Ringraziamo il Wistar Institute Animal Facility, strumento di Microscopia, strumento Histotechnology e Supply Research Center. Questo studio è stato finanziato in parte dalle concessioni dal National Institutes of Health CA 076674, 098101 CA, CA 025874 e CA 10815.

1. Tridimensionale pelle umana Ricostruire Modello: <ol><li> Preparazione dello strato acellulare: Mescolare i seguenti reagenti in una provetta da 50 ml su ghiaccio: 0,59 ml Emem 10X, 50 microlitri 200mm L-glutammina, 0,6 mL FBS, 120 microlitri di bicarbonato di sodio 7,5% e 4,6 ml di collagene bovino I. Aggiungere 1 ml di il composto in ogni inserto di piastre di colture di tessuto. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente e permettere al gel di solidificarsi. Colore della miscela dovrebbe essere da giallo paglierino al rosa. </li><li> Trypsinize fibroblasti umani da fiaschi cultura con 0,25% tripsina / EDTA, aggiungere DMEM contenente 10% FBS per neutralizzare. Raccogliere le cellule per centrifugazione e risospendere 0,45 x 10 6 cellule in 1,5 ml con DMEM 10% FBS. Per le cellule staminali cutanee, raccogliere 6600 sfere pelle (quando le cellule staminali cutanee crescono in media di cellule staminali, formano sfere in un modo simile a neurosfere) toccando pallone per staccare le sfere, centrifugazione. </li><li> Preparazione dello strato cellulare: Mescolare le seguenti in un tubo da 50 ml su ghiaccio: 1,65 ml Emem 10X, 150 microlitri 200 mM L-glutammina, FBS 1,85 ml, 350 microlitri di sodio bicarbonato 7,5%, 14 ml di collagene bovino e 1,5 ml di sospensione fibroblasti dal punto 2 (in alternativa, utilizzare combinazione di 0,45 x 10 6 fibroblasti e 6600 sfere cutanea in 1,5 ml di pelle ricostruire media I per le cellule staminali cutanee ricostruisce), mescolare bene. Aggiungere 3 mL di una miscela ad ogni strato acellulare rivestite inserire. Incubare per 45 minuti a 37 ° C in un 5% di CO 2 di coltura tissutale incubatore. Colore della miscela dovrebbe essere dal giallo paglierino al rosa. Dopo che il gel si solidifica, aggiungere DMEM contenente 10% FBS (2 all&#39;interno ml e 10 ml al di fuori di inserire in ciascun pozzetto della pelle ricostruire vassoi). Incubare per 4 giorni e assicurarsi che i contratti di gel. </li><li> Aspirare il terreno sia all&#39;interno che all&#39;esterno di ciascun frutto. Aggiungi lavaggio medio (HBSS con 1% FBS dializzati) 2 ml verso l&#39;interno e 10 ml al di fuori di inserimento al fine di lavare siero normale. Incubare per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Preparazione della pelle ricostruire media: <ol><li> Per le normali cellule staminali melanociti dermici e ricostruisce: Per rendere terreno base (500 ml), mescolare i seguenti reagenti: 490 ml di siero dei cheratinociti privi di media, 1,8 mL di estratto di ipofisi bovina, 10 mL dializzati siero fetale bovino, 500 microlitri di 10 mg / mL SCF, 562,5 ml di 4 microgrammi / ml bFGF e 500 microlitri di 264 mg / ml ET-3. I media: aggiungere 10 ml di EGF 100 mg / ml a 100 ml di mezzo di base. Media II: Aggiungere 2 FEG microlitri a 100 ml di mezzo di base. III media: Aggiungere 720 microlitri CaCl 2 di 1 M a 300 ml di mezzo di base. </li><li> Per la pelle melanoma ricostruire: per fare Medio I (100 ml), mescolare i seguenti reagenti: 72,5 ml di DMEM, 24 ml di F12 (HAM), 2 mL L-glutamina di 200 mm, 200 idrocortisone l di 269 g / ml, 200 ITES l di 500X, 200 ul O-phosphorylethanolamine di 0,05 M, 200 ml di adenina 90 mm, 200 ml di progesterone 2 nM, 240 microlitri CaCl 2 di 1 M, 200 ml di triiodotironina 10 nM e 100 ml di siero di vitello neonato chelexed (sciogliere 3 g di Chelex 100 in 100 ml di siero, mescolare 1,5 ore a 4 ° C, filtro sterilizzare). Per rendere Medio II (100 ml), mescolare i seguenti reagenti: 72,5 ml di DMEM, 24 ml di F12 (HAM), 2 mL L-glutamina di 200 mm, 200 idrocortisone l di 269 g / ml, 200 ITES l di 500X, 200 ul O-phosphorylethanolamine di 0,05 M, 200 ml di adenina 90 mm, 200 ml di progesterone 2 nM, 240 ml di CaCl2 1 M, 200 ml di triiodotironina 10 nM e 100 microlitri di siero di vitello neonato. Per rendere Media III (300ml), mescolare i seguenti reagenti: 142,5 ml di DMEM, 142,5 mL di F12 (HAM), 6 mL di L-glutammina di 200 mm, 600 idrocortisone l di 269 g / ml, 600 ITES ml di 500X , 600 microlitri O-phosphorylethanolamine di 0,05 M, 600 ml di adenina 90 mm, 600 ml di progesterone 2 nM, 720 microlitri CaCl 2 di 1 M, 600 ml di triiodotironina 10 nM e 6 ml di siero di vitello neonato. </li></ol></li><li> Trypsinize cheratinociti umani da fiaschi cultura con 0,05% tripsina / EDTA, neutralizzare tripsina con inibitori della tripsina di soia (250 mg / L in 1x tampone fosfato), spin down, risospendere una cella pellet a 4,17 x10 6 cellule / ml in pelle ricostruire medio I. </li><li> Trypsinize melanociti umani o cellule di melanoma da fiaschi cultura con 0,05% tripsina / EDTA, neutralizzare con inibitori della tripsina di soia tripsina, spin down, risospendere una cella pellet a 0,83 x10 6 cellule / ml in pelle ricostruire medio I. </li><li> Togliere dal lavaggio medio sia all&#39;interno che all&#39;esterno di ciascun frutto. </li><li> Aggiungi pelle ricostruire media I (1,5 ml per l&#39;interno e 10 ml al di fuori di ogni inserto). </li><li> Prendete 600 microlitri della sospensione cellulare di cheratinociti e 600 ml di sospensione cellulare melanociti o cellule di melanoma, mescolare bene. Dispensare 