampadine di svincolo) sono state ben caratterizzate da tessuti post mortem e modelli sperimentali di degenerazione assonale, studio dei meccanismi molecolari alla base di questi processi dinamici è stato limitato. La maggior parte di questi studi si è basata su osservazioni endpoint statiche che non hanno di per sé di catturare singole risposte assonale nel tempo. Anche se esogeno applicate traccianti assonali sono stati utili a chiarire le risposte assoni dalle sezioni statiche e durante l&#39;imaging dal vivo, la disponibilità di marcatori assonale geneticamente codificati ha notevolmente migliorato la nostra capacità di visualizzare assoni in tempo reale utilizzando la microscopia a fluorescenza. Infatti, un rapporto seminale da Kerschensteiner e colleghi prima ha fornito prova diretta di degenerazione assonale e rigenerazione in vivo utilizzando topi Thy1 GFP-S che codificano la proteina fluorescente verde in sottoinsiemi di neuroni che inviano le loro proiezioni nelle colonne dorsali del midollocavo 16. Immagini dal vivo utilizzando due approcci microscopia a scansione laser fotoni (TPLSM) e l&#39;etichettatura proteina fluorescente genetico delle cellule di interesse continua a fornire prove dirette e comprensione meccanicistica in molti diversi processi dinamici come la degenerazione assonale, Ca 2+ segnalazione, la rigenerazione assonale, astrociti fisiologia, la fisiologia della microglia, e la risposta al danno 17-25. In contrasto con gli assoni, si sa molto poco di risposte mielina al danno in tempo reale. La mielina è una componente vitale della materia bianca prodotta e mantenuta da oligodendrociti nelle cellule del sistema nervoso centrale e di Schwann nel PNS. Mielina isola 99% della superficie di assoni e così facendo fornisce una elevata resistenza, bassa capacità rivestimento protettivo che supporta rapida ed efficiente propagazione dell&#39;impulso saltatory, recentemente da Buttermore et al. 26. Per catturare la risposta dinamica di mielina al danno si usa il solvatochromic, lipofilacolorante fluorescente Nile Red 27. Le proprietà solvatochromic di questa macchia vitale permettono spostamenti spettrali del suo spettro di emissione che dipende sull&#39;ambiente fisico-chimica 28,29. Queste proprietà sono utili al fine di conoscere i meccanismi di danno axomyelinic e può essere osservata con dicroici adeguatamente selezionati e filtri di emissione o risolti usando la microscopia spettrale 27. Ad esempio, lo spettro di emissione di Nile Red è blu-spostata in ambienti meno polari, ricchi di lipidi, come quelli trovati in adipociti e normale mielina del SNC (picco di emissione ~ 580-590 nm) 27. Al contrario, i picchi dello spettro di emissione di questo colorante vitale a ~ 625 nm in endbulbs formate da assoni subiscono deperimento assonale 27. Anche se il preciso meccanismo questi spostamenti spettrali specificamente in endbulbs rispetto mielina normale rimangono poco chiari, tali cambiamenti spettrali possono rivelare le alterazioni alla base di accumulo di proteine ​​o la disorganizzazione che porta aesposizione dei idrofobiche siti di legame di 27. Mentre l&#39;imaging in vivo è la metrica fondamentale per l&#39;osservazione del midollo spinale dinamiche danno assonale nel loro ambiente nativo, è tecnicamente impegnativo e richiede competenza chirurgica notevole, e spesso ripetere ambulatori per esporre la colonna dorsale che può introdurre artefatti sperimentali (ad esempio, l&#39;infiammazione e la cicatrice formazione). Inoltre, le apparecchiature costose è spesso necessario per permettere la sospensione e il posizionamento di un animale intatta sotto la lente obiettivo microscopio. Gli animali devono essere attentamente monitorati e per assicurare che rimangono caldo, al fine di garantire i fluidi sono reintegrati, e per assicurarsi che non ci sono segni di ipossia a causa di sessioni di imaging anestetizzati prolungati. Quest&#39;ultimo è estremamente importante in quanto assoni e mielina assolutamente richiedono perfusione costante e livelli di ossigeno adeguati a rimanere vitale. Tuttavia, questo non è spesso segnalata o monitorato in più studi in vivo perdata. Inoltre, artefatti da movimento a causa della frequenza cardiaca e la respirazione (isoflurano anestetizzati topo adulto: ~ 300-450 battiti al minuto (BPM) è ottimale per mantenere la saturazione di ossigeno 97-98% (tasso normale di ~ 632 BPM) e ~ 55-65 respiri al minuto (tariffa normale è ~ 163 respiri al minuto), rispettivamente)) 30 incontrato durante in vivo del midollo spinale di imaging make differenziare le risposte danno assonale primarie e secondarie con alta risoluzione microscopia a fluorescenza impegnativo come anche le scansioni laser più veloci inevitabilmente sono soggetti a questi movimenti artefatti. I progressi nella ultraveloci scanner di risonanza combinate con un impiantabile vertebrale rigida finestra incorniciate può consentire l&#39;imaging del midollo spinale murino in animali svegli, ma i tempi di scansione più veloce inevitabilmente ridurre il rapporto segnale rumore qualità dell&#39;immagine degradanti. Ulteriori miglioramenti nelle tecniche di imaging del midollo spinale, come attualmente utilizzate per l&#39;imaging cerebrale