Il dettaglio fornito in questo protocollo, riguarda la generazione equivalente della pelle umana, che è spesso tecnicamente impegnativa. Sono inclusi nuovi elementi di protocollo equivalenti alla pelle umana, come la vascucolatura e l'imaging volumetrico. La tecnica consente la costruzione semplice di un modello di pelle che si abbina più strettamente al tessuto in vivo per lo studio di malattie, invecchiamento e medicina personalizzata.
La parte più impegnativa di questo protocollo è una transizione tra l'immersione e l'interfaccia aria-liquido. Probabilmente ci saranno alcune prove per ottimizzare i tempi e i livelli dei media per risultati coerenti. Per iniziare, aggiungere 516 microlitri di supporti a un tubo chiuso a freddo e aggiungere immediatamente 375 microlitri di collagene freddo utilizzando la pipetta di spostamento positivo da 1000 microlitri.
Rimuovere la punta della pipetta vuota e passare alla pipetta di spostamento positiva preparata da 250 microliter per mescolare. Mescolare rapidamente, ma delicatamente per evitare l'eccesso di formazione di bolle. Mantenendo la punta nella soluzione, mescolare uniformemente da diverse posizioni del tubo fino a quando la soluzione è di colore omogeneo, che in genere richiede circa cinque cicli di pipetta o 10 secondi.
Disperdere immediatamente 125 microlitri di collagene acellulare sulla membrana dell'inserto di coltura a 12 porri. Per garantire una copertura uniforme, inclinare la piastra e utilizzare la punta della pipetta per dipingere la membrana diffondendo delicatamente il collagene intorno. Spostare immediatamente la piastra da 12 po 'in un incubatore di coltura cellulare Celsius di 37 gradi per lasciarlo gelare per almeno 20 minuti.
Dopo il periodo di gelazione, estraere la piastra di 12 po 'di collagene acellulare dall'incubatrice. Rimuovere il tubo chiuso da 1,7 millilitri dal ghiaccio umido, quindi rimuovere il collagene di serie dalla refrigerazione e posizionarlo sul ghiaccio bagnato con il coperchio aperto. Aggiungere 516 microlitri di sospensione cellulare raffreddata al tubo chiuso a freddo.
Utilizzare la pipetta da 1000 microlitri per pipettare immediatamente 375 microlitri di soluzione di collagene freddo direttamente nella soluzione all'interno del tubo chiuso. Espellere tutto il collagene dalla pipetta nel tubo e scartare la punta positiva della pipetta di spostamento. Passare immediatamente alla pipetta da 250 microlitri e mescolare la soluzione di collagene Una volta miscelata, trasferire 250 microlitri di soluzione di collagene cellulare sui supporti di collagene cellulare nell'inserto di coltura a 12 pozzetti, quindi spostare la piastra da 12 pozzetti in un incubatore di coltura cellulare di 37 gradi Celsius.
Dopo 30 minuti di gel, inclinare delicatamente la piastra per valutare la gelazione e assicurarsi che il collagene si sia solidificato. Aggiungere 500 microlitri e 1000 microlitri di mezzi di miscelazione rispettivamente alla camera superiore e alla camera inferiore dell'inserto. Assicurarsi che il gel di collagene sia sommerso, aggiungendo più mezzi se necessario.
Posizionare la piastra del pozzo nell'incubatore di coltura cellulare per l'incubazione notturna. Il settimo giorno di immersione, utilizzare una pipetta manuale per raccogliere e scartare bene i supporti dalla camera inferiore e superiore di ogni costrutto. Per raccogliere i supporti bloccati direttamente sotto la membrana permeabile, posizionare la punta della pipetta sotto la membrana, facendo cadere temporaneamente l'inserto.
Aggiungere un millilitro di pelle umana equivalente o mezzi HSE integrati con 5%FPS alla camera inferiore di ogni pozzo e 200 microlitri di sospensione cellulare alla camera superiore di ogni pozzo. Seminare i cheratinociti direttamente sulla superficie del costrutto dermico e consentire loro di depositarsi per due ore nell'incubatore. Due ore dopo la semina dei cheratinociti, aggiungere con cura 300 microlitri di supporti HSE, integrati con 5%FPS alla camera superiore di ogni costrutto bene.
Dopo aver caricato il supporto, posizionare di nuovo il costrutto nell'incubatore. Utilizzando una pipetta manuale, sollevare ogni costrutto alla propria interfaccia aria-liquido, o ALI, rimuovendo i rifiuti multimediali solo dalla camera superiore. Cerca di avvicinarti il più possibile allo strato epidermico senza toccarlo o danneggiarlo.
Inclinare leggermente le piastre ad angoli diversi per raccogliere il supporto, quindi aggiungere circa due millilitri di acqua sterile ai pozzi circostanti nella piastra per mantenere l'umidità costante. Controllare la piastra poche ore dopo per assicurarsi che i cheratinociti siano ancora all'ALI. Rimuovere qualsiasi supporto nella camera superiore, tenendo traccia della quantità di supporti rimossi da ogni pozzo.
Gli strati epidermici dovrebbero sembrare idratati, non asciutti, ma non dovrebbero esserci supporti raggruppati sopra il costrutto. Per preparare il costrutto per la colorazione immunofluorescente, capovolgere un inserto e posizionarlo sopra il suo pozzo sulla piastra del pozzo. Stabilizzare l'inserto con una mano durante l'utilizzo di forcep a punta fine o di un coltello di precisione per tagliare circa la metà della circonferenza della membrana.
Tagliare il più vicino possibile all'alloggiamento in plastica. Utilizzando le forcep a punta fine, afferrare il bordo