200 ul misti sospensione cellulare goccia a goccia all&#39;interno di ciascun frutto. Per le cellule staminali cutanee ricostruire, utilizzare 100 l di sospensione dei cheratinociti solo. Incubare per 2 giorni a 37 ° C. </li><li> Aspirare pelle ricostruire media Isia da interno e l&#39;esterno di ciascun frutto. Aggiungi pelle ricostruire medio II (2 ml verso l&#39;interno e 10 ml verso l&#39;esterno). Incubare per altri 2 giorni a 37 ° C. </li><li> Aspirare pelle ricostruire medio II dall&#39;interno e l&#39;esterno di ciascun frutto, aggiungere 7,5 mL di ricostruire la pelle III media solo la parte esterna. Da questo punto, la superficie del ricostruisce comincia ad essere esposto all&#39;aria. Cambia III media a giorni alterni fino al giorno 18. </li><li> Vendemmia ricostruire la pelle al giorno 18: <ol><li> Aspirare i media dall&#39;interno e l&#39;esterno degli inserti. </li><li> Rimuovere dal vassoio inserti con una pinza. </li><li> Tagliare la ricostruzione (tra cui il filtro in policarbonato) tracciando un primo cerchio al bordo con una lama di bisturi. </li><li> Tagliare la ricostruzione e il filtro a metà su una superficie dura. </li></ol></li><li> Per le sezioni paraffina: luogo della metà dei ricostruire in una cassetta istologia tra 2 nero TBS carte biopsia e godersi tutta la cassetta in formalina al 10% per più di 4 ore. Poi mettete la cassetta nel 70% di etanolo e conservarlo a 4 ° C fino a quando si è pronti a ricostruire il processo per l&#39;incorporamento di paraffina. </li><li> Per le sezioni congelate: <ol><li> Posizionare l&#39;altra metà di ricostruire nel 50% di saccarosio a 4 ° C per 1-2 ore, quindi modificare il saccarosio a 2M e conservarlo a 4 ° C per altre 1-2 ore. </li><li> Dispensare ottimale di taglio dei media della temperatura di congelamento (OCT) in uno stampo usa e getta di base in modo da riempire circa il 50% della barca. Evitare eventuali bolle in ottobre </li><li> Afferrare il bordo della ricostruire con una pinza e rimuovere la ricostruzione dal saccarosio. Posizionarlo sul Kimwipes fino alla Kimwipes assorbire il saccarosio. </li><li> Trasferire la ricostruzione nello stampo di base in cima alla Ottobre, con pinze e una spatola. Coprire la parte superiore del ricostruire con più fino a ottobre lo stampo di base è completamente pieno. Assicurarsi che non hanno alcun bolle in ottobre che renderà difficile il taglio. </li><li> Mettere lo stampo in modo uniforme sulla base di ghiaccio tritato secco, e permettono di Office di congelare completamente. </li><li> Avvolgete lo stampo di base in carta stagnola e conservarlo a -70 ° C fino al momento di tagliare con un criostato. </li></ol></li><li> Innesto di una pelle ricostruire su un mouse: <ol><li> Preparare un falco tubo da 50 ml con 5 ml di DMEM (per il congelamento e lo scongelamento del mouse pelle). </li><li> Utilizzare una femmina SCID topo senza peli outbred circa 6 settimane. </li><li> Il mouse è anestetizzato con isoflurano (sistema di anestesia EZ): anestesia iniziale viene effettuata nella camera di induzione con il 4% isoflurano (prima del mouse viene spostato al letto chirurgico) e mantenere l&#39;anestesia per un attimo di respiro nosecone durante la procedura (isofluorano: 1,5-2% ). Sostegno di calore da un pad riscaldato per prevenire l&#39;ipotermia e lubrificante oftalmica sterile applicata per evitare lesioni oculari durante l&#39;anestesia. </li><li> Mettere 600 ml di acqua in un bicchiere e lasciare sopra una piastra calda per mantenere la temperatura dell&#39;acqua tra i 40 - 60 ° C. </li><li> Pulire la pelle del mouse con tintura composta di benzoino e tamponi preparazione alcol. </li><li> Tracciare una linea sulla parte superiore del dorso del mouse per mantenere la stessa posizione per la sutura in seguito. </li><li> Tagliare un letto rotondo ferita circa 1,2 cm di diametro sul retro del mouse in alto con le forbici Iris e pinze. Coprire il letto della ferita con garza sterile spugne. Mettete la pelle del mouse rotondo in 5 ml di DMEM, poi lasciare in un contenitore di azoto liquido fino a quando non del tutto congelato. Sbrinare il tubo in acqua calda sopra una piastra calda fino a quando completamente scongelati. Ripetere 3 volte. </li><li> Staccare la pelle ricostruire dal transwell con lama chirurgica e rimuovere la membrana con molta attenzione, il trasferimento di ricostruire la pelle (epidermide lato alto) in cima al letto della ferita. </li><li> Posizionare la pelle del mouse (lato epidermide verso l&#39;alto) sulla parte superiore della pelle ricostruire. </li><li> Effettuare la sutura primo marcatore precedentemente etichettati, la seconda sul fondo, poi due punti di sutura più sui lati per riparare la pelle del mouse. </li><li> Topo pelle pulita dopo l&#39;innesto. Rimuovere dell&#39;ogiva e tenere il mouse sul pad riscaldato fino sveglio e ambulatoriale. </li><li> Mettere il mouse in una nuova gabbia. </li><li> Analgesia post operatoria: Meloxicam (1 mg / kg) per via sottocutanea immediatamente dopo la chirurgia, 24 ore e 48 ore dopo l&#39;intervento. </li></ol></li></ol> 2. Rappresentante dei risultati: Ricostruisce la pelle con normali melanociti e cellule staminali cutanee La pelle ricostruisce sono coltivate in uno speciale di 6 e vassoio con inserti. Il vano dermica è colto in DMEM con 10% FBS per i primi quattro giorni (Fig. 1A). La pelle ricostruire media mi viene utilizzata quando