possono superare molti di questi ostacoli e di limitare le potenziali confonde introdotte dal inaperfusione tissutale dequate, ad esempio, 31-33. Molto di ciò che si conosce della sostanza bianca fisiologia e meccanismi di danno sostanza bianca è stato determinato utilizzando in vitro o ex vivo preparazioni di sostanza bianca dal nervo ottico, nervo periferico, e le strisce di midollo spinale sostanza bianca 34-41. Queste preparazioni continuano ad avanzare la nostra conoscenza dei meccanismi di lesioni bianche importa quanto consentono cambiamenti di fattori ambientali, controllata di farmaci e reagenti, valutazioni funzionali utilizzando elettrofisiologia, e dirette osservazioni microscopia a fluorescenza di assoni e mielina nel tessuto vivo controllati. Eppure, alcuni approcci precedenti per osservare assoni da midollo spinale strisce colonna dorsale o strisce di sostanza bianca ventrale inevitabilmente ferire assoni superficie durante la fase di rimozione che possono influenzare la risposta degli assoni strettamente opposti. Per capitalizzare le manipolazioni sperimentali di cui sopra e di evitare danni alla vefibre Ry sotto inchiesta, usiamo un modello del midollo spinale cervicale ex vivo in quanto impedisce il contatto diretto della parte dorsale del cavo. Così, l&#39;architettura della pia madre e adiacenti dorsali superficiali assoni colonna rimangono vitali e imperturbato durante l&#39;isolamento. Qui si descrive un approccio relativamente semplice che permette la visualizzazione diretta di assoni mielinizzati centrali come rispondono dinamicamente a una lesione focale in tempo reale fino a 8 - 10+ ore dopo l&#39;infortunio. La lesione del midollo spinale (Lisci) Modello indotta da laser consente la differenziazione tra i meccanismi di danno assonale primarie e secondarie, come la lesione primaria (sito di ablazione) rimane spazialmente vincolate nel tempo. La camera di imaging open-bagno è accessibile a un intervento terapeutico, la consegna dei reagenti, e manipolazioni ambientali. Agenti protettivi axomyelinic putativi possono essere rapidamente valutati in tempo reale da osservazioni dirette contro gli esperimenti lunghi e costosi che coinvolgono processi tessutoING, sezionamento, immunostaining, l&#39;acquisizione di immagini, e l&#39;analisi e quindi fornisce un modello utile surrogato per valutare le risposte acute e manipolazioni di protezione prima di testare gli agenti sperimentali di animali vivi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="968">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Material/ Equipment</td>
			<td style="width:139px;">Company</td>
			<td style="width:113px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:341px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Large bath chamber with slice supports</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>RC-27L</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Standard Slice Supports</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SS-3</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Plastic Slice hold-down for RC-27L and RC-29 chambers</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SHD-27LP/10</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Suction Tube, Series 20 Classic Design, left handed</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">ST-1L</td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Solution In-line heater/cooler</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>SC-20</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Bipolar temperature controller</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">CL-100</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Liquid Cooling System</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">LCS-1</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Cable assembly for heater controllers</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">CC-28</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Replacement bead thermisitor for CC-28 cable</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:113px;">TS-70B</td>
			<td>To regulate perfusate temperature during imaging</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Magnetic holder with suction tubing</td>
			<td style="width:139px;">Bioscience Tools</td>
			<td style="width:113px;">MTH-S</td>
			<td>To hold the stainless steel vacuum suction tubing&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">Adjustable holder</td>
			<td style="width:139px;">Bioscience Tools</td>
			<td style="width:113px;">MTH</td>
			<td>To hold the temperature probe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">clear silicone sealant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">superglue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">thin plexiglass strips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For ex vivo imaging chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:376px;">nile red</td>
			<td style="width:139px;">Life Technologies</td>
			<td>N-1142</td>
			<td>For labeling myelin</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an ex vivo laser-induced spinal cord injury model to assess mechanisms of axonal degeneration in real-time