cheratinociti sono seminati con melanociti e cellule di melanoma (Fig. 1B). L&#39;epidermide è esposta all&#39;aria al giorno 9 e questo permette di differenziare cheratinociti (Figura 1C). Al giorno 18, l&#39;epidermide della pelle ricostruisce è composta da strati di cheratinociti stratificata. Lo strato basale indifferenziata e differenziata in sequenza gli strati sono orientati verticalmente (Fig. 1D). MacchiaING la sezione ricostruisce con la melanocitici marcatore S100 dimostra che i melanociti sono allineati nello strato basale dell&#39;epidermide e comunicare con i cheratinociti multipli attraverso le estensioni dendriti (Fig. 1E). Il vano cutanea contiene fibroblasti incorporato in una matrice di collagene di tipo I. Depositata collagene IV indica la membrana basale che separa l&#39;epidermide dal derma (Fig. 1F). Quando le cellule staminali cutanee (marcato con GFP lentivirale vettoriale) sono integrati con fibroblasti in una matrice di collagene I, che migrano verso l&#39;epidermide e differenziarsi in melanociti (1), (Fig. 2). Più livelli di cheratinociti nell&#39;epidermide sono sviluppate. Ricostruisce la pelle del melanoma Gli studi clinico-patologici indicano che il progresso melanomi in maniera graduale: comune acquisito nevi, nevi displastici, RGP (fase di crescita radiale) melanomi, VGP (fase di crescita verticale) e di melanomi metastatici melanomi (7). Diverse fasi di linee cellulari di melanoma sono morfologicamente simili tra loro in 2-D cultura (fig. 3A-D), ma quando vengono incorporati in pelle ricostruisce, il comportamento delle cellule riflette le loro caratteristiche nel vivo. La posizione e il tasso di crescita dei melanociti normali sono strettamente controllati in pelle ricostruisce (Fig. 3E). RGP primarie melanomi WM35 proliferano prevalentemente l&#39;epidermide (Fig. 3F), mentre VGP melanomi WM793 crescere invasivo nel derma (Fig. 3G). Melanomi metastatici 1205Lu aggressivamente invadono in profondità nel derma (Fig. 3H). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig1.jpg" /> Figura 1. Ricostruisce con i melanociti della pelle normale. L&#39;aspetto macroscopico della pelle ricostruisce è mostrato in CA. I fibroblasti A. mescolato con collagene sono coltivate in DMEM contenente 10% FBS vano e la forma dermica. B. cheratinociti e melanociti sono seminati sulla parte superiore del derma e crescere in pelle ricostruire media. C. L&#39;epidermide è esposto all&#39;aria al giorno 9. D. H &amp; E-pelle macchiata ricostruire presenta l&#39;epidermide comprende in senso verticale, orientato strato basale, e sequenzialmente differenziati strati di cellule stratificate. Il derma contiene fibroblasti incorporato in una matrice di collagene di tipo I. E. S100-positivi melanociti (frecce nere) sono allineati alla membrana basale e comunicare con i cheratinociti multipli. F. collagene IV-colorazione indica la membrana basale che separa l&#39;epidermide dal derma. Tutte le colorazioni in DF sono stati eseguiti su fissati in formalina, incluse in paraffina sezioni. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig2.jpg" /> Figura 2. Le cellule staminali dermico della cute ricostruisce migrare verso l&#39;epidermide e differenziarsi in melanociti. Al 5 ° giorno dopo la semina cheratinociti, le cellule GFP-positive singolo (verde) avviare la migrazione fuori dalle sfere. L&#39;epidermide è ancora composto da un singolo strato. Al giorno 8, poche cellule raggiungono l&#39;epidermide-derma interfaccia. Dal giorno 10, GFP-positive le cellule sono strettamente allineati alla posizione membrana basale. La GFP-positive cellule migrate nel marcatore epidermide esprimere melanocitici HMB45 (rosso, come indicato dalle frecce bianche). I nuclei sono colorati con DAPI (blu). L&#39;epidermide è sviluppato come più livelli. La membrana basale è indicato con il bianco linee tratteggiate. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/2937/2937fig3.jpg" /> Figura 3. Ricostruisce la pelle di diversi stadi di melanomi: AD. Melanociti normali e cellule di melanoma cresciute in colture 2D. Melanociti A. prepuzio. B. RGP WM35 cellule. C. VGP WM793 cellule. D. 1205Lu melanoma metastatico delle cellule. E. melanociti normali si trovano a livello della membrana basale. F. RGP melanoma WM35 cellule crescono come gruppi di cellule nell&#39;epidermide. G. VGP melanoma WM793 invadere le cellule nel derma attraverso la membrana basale. H. melanoma metastatico 1205Lu aggressivamente invadere le cellule in profondità nel derma. Risoluzione dei problemi <table border="1"><tbody><tr><td> Problema </td><td> Risoluzione dei problemi </td></tr><tr><td> Miscela di collagene non solidificano </td><td> Miscela dei colori collagene dovrebbe essere giallo paglierino al rosa, altrimenti il ​​pH è sbagliato e collagene non possono gel. Se il colore è giallo brillante, bicarbonato di sodio più deve essere aggiunto goccia a goccia. </td></tr><tr><td> Collagene precipitati prematuramente nel mixuture </td><td> Tenere tutti i componenti su ghiaccio fino a quando la miscela di collagene viene posto sul inserto </td></tr><tr><td> Collagene contratto non è nemmeno (un lato è più spesso l&#39;altro lato) </td><td> Calibrare il ripiano di incubatore </td></tr><tr><td> L&#39;epidermide è formata con meno di tre strati di cheratinociti. </td><td> Usa cheratinociti indifferenziato alle basse vie </td></tr></tbody></table>

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	<li>Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+of+skin+cells+in+3D+rather+than+2D+improves+their+ability+to+survive+exposure+to+cytotoxic+agents.">Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents.</a> J Biotechnol. 122, 372-381 (2006).</li><li>Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life+isn't+flat:+taking+cancer+biology+to+the+next+dimension.">Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 42, 242-247 (2006).</li><li>Sun, T., Norton, D., McKean, R. J., Haycock, J. W., Ryan, A. J., MacNeil, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+3D+cell+culture+system+for+investigating+cell+interactions+with+electrospun+fibers.">Development of a 3D cell culture system for investigating cell interactions with electrospun fibers.</a> Biotechnol Bioeng. 97, 1318-1328 (2007).</li><li>Kremer, M., Lang, E., Berger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypical+engineering+of+differentiated+composite-skin+equivalents+of+human+keratinocytes+in+a+collagen-GAG+matrix+(INTEGRA+Artificial+Skin)+in+a+perfusion+culture+system.">Organotypical engineering of differentiated composite-skin equivalents of human keratinocytes in a collagen-GAG matrix (INTEGRA Artificial Skin) in a perfusion culture system.</a> Langenbecks Arch Surg. 386, 357-363 (2001).</li><li>Esc&#225;mez, M. J., Garc&#237;, M., Larcher, F., Meana, A., Mu&#241;oz, E., Jorcano, J. L., Del R&#237;o, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+model+of+wound+healing+in+genetically+modified+skin-humanized+mice.">An in vivo model of wound healing in genetically modified skin-humanized mice.</a> J Invest Dermatol. 123, 1182-1191 (2004).</li><li>Li, L., Fukunaga-Kalabis, M., Yu, H., Xu, X., Kong, J., Lee, J. T., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dermal+stem+cells+differentiate+into+functional+epidermal+melanocytes.">Human dermal stem cells differentiate into functional epidermal melanocytes.</a> J Cell Sci. 123, 853-860 (2010).</li><li>Meier, F., Nesbit, M., Hsu, M. Y., Martin, B., Van Belle, P., Elder, D. E., Schaumburg-Lever, G., Garbe, C., Walz, T. M., Donatien, P., Crombleholme, T. M., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs:+biological+significance+of+bFGF.">Human melanoma progression in skin reconstructs: biological significance of bFGF.</a> Am J Pathol. 156, 193-200 (2000).</li><li>Yu, H., McDaid, R., Lee, J., Li, L., Kumar, S. M., Elder, D. E., Van Belle, P., Gimotty, P., Guerra, M., Hammond, R., Nathanson, K. L., Dalla Palma, M., Herlyn, M., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+BRAF+mutation+and+p53+inactivation+during+transformation+of+a+subpopulation+of+primary+human+melanocytes.">The role of BRAF mutation and p53 inactivation during transformation of a subpopulation of primary human melanocytes.</a> Am J Pathol. 174, 2367-2377 (2009).</li><li>Lee, J. T., Li, L., Brafford, P. A., van den Eijnden, M., Halloran, M. B., Sproesser, K., Haass, N. K., Smalley, K. S., Tsai, J., Bollag, G., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PLX4032,+a+potent+inhibitor+of+the+B-Raf+V600E+oncogene,+selectively+inhibits+V600E-positive+melanomas.">PLX4032, a potent inhibitor of the B-Raf V600E oncogene, selectively inhibits V600E-positive melanomas.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 23, 820-827 (2010).</li><li>Tsai, J., Lee, J. T., Wang, W., Zhang, J., Cho, H., Mamo, S., Bremer, R., Gillette, S., Kong, J., Haass, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+selective+inhibitor+of+oncogenic+B-Raf+kinase+with+potent+antimelanoma+activity.">Discovery of a selective inhibitor of oncogenic B-Raf kinase with potent antimelanoma activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 3041-3046 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Abbiamo descritto la generazione pelle 3D ricostruisce con melanociti umani normali, le cellule staminali e cellule di melanoma cutaneo. Quando coltivate in coltura monostrato, le cellule melanocitici presentano una morfologia simile (appiattita, mandrino o più dendritiche a forma), indipendentemente dalla loro origine di stadio clinico. Al contrario, la pelle 3D ricostruisce ricapitolare fase proprietà specifiche delle cellule del melanoma. Normali melanociti umani a risiedere nel membrane basali dell&#39;epidermide tra il derma e gli strati di cellule singole. Cellule di melanoma RGP primarie crescere come piccoli gruppi lungo la membrana basale, mentre più aggressive le cellule di melanoma VGP crescere come grandi cluster rompere la membrana basale nel derma. Cellule di melanoma metastatico crescere in tutte le direzioni e invadono in profondità nel derma come singole cellule o gruppi. Analisi quantitative possono essere eseguite su questo modello, misurando la profondità di invasione e il grado di proliferazione. Oltre alla caratterizzazione delle cellule melanocitiche normali e maligne, utilizzando il modello possiamo direttamente indurre la differenziazione delle cellule staminali cutanee in melanociti maturata, che ospita lo strato basale dell&#39;epidermide e di stabilire la comunicazione in buona fede con i cheratinociti attraverso sovraregolazione di E-caderina ( 6). Utilizzando vettori virali, siamo in grado di attivare o disattivare la funzione del gene per una migliore comprensione delle dinamiche e significato funzionale di geni espressi da ciascun tipo di cellula in pelle ricostruisce, che promette di essere un modello efficiente per studiare non solo i meccanismi di trasformazione dei melanociti , ma anche la progressione del melanoma (8). Osservazione a lungo termine di fenotipi cellulari è diventato possibile attraverso l&#39;innesto di pelle ricostruisce agli animali immunodeficienti. Tale pelle umana-topo chimera è uno strumento di ricerca di eccellenza per lo studio melanomagenesis e metastasi melanoma. Ricostruisce la pelle può anche essere una piattaforma utile per la valutazione dei farmaci. Molti farmaci che sradicare le cellule tumorali in condizioni di coltura 2D spesso hanno scarso effetto in applicazioni sperimentali e cliniche. Come si è visto nel tumore in vivo, le cellule di melanoma nelle culture 3D sono spesso resistenti ai farmaci che le cellule nelle culture 2D rispondere, suggerendo che il microambiente modula vie di segnalazione nel melanoma. Per la scoperta di nuovi farmaci di successo, la pelle ricostruire il modello 3D è uno strumento ideale preclinici per prevedere gli effetti dei composti in vivo (9,10). In sintesi, ricostruire la pelle modelli colmare il divario tra dati in vitro e in vivo. Essi porteranno ad una migliore comprensione di quali sono i geni coinvolti nella trasformazione e come le cellule staminali contribuiscono a tale trasformazione.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> Emem 10x </td><td> Bio Whittaker </td><td> 12-684F </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Gibco </td><td> 25030-081 </td></tr><tr><td> Siero bovino fetale </td><td> Hyclone </td><td> SH-30.071,02 </td></tr><tr><td> Bovina tendine estratte con acido, Collagene </td><td> Organogenesi </td><td> 200/50 </td></tr><tr><td> Cultura del tessuto a 6 e Vassoi con inserti </td><td> Organogenesi </td><td> 9285 </td></tr><tr><td> Cheratinociti Media siero gratuito </td><td> Gibco </td><td> 17005042 </td></tr><tr><td> Dializzati siero fetale di vitello </td><td> Hyclone </td><td> SH-30.079,03 </td></tr><tr><td> ricombinante umano Stem Cell Factor </td><td> Fitzgerald Industries </td><td> RDI-307-255X </td></tr><tr><td> Di base FGF </td><td> Fitzgerald Industries </td><td> 30R-AF015 </td></tr><tr><td> Endotelina-3, umano </td><td> Peptide americano Co. </td><td> 88-5-10 </td></tr><tr><td> Cloruro di calcio </td><td> Sigma </td><td> C-7902 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> JRH bioscienze </td><td> 56430-10L </td></tr><tr><td> F12 (Ham) </td><td> Gibco </td><td> 11765-54 </td></tr><tr><td> Idrocortisone </td><td> Sigma </td><td> H-0888 </td></tr><tr><td> L&#39;insulina, transferrina, Ethanolamine, Selenio (ITES) </td><td> BioWhittaker </td><td> 17839Z </td></tr><tr><td> O-Phosphorylethanolamine </td><td> Sigma </td><td> P0503 </td></tr><tr><td> Adenina </td><td> Sigma </td><td> A9795 </td></tr><tr><td> Progesterone </td><td> Sigma </td><td> P-8783 </td></tr><tr><td> Triiodotironina </td><td> Sigma </td><td> T-5516 </td></tr><tr><td> Siero di vitello neonato </td><td> Hyclone </td><td> SH3011802 </td></tr><tr><td> 10% di buffer formalina </td><td> Surgipath </td><td> 00600 </td></tr><tr><td> Taglio ottimale temperatura del fluido di congelamento (OCT) </td><td> Sakura </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> Cassette Multi </td><td> Surgipath </td><td> 02293-BX </td></tr><tr><td> TBS biopsia carte </td><td> Triangolo di Scienze Biomediche </td><td> BP-B </td></tr><tr><td> TBS biopsia carte </td><td> Triangolo di Scienze Biomediche </td><td> BP-B </td></tr><tr><td> Stampi Base usa e getta </td><td> Pescatore </td><td> 15-182-501C </td></tr><tr><td> Composto benzoino tintura </td><td> Disposables professionale, Inc, </td><td> S42450 </td></tr><tr><td> Alcol Prep Tamponi </td><td> CVS farmacia </td><td></td></tr><tr><td> Di seta nera intrecciata 5-0 </td><td> Ethicon </td><td> 682G </td></tr><tr><td> Spugne garza (sterile) </td><td> CVS farmacia </td><td></td></tr><tr><td> Forcipe </td><td> Roboz </td><td> RS5070 </td></tr><tr><td> Iris forbici </td><td> Roboz </td><td> RS5913 </td></tr><tr><td> Lame chirurgiche </td><td> Piuma </td><td> 2976 </td></tr><tr><td> EZ anestesia </td><td> Euthanex Corp. </td><td></td></tr><tr><td> SCID topo senza peli outbred </td><td> Charles River </td><td></td></tr></tbody></table>