Assoni SNC feriti non riescono a rigenerarsi e spesso ritrarre lontano dal luogo di ferita. Gli assoni risparmiati dalla lesione iniziale possono poi subire una degenerazione assonale secondaria. La mancanza di formazione cono di crescita, la rigenerazione, e la perdita di ulteriori proiezioni assonale mieliniche all&#39;interno del midollo spinale limita notevolmente il recupero neurologico dopo un trauma. Per valutare come centrale mielinizzati assoni del midollo spinale rispondono al danno, abbiamo sviluppato un modello ex vivo che vive midollo spinale utilizzando topi transgenici che esprimono la proteina giallo fluorescente in assoni e una focale e lesioni del midollo spinale indotta da laser altamente riproducibile per documentare il destino di assoni e mielina (colorante fluorescente lipofila Nile Red) nel tempo utilizzando la microscopia a due fotoni di eccitazione time-lapse. Processi dinamici come lesioni acute assonale, retrazione assonale e mielinica degenerazione sono meglio studiati in tempo reale. Tuttavia, la natura non-focale delle lesioni basate contusione-e artefatti da movimento rilevatodurante in vivo del midollo spinale di imaging make differenziare le risposte danno assonale primarie e secondarie con alta risoluzione microscopio impegnativo. Il modello in vivo ex midollo spinale descritto qui imita alcuni aspetti di rilevanza clinica contusione / patologie assonale compressione indotta tra cui gonfiore assonale, formazione sferoide, transezione assonale, e peri-assonale gonfiore fornendo un modello utile per studiare questi processi dinamici in tempo reale. I principali vantaggi di questo modello sono eccellenti risoluzione spazio-temporale che permette la differenziazione tra l&#39;insulto primario che danneggia direttamente gli assoni e dei meccanismi di lesioni secondarie; infusione controllata di reagenti direttamente al bagno perfusato il cavo; alterazioni precise del milieu ambientale (ad esempio, il calcio, ioni sodio, noti collaboratori di danno assonale, ma vicino impossibile da manipolare in vivo); e modelli murini offrono anche un vantaggio in quanto forniscono la possibilità di visualizzare emanipolare popolazioni di cellule geneticamente identificati e strutture cellulari. Qui, descriviamo come isolare e immagine vivente midollo spinale di topi per catturare dinamiche di danno assonale acuta.