the three-dimensional human skin reconstruct model: a tool to study normal  skin and melanoma progression

La maggior parte degli studi in vitro in biologia sperimentale della pelle sono state fatte in monocolture 2-dimensionali (2D), mentre accumulando evidenze suggeriscono che le cellule si comportano diversamente quando sono cresciuti in un 3D di matrice extra-cellulare e anche di interagire con altre cellule (1-5) . Modelli di topo sono stati ampiamente utilizzati per studiare la morfogenesi dei tessuti in vivo. Tuttavia il mouse e la pelle umana sono differenze significative nel campo dell&#39;architettura e fisiologia cellulare, che rende difficile estrapolare studi sui topi per l&#39;uomo. Dal melanociti della pelle del mouse sono per lo più localizzati nei follicoli piliferi, hanno spiccate proprietà biologiche da quelle degli esseri umani, che individuare principalmente lo strato basale dell&#39;epidermide. Il recente sviluppo del 3D pelle umana ricostruire modelli ha permesso di indagare il campo cellula-matrice e cellula-cellula interazioni tra diversi tipi di cellule. La ricostruisce costituito da un &quot;derma&quot; con fibroblasti incorporati in una matrice di collagene I, un &#39;&quot;epidermide&quot;, che comprende stratificata, cheratinociti differenziati e una membrana basale funzionale, che separa l&#39;epidermide dal derma. Il collagene fornisce ponteggi, la consegna dei nutrienti, e il potenziale di cellula-cellula interazione. I modelli 3D che incorpora le cellule della pelle melanocitici ricapitolare le caratteristiche naturali di omeostasi melanociti e la progressione del melanoma in pelle umana. Come in vivo, nei melanociti della pelle ricostruita sono localizzate a livello della membrana seminterrato intervallati da cheratinociti strato basale. Cellule di melanoma presentano le stesse caratteristiche che riflettono la fase iniziale del tumore (RGP, VGP e cellule di melanoma metastatico) in vivo. Recentemente, le cellule staminali cutanee sono state identificate nel derma umano (6). Questi multi-potenti cellule staminali possono migrare verso l&#39;epidermide e si differenziano per melanociti.

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The Three-Dimensional Human Skin Reconstruct Model: a Tool to Study Normal  Skin and Melanoma Progression

In questo rapporto, descriviamo tridimensionale pelle ricostruire modello che imita la pelle umana in architettura e composizione. Fisiologia melanociti, la progressione del melanoma e il destino delle cellule staminali cutanee sono state studiate utilizzando il modello di ricostruire la pelle. Il modello è anche utile come strumento di pre-clinici per la valutazione dei farmaci.

Tridimensionale pelle umana Ricostruire Modello: uno strumento per studiare la pelle normale e progressione Melanoma

Most in vitro studies in experimental skin biology have been done in 2-dimensional (2D) monocultures, while accumulating evidence suggests that cells ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

49.2K Views.  The Wistar Institute. In questo rapporto, descriviamo tridimensionale pelle ricostruire modello che imita la pelle umana in architettura e composizione. Fisiologia melanociti, la progressione del melanoma e il destino delle cellule staminali cutanee sono state studiate utilizzando il modello di ricostruire la pelle. Il modello è anche utile come strumento di pre-clinici per la valutazione dei farmaci.

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Planar and Three-Dimensional Printing of Conductive Inks

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical devices1-3. In this paper, we focus on one- (1D), two- (2D), and three-dimensional (3D) printing of conductive metallic inks in the form of flexible, stretchable, and spanning microelectrodes.
Direct-write assembly4,5 is a 1-to-3D printing technique that enables the fabrication of features ranging from simple lines to complex structures by the deposition of concentrated inks through fine nozzles (~0.1 - 250 &mu;m). This printing method consists of a computer-controlled 3-axis translation stage, an ink reservoir and nozzle, and 10x telescopic lens for visualization. Unlike inkjet printing, a droplet-based process, direct-write assembly involves the extrusion of ink filaments either in- or out-of-plane. The printed filaments typically conform to the nozzle size. Hence, microscale features (&lt; 1 &mu;m) can be patterned and assembled into larger arrays and multidimensional architectures.
In this paper, we first synthesize a highly concentrated silver nanoparticle ink for planar and 3D printing via direct-write assembly. Next, a standard protocol for printing microelectrodes in multidimensional motifs is demonstrated. Finally, applications of printed microelectrodes for electrically small antennas, solar cells, and light-emitting diodes are highlighted.

Planar and three-dimensional printing of conductive metallic inks is described. Our approach provides new avenues for fabricating printed electronic, optoelectronic, and biomedical devices in unusual layouts at the microscale.

Stampa planare e tridimensionale di inchiostri conduttivi

Printed electronics rely on low-cost, large-area fabrication routes to create flexible or multidimensional electronic, optoelectronic, and biomedical ...

Ricerca

Bioingegneria

An Improved Method for the Preparation of Type I Collagen From Skin

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. Clinically, this protein is widely used for cosmetic surgery, dermal injections, bone grafting, and reconstructive surgery. The sources of COL1 for these procedures are commonly nonhuman, which increases the potential for inflammation and rejection as well as xenobiotic disease transmission. In view of this, a method to efficiently and quickly purify COL1 from limited quantities of autologously-derived tissues would circumvent many of these issues; however, standard isolation protocols are lengthy and often require large quantities of collagenous tissues. Here, we demonstrate an efficient COL1 extraction method that reduces the time needed to isolate and purify this protein from about 10 days to less than 3 hr. We chose the dermis as our tissue source because of its availability during many surgical procedures. This method uses traditional extraction buffers combined with forceful agitation and centrifugal filtration to obtain highly-pure, soluble COL1 from small amounts of corium. Briefly, dermal biopsies are washed thoroughly in ice-cold dH2O after removing fat, connective tissue, and hair. The skin samples are stripped of noncollagenous proteins and polysaccharides using 0.5 M sodium acetate and a high speed bench-top homogenizer. Collagen from residual solids is subsequently extracted with a 0.075 M sodium citrate buffer using the homogenizer. These extracts are purified using 100,000 MW cut-off centrifugal filters that yield COL1 preparations of comparable or superior quality to commercial products or those obtained using traditional procedures. We anticipate this method will facilitate the utilization of autologously-derived COL1 for a multitude of research and clinical applications.

Traditional procedures for the isolation of soluble type 1 collagen (COL1) require about 10 days from start to finish because of lengthy buffer incubations and laborious resuspensions of fibrils. Here, we describe a means to purify COL1 from small dermal biopsies in less than 3 hr.