Dettagli di un laboratorio appropriata stabilita necessarie per isolare, mantenere la vitalità, e l&#39;immagine del midollo spinale ex vivo è mostrato in Figura 1. Il microscopio deve essere dotato di un laser pulsato a femtosecondi accordabile, dicroics appropriati e filtri di emissione, e acqua immersione lente obiettivo con un elevato apertura numerica (≥1.0). Per garantire la redditività del midollo spinale durante la dissezione, la procedura deve essere eseguita in presenza di refrig...

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An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Un<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Laser-indotta Spinal Cord Injury modello per valutare i meccanismi di degenerazione assonale in tempo reale

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

an-ex-vivo-laser-induced-spinal-cord-injury-model-to-assess

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

10.8K Views.  University of Louisville. We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability. 

Video: An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Lateral Fluid Percussion: Model of Traumatic Brain Injury in Mice

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and mortality. Based on the nature of primary injury following TBI, complex and heterogeneous secondary consequences result, which are followed by regenerative processes 1,2. Primary injury can be induced by a direct contusion to the brain from skull fracture or from shearing and stretching of tissue causing displacement of brain due to movement 3,4. The resulting hematomas and lacerations cause a vascular response 3,5, and the morphological and functional damage of the white matter leads to diffuse axonal injury 6-8. Additional secondary changes commonly seen in the brain are edema and increased intracranial pressure 9. Following TBI there are microscopic alterations in biochemical and physiological pathways involving the release of excitotoxic neurotransmitters, immune mediators and oxygen radicals 10-12, which ultimately result in long-term neurological disabilities 13,14. Thus choosing appropriate animal models of TBI that present similar cellular and molecular events in human and rodent TBI is critical for studying the mechanisms underlying injury and repair.
Various experimental models of TBI have been developed to reproduce aspects of TBI observed in humans, among them three specific models are widely adapted for rodents: fluid percussion, cortical impact and weight drop/impact acceleration 1. The fluid percussion device produces an injury through a craniectomy by applying a brief fluid pressure pulse on to the intact dura. The pulse is created by a pendulum striking the piston of a reservoir of fluid. The percussion produces brief displacement and deformation of neural tissue 1,15. Conversely, cortical impact injury delivers mechanical energy to the intact dura via a rigid impactor under pneumatic pressure 16,17. The weight drop/impact model is characterized by the fall of a rod with a specific mass on the closed skull 18. Among the TBI models, LFP is the most established and commonly used model to evaluate mixed focal and diffuse brain injury 19. It is reproducible and is standardized to allow for the manipulation of injury parameters. LFP recapitulates injuries observed in humans, thus rendering it clinically relevant, and allows for exploration of novel therapeutics for clinical translation 20.
We describe the detailed protocol to perform LFP procedure in mice. The injury inflicted is mild to moderate, with brain regions such as cortex, hippocampus and corpus callosum being most vulnerable. Hippocampal and motor learning tasks are explored following LFP.

Lateral fluid percussion (LFP), an established model of traumatic brain injury in mice, is demonstrated. LFP fulfills three major criteria for animal models: validity, reliability and clinical relevance. The procedure, consisting of surgical craniotomy, fixation of hub followed by induction of injury, resulting in focal and diffuse injuries, is described.

Fluido laterale Percussioni: Modello delle lesioni cerebrali traumatiche nei topi

Traumatic brain injury (TBI) research has attained renewed momentum due to the increasing awareness of head injuries, which result in morbidity and ...

Ricerca

Neuroscienze

DiI-Labeling of DRG Neurons to Study Axonal Branching in a Whole Mount Preparation of Mouse Embryonic Spinal Cord

Here we present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the lipophilic tracer 1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI)1. The comparison of axonal pathways of wild-type with those of mouse lines in which genes are mutated allows testing for a functional role of candidate proteins in the control of axonal branching which is an essential mechanism in the wiring of the nervous system. Axonal branching enables an individual neuron to connect with multiple targets, thereby providing the physical basis for the parallel processing of information. Ramifications at intermediate target regions of axonal growth may be distinguished from terminal arborization. Furthermore, different modes of axonal branch formation may be classified depending on whether branching results from the activities of the growth cone (splitting or delayed branching) or from the budding of collaterals from the axon shaft in a process called interstitial branching2 (Fig. 1).
The central projections of neurons from the DRG offer a useful experimental system to study both types of axonal branching: when their afferent axons reach the dorsal root entry zone (DREZ) of the spinal cord between embryonic days 10 to 13 (E10 - E13) they display a stereotyped pattern of T- or Y-shaped bifurcation. The two resulting daughter axons then proceed in rostral or caudal directions, respectively, at the dorsolateral margin of the cord and only after a waiting period collaterals sprout from these stem axons to penetrate the gray matter (interstitial branching) and project to relay neurons in specific laminae of the spinal cord where they further arborize (terminal branching)3. DiI tracings have revealed growth cones at the dorsal root entry zone of the spinal cord that appeared to be in the process of splitting suggesting that bifurcation is caused by splitting of the growth cone itself4 (Fig. 2), however, other options have been discussed as well5.
This video demonstrates first how to dissect the spinal cord of E12.5 mice leaving the DRG attached. Following fixation of the specimen tiny amounts of DiI are applied to DRG using glass needles pulled from capillary tubes. After an incubation step, the labeled spinal cord is mounted as an inverted open-book preparation to analyze individual axons using fluorescence microscopy.