Un metodo migliore per la preparazione di tipo I collagene della pelle

Soluble type 1 collagen (COL1) is used extensively as an adhesive substrate for cell cultures and as a cellular scaffold for regenerative applications. ...

Investigating the Three-dimensional Flow Separation Induced by a Model Vocal Fold Polyp

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. Polyps and nodules, which are geometric abnormalities that form on the medial surface of the vocal folds, can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Our laboratory has reported particle image velocimetry (PIV) measurements, within an investigation of a model polyp located on the medial surface of an in&#160;vitro driven vocal fold model, which show that such a geometric abnormality considerably disrupts the glottal jet behavior. This flow field adjustment is a likely reason for the severe degradation of the vocal quality in patients with polyps. A more complete understanding of the formation and propagation of vortical structures from a geometric protuberance, such as a vocal fold polyp, and the resulting influence on the aerodynamic loadings that drive the vocal fold dynamics, is necessary for advancing the treatment of this pathological condition. The present investigation concerns the three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted prolate hemispheroid with a 2:1 aspect ratio in cross flow, i.e. a model vocal fold polyp, using an oil-film visualization technique. Unsteady, three-dimensional flow separation and its impact of the wall pressure loading are examined using skin friction line visualization and wall pressure measurements.

Vocal fold polyps can disrupt vocal fold dynamics and thus can have devastating consequences on a patient&#39;s ability to communicate. Three-dimensional flow separation induced by a wall-mounted model polyp and its impact on the wall pressure loading are examined using particle image velocimetry, skin friction line visualization, and wall pressure measurements.

Investigare la separazione tridimensionale del flusso indotta da un modello di polipo piega vocale

The fluid-structure energy exchange process for normal speech has been studied extensively, but it is not well understood for pathological conditions. ...

Human Cartilage Tissue Fabrication Using Three-dimensional Inkjet Printing Technology

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and regenerative medicine. With digital control&#160;cells, scaffolds, and growth factors can be precisely deposited to the desired two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) locations rapidly. Therefore, this technology is an ideal approach to fabricate tissues mimicking their native anatomic structures. In order to engineer cartilage with native zonal organization, extracellular matrix composition (ECM), and mechanical properties, we developed a bioprinting platform using a commercial inkjet printer with simultaneous photopolymerization capable for 3D cartilage tissue engineering. Human chondrocytes suspended in poly(ethylene glycol) diacrylate (PEGDA) were printed for 3D neocartilage construction via layer-by-layer assembly. The printed cells were fixed at their original deposited positions, supported by the surrounding scaffold in simultaneous photopolymerization. The mechanical properties of the printed tissue were similar to the native cartilage. Compared to conventional tissue fabrication, which requires longer UV exposure, the viability of the printed cells with simultaneous photopolymerization was significantly higher. Printed neocartilage demonstrated excellent glycosaminoglycan (GAG) and collagen type II production, which was consistent with gene expression. Therefore, this platform is ideal for accurate cell distribution and arrangement for anatomic tissue engineering.

The methods described in this paper show how to convert a commercial inkjet printer into a bioprinter with simultaneous UV polymerization. The printer is capable of constructing 3D tissue structure with cells and biomaterials. The study demonstrated here constructed a 3D neocartilage.

Umana Cartilagine Tessuto Fabrication Uso tridimensionale Tecnologia Inkjet Printing

Bioprinting, which is based on thermal inkjet printing, is one of the most attractive enabling technologies in the field of tissue engineering and ...

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to evaluate new strategies that aim at improving vascularization, reliable methods are required to make the in-growth of new blood vessels into bio-artificial scaffolds visible and quantify the results. Over the past couple of years, our group has introduced a full skin defect model that enables the direct visualization of blood vessels by transillumination and provides the possibility of quantification through digital segmentation. In this model, one surgically creates full skin defects in the back of mice and replaces them with the material tested. Molecules or cells of interest can also be incorporated in such materials to study their potential effect. After an observation time of one&#8217;s own choice, materials are explanted for evaluation. Bilateral wounds provide the possibility of making internal comparisons that minimize artifacts among individuals as well as of decreasing the number of animals needed for the study. In comparison to other approaches, our method offers a simple, reliable and cost effective analysis. We have implemented this model as a routine tool to perform high-resolution screening when testing vascularization of different biomaterials and bio-activation approaches.

A Full Skin Defect Model to Evaluate Vascularization of Biomaterials In Vivo

Vascularization is key to approaches in successful tissue engineering. Therefore, reliable technologies are required to evaluate the development of vascular networks in tissue-constructs. Here we present a simple and cost-effective method to visualize and quantify vascularization in vivo.

Una pelle piena Difetto modello per valutare Vascolarizzazione di Biomateriali<em&gt; In Vivo</em

Insufficient vascularization is considered to be one of the main factors limiting the clinical success of tissue-engineered constructs. In order to ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Generazione di una tridimensionale a tutto spessore della pelle Equivalent e Automated Ferimento

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Development of a Multicellular Three-dimensional Organotypic Model of the Human Intestinal Mucosa Grown Under Microgravity

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). In fact, it is widely recognized that cells grown in flasks or dishes tend to de-differentiate and lose specialized features of the tissues from which they were derived. Currently, there are mainly two types of 3-D culture systems where the cells are seeded into scaffolds mimicking the native extracellular matrix (ECM): (a) static models and (b) models using bioreactors. The first breakthrough was the static 3-D models. 3-D models using bioreactors such as the rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors are a more recent development. The original concept of the RWV bioreactors was developed at NASA&#39;s Johnson Space Center in the early 1990s and is believed to overcome the limitations of static models such as the development of hypoxic, necrotic cores. The RWV bioreactors might circumvent this problem by providing fluid dynamics that allow the efficient diffusion of nutrients and oxygen. These bioreactors consist of a rotator base that serves to support and rotate two different formats of culture vessels that differ by their aeration source type: (1) Slow Turning Lateral Vessels (STLVs) with a co-axial oxygenator in the center, or (2) High Aspect Ratio Vessels (HARVs) with oxygenation via a flat, silicone rubber gas transfer membrane. These vessels allow efficient gas transfer while avoiding bubble formation and consequent turbulence. These conditions result in laminar flow and minimal shear force that models reduced gravity (microgravity) inside the culture vessel. Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa composed of an intestinal epithelial cell line and primary human lymphocytes, endothelial cells and fibroblasts cultured under microgravity provided by the RWV bioreactor.