The stereotyped projections of sensory afferents into the rodent spinal cord offer an easily accessible experimental system to study axonal branching through the tracing of single axons.

DII-Etichettatura di neuroni DRG per studiare Branching assonale in un monte intero Preparazione di Spinal Cord embrionali di topo

Here we  present a technique to label the trajectories of small groups of DRG neurons  into the embryonic spinal cord by diffusive staining using the ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are increasingly viewed as an early feature of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD) and Huntington&#8217;s disease (HD). As yet unclear is the mechanism(s) by which axonal injury is induced. We reported the development of a novel technique to produce biologically active, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) that can be used to trace axonal transport of BDNF. Quantum dot-labeled BDNF (QD-BDNF) was produced by conjugating quantum dot 655 to mBtBDNF. A microfluidic device was used to isolate axons from neuron cell bodies. Addition of QD-BDNF to the axonal compartment allowed live imaging of BDNF transport in axons. We demonstrated that QD-BDNF moved essentially exclusively retrogradely, with very few pauses, at a moving velocity of around 1.06 &#956;m/sec. This system can be used to investigate mechanisms of disrupted axonal function in AD or HD, as well as other degenerative disorders.

Axonal transport of BDNF, a neurotrophic factor, is critical for the survival and function of several neuronal populations. Some degenerative disorders are marked by disruption of axonal structure and function. We demonstrated the techniques used to examine live trafficking of QD-BDNF in microfluidic chambers using primary neurons.

In tempo reale Imaging del trasporto assonale di Quantum Dot-etichettato BDNF in neuroni primari

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after severe damage. Investigating the regeneration pathways in zebrafish might bring new insights to develop innovative strategies for the treatment of retinal degenerative diseases in mammals. Herein, we focused on the induction of a focal lesion to the outer retina in adult zebrafish by means of a 532 nm diode laser. A localized injury allows investigating biological processes that take place during retinal degeneration and regeneration directly at the area of damage. Using non-invasive optical coherence tomography (OCT), we were able to define the location of the damaged area and monitor subsequent regeneration in vivo. Indeed, OCT imaging produces high-resolution, cross-sectional images of the zebrafish retina, providing information which was previously only available with histological analyses. In order to confirm the data from real-time OCT, histological sections were performed and regenerative response after the induction of the retinal injury was investigated by immunohistochemistry.

M&amp;#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

The zebrafish is a popular animal model to study mechanisms of retinal degeneration/regeneration in vertebrates. This protocol describes a method to induce localized injury disrupting the outer retina with minimal damage to the inner retina. Subsequently, we monitor in vivo the retinal morphology and the M&#252;ller glia response throughout retinal regeneration.

Attivazione delle cellule di Glia di Müller in una degenerazione retinica indotta da Laser e un modello di rigenerazione in Zebrafish

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in adult mammalian animals remains elusive. In this study, we describe an experimental procedure for measuring calcium dynamics through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy. This method enables recordings and quantifications of neural activity in bilateral mouse brain regions one at a time in the same experiment for a prolonged period in vivo. Key aspects of this method, which can be completed within an hour, include minimally invasive surgery procedures for creating dual optical windows, and the use of 2P imaging. Although we only demonstrate the technique in the S1 area, the method can be applied to other regions of the living brain facilitating the elucidation of structural and functional complexities of brain neural networks.

Imaging Neural Activity in the Primary Somatosensory Cortex Using Thy1-GCaMP6s Transgenic Mice

We describe an experimental procedure for measuring neuronal activity through dual optical windows above bilateral primary somatosensory corticies (S1) in Thy1-GCaMP6s transgenic mice using 2-photon (2P) microscopy in vivo.

Imaging di attività neurale nella corteccia somatosensoriale primaria utilizzando Thy1-topi transgenici GCaMP6s

The mammalian brain exhibits marked symmetry across the sagittal plane. However, detailed description of neural dynamics in symmetric brain regions in ...

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues throughout the acute injury phase. In fact, endothelial cells appear to be the first to die after a contusive SCI. The early vascular events, including increased permeability of the blood-spinal cord barrier (BSCB), induce vasogenic edema and contribute to detrimental secondary injury events caused by complex injury mechanisms. Targeting the vascular disruption, therefore, could be a key strategy to reduce secondary injury cascades that contribute to histological and functional impairments after SCI. Previous studies were mostly performed on postmortem samples and were unable to capture the dynamic changes of the vascular network. In this study, we have developed an in vivo duo-color two-photon imaging method to monitor acute vascular dynamic changes following contusive SCI. This approach allows detecting blood flow, vessel diameter, and other vascular pathologies at various sites of the same rat pre- and post-injury. Overall, this method provides an excellent venue for investigating vascular dynamics.

An In Vivo Duo-color Method for Imaging Vascular Dynamics Following Contusive Spinal Cord Injury

We introduce an in vivo imaging method using two different fluorescent dyes to track dynamic spinal vascular changes following a contusive spinal cord injury in adult Sprague-Dawley rats.

In Vivo Duo-colore metodo di Imaging vascolare dinamica dopo la lesione del midollo spinale contusivi

Spinal cord injury (SCI) causes significant vascular disruption at the site of injury. Vascular pathology occurs immediately after SCI and continues ...

A Neurosphere Assay to Evaluate Endogenous Neural Stem Cell Activation in a Mouse Model of Minimal Spinal Cord Injury

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied in vitro using the neurosphere assay. This colony-forming assay is a powerful tool to study the response of NSCs to exogenous factors in a dish; however, this can also be used to study the effect of in vivo manipulations with the proper understanding of the strengths and limitations of the assay. One manipulation of the clinical interest is the effect of injury on endogenous NSC activation. Current models of spinal cord injury provide a challenge to study this as the severity of common contusion, compression, and transection models cause the destruction of the NSC niche at the site of the injury where the stem cells reside. Here, we describe a minimal injury model that causes localized damage at the superficial dorsolateral surface of the lower thoracic level (T7/8) of the adult mouse spinal cord. This injury model spares the central canal at the level of injury and permits analysis of the NSCs that reside at the level of the lesion at various time points following injury. Here, we show how the neurosphere assay can be utilized to study the activation of the two distinct, lineally-related, populations of NSCs that reside in the spinal cord periventricular region - primitive and definitive NSCs (pNSCs and dNSCs, respectively). We demonstrate how to isolate and culture these NSCs from the periventricular region at the level of injury and the white matter injury site. Our post-surgical spinal cord dissections show increased numbers of pNSC and dNSC-derived neurospheres from the periventricular region of injured cords compared to controls, speaking to their activation via injury. Furthermore, following injury, dNSC-derived neurospheres can be isolated from the injury site &#8212; demonstrating the ability of NSCs to migrate from their periventricular niche to sites of injury.

Here, we demonstrate the performance of a minimal spinal cord injury model in an adult mouse that spares the central canal niche housing endogenous neural stem cells (NSCs). We show how the neurosphere assay can be used to quantify activation and migration of definitive and primitive NSCs following injury.

Un saggio di Neurosphere per valutare l'attivazione delle cellule staminali neurali endogene in un modello murino di ferita del midollo spinale Minimal

Neural stem cells (NSCs) in the adult mammalian spinal cord are a relatively mitotically quiescent population of periventricular cells that can be studied ...

Activity-based Training on a Treadmill with Spinal Cord Injured Wistar Rats

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) on a treadmill is widely used as a rehabilitation tool in the SCI population with many benefits and improvements to daily life. We utilize this method of activity-based task-specific training (ABT) in rodents after SCI to both elucidate the mechanisms behind such improvements and to enhance and improve upon existing clinical rehabilitation protocols. Our current goal is to determine the mechanisms underlying ABT-induced improvements in urinary, bowel, and sexual function in SCI rats after a moderate to severe level of contusion. After securing each individual animal in a custom-made adjustable vest, they are secured to a versatile body weight support mechanism, lowered to a modified three-lane treadmill and assisted in step-training for 58 minutes, once a day for 10 weeks. This setup allows for the training of both quadrupedal and forelimb-only animals, alongside two different non-trained groups. Quadrupedal-trained animals with body weight support are aided by a technician present to assist in stepping with proper hind limb placement as necessary, while forelimb-only trained animals are raised at the caudal end to ensure no hind limb contact with the treadmill and no weight-bearing. One non-trained SCI group of animals is placed in a harness and rests next to the treadmill, while the other control SCI group remains in its home cage in the training room nearby. This paradigm allows for the training of multiple SCI animals at once, thus making it more time-efficient in addition to ensuring that our pre-clinical animal model mimics the clinical representation as close as possible, particularly with respect to the body weight support with manual assistance.

This protocol demonstrates our model of activity-based locomotor treadmill training for rats with spinal cord injury (SCI). Included is both quadrupedal and forelimb-only groups, in addition to two distinct types of non-trained control groups. Investigators are able to assess training effects on SCI rats using this protocol.

Corsi di formazione basati su attività su un tapis roulant con midollo spinale feriti ratti Wistar

Spinal cord injury (SCI) results in lasting deficits that include both mobility and a multitude of autonomic-related dysfunctions. Locomotor training (LT) ...

Intra-Arterial Delivery of Neural Stem Cells to the Rat and Mouse Brain: Application to Cerebral Ischemia

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to intracranial delivery, intra-arterial administration of NSCs is less invasive and produces a more diffuse distribution of NSCs within the brain parenchyma. Further, intra-arterial delivery allows the first-pass effect in the brain circulation, lessening the potential for trapping of cells in peripheral organs, such as liver and spleen, a complication associated with peripheral injections. Here, we detail the methodology, in both mice and rats, for delivery of NSCs through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) to the ipsilateral hemisphere after an ischemic stroke. Using GFP-labeled NSCs, we illustrate the widespread distribution achieved throughout the rodent ipsilateral hemisphere at 1 d, 1 week and 4 weeks after postischemic delivery, with a higher density in or near the ischemic injury site. In addition to long-term survival, we show evidence of differentiation of GFP-labeled cells at 4 weeks. The intra-arterial delivery approach described here for NSCs can also be used for administration of therapeutic compounds, and thus has broad applicability to varied CNS injury and disease models across multiple species.

A method for delivering neural stem cells, adaptable for injecting solutions or suspensions, through the common carotid artery (mouse) or external carotid artery (rat) after ischemic stroke is reported. Injected cells are distributed broadly throughout the brain parenchyma and can be detected up to 30 d after delivery.

Consegna intra-arteriosa di cellule staminali neurali al cervello di ratto e topo: applicazione all'ischemia cerebrale

Neural stem cell (NSC) therapy is an emerging innovative treatment for stroke, traumatic brain injury and neurodegenerative disorders. As compared to ...

Induction of Complete Transection-Type Spinal Cord Injury in Mice

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, such as cell transplantation methods, are being researched to overcome the debilitating disabilities arising from SCI. Most pre-clinical animal trials are conducted in rodent models of SCI. While rat models of SCI have been widely used, mouse models have received less attention, even though mouse models can have significant advantages over rat models. The small size of mice equates to lower animal maintenance costs than for rats, and the availability of numerous transgenic mouse models is advantageous for many types of studies. Inducing repeatable and precise injury in the animals is the primary challenge for SCI research, which in small rodents requires high-precision surgery. The transection-type injury model has been a commonly used injury model over the last decade for transplantation-based therapeutic research, however a standardized method for inducing a complete transection-type injury in mice does not exist. We have developed a surgical protocol for inducing a complete transection type injury in C57BL/6 mice at thoracic vertebral level 10 (T10). The procedure uses a small tip drill instead of rongeurs to precisely remove the lamina, after which a thin blade with rounded cutting edge is used to induce the spinal cord transection. This method leads to reproducible transection-type injury in small rodents with minimal collateral muscle and bone damage and therefore minimizes confounding factors, specifically where behavioral functional outcomes are analyzed.

This protocol describes how to create a precise laminectomy for induction of stable transection-type spinal cord injury in the mouse model, with minimal collateral damage for spinal cord injury research.

Induzione della lesione completa del midollo spinale di tipo transezione nei topi

Spinal cord injury (SCI) largely leads to irreversible and permanent loss of function, most commonly as a result of trauma. Several treatment options, ...