Cells growing in a three-dimensional (3-D) environment represent a marked improvement over cell cultivation in 2-D environments (e.g., flasks or dishes). Here we describe the development of a multicellular 3-D organotypic model of the human intestinal mucosa cultured under microgravity provided by rotating-wall-vessel (RWV) bioreactors.

Sviluppo di un multicellulare tridimensionale Organotipica Modello della mucosa intestinale umana coltivate in microgravità

Because cells growing in a three-dimensional (3-D) environment have the potential to bridge many gaps of cell cultivation in 2-D environments (e.g., ...

In Vitro Model of Human Cutaneous Hypertrophic Scarring using Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol applies a macromolecular crowding (MMC) technique to mimic this physiological crowding through the addition of neutral polymers (crowders) to cell cultures in vitro. Previous studies using Ficoll or dextran as crowders demonstrate that the expression of collagen I and fibronectin in WI38 and WS-1 cell lines are significantly enhanced using the MMC technique. However, this technique has not been validated in primary hypertrophic scar-derived human skin fibroblasts (hHSFs). As hypertrophic scarring arises from the excessive deposition of collagen, this protocol aims to construct a collagen-rich in vitro hypertrophic scar model by applying the MMC technique with hHSFs. This optimized MMC model has been shown to possess more similarities with in vivo scar tissue compared to traditional 2-dimensional (2-D) cell culture systems. In addition, it is cost-effective, time-efficient, and ethically desirable compared to animal models. Therefore, the optimized model reported here offers an advanced &#8220;in vivo-like&#8221; model for hypertrophic scar-related studies.

This protocol describes the use of macromolecular crowding to create an in vitro human hypertrophic scar tissue model that resembles in vivo conditions. When cultivated in a crowded macromolecular environment, human skin fibroblasts exhibit phenotypes, biochemistry, physiology, and functional characteristics resembling scar tissue.

In vitro Modello di umano cutaneous ipertrofico cicatrici utilizzando Macromolecular Crowding

It has been shown that in vivo tissues are highly crowded by proteins, nucleic acids, ribonucleoproteins, polysaccharides, etc. The following protocol ...

Cultivating a Three-dimensional Reconstructed Human Epidermis at a Large Scale

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process and the characterization of the model is described. Neonatal primary keratinocytes are grown submerged on permeable polycarbonate inserts and lifted to the air-liquid interface three days after seeding. After fourteen days of stimulation with defined growth factors and ascorbic acid in high calcium culture medium, the model is fully differentiated. Histological analysis revealed a completely stratified epidermis, mimicking the morphology of native human skin. To characterize the model and its barrier functions, protein levels and localization specific for early-stage keratinocyte differentiation (i.e., keratin 10), late-stage differentiation (i.e., involucrin, loricrin, and filaggrin) and tissue adhesion (i.e., desmoglein 1), were assessed by immunofluorescence. The tissue barrier integrity was further evaluated by measuring transepithelial electrical resistance. Reconstructed human epidermis was responsive to proinflammatory stimuli (i.e., lipopolysaccharide and tumor necrosis factor alpha), leading to increased cytokine release (i.e., interleukin 1 alpha and interleukin 8). This protocol represents a straightforward and reproducible in vitro method to cultivate reconstructed human epidermis as a tool to assess environmental effects and a broad range of skin-related studies.

This protocol describes a straightforward method to cultivate three-dimensional reconstituted human epidermis in a reproducible and robust manner. Additionally, it characterizes the structure-function relationship of the epidermal barrier model. The biological responses of the reconstituted human epidermis upon proinflammatory stimuli are also presented.

Coltivare un'epidermide umana ricostruita tridimensionale su larga scala

A three-dimensional human epidermis model reconstructed from neonatal primary keratinocytes is presented. Herein, a protocol for the cultivation process ...

Generation of Self-assembled Vascularized Human Skin Equivalents

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to study skin development, wound healing, and grafting techniques. Many HSEs continue to lack vasculature and are additionally analyzed through post-culture histological sectioning which limits volumetric assessment of the structure. Presented here is a straightforward protocol utilizing accessible materials to generate vascularized human skin equivalents (VHSE); further described are volumetric imaging and quantification techniques of these constructs. Briefly, VHSEs are constructed in 12 well culture inserts in which dermal and epidermal cells are seeded into rat tail collagen type I gel. The dermal compartment is made up of fibroblast and endothelial cells dispersed throughout collagen gel. The epidermal compartment is made up of keratinocytes (skin epithelial cells) that differentiate at the air-liquid interface. Importantly, these methods are customizable based on needs of the researcher, with results demonstrating VHSE generation with two different fibroblast cell types: human dermal fibroblasts (hDF) and human lung fibroblasts (IMR90s). VHSEs were developed, imaged through confocal microscopy, and volumetrically analyzed using computational software at 4- and 8-week timepoints. An optimized process to fix, stain, image, and clear VHSEs for volumetric examination is described. This comprehensive model, imaging, and analysis techniques are readily customizable to the specific research needs of individual labs with or without prior HSE experience.

The goal of this protocol is to describe the generation and volumetric analysis of vascularized human skin equivalents using accessible and simple techniques for long term culture. To the extent possible, the rationale for steps is described to allow researchers the ability to customize based on their research needs.

Generazione di equivalenti di pelle umana vascolarizzata auto-assemblati

Human skin equivalents (HSEs) are tissue engineered constructs that model epidermal and dermal components of human skin. These models have been used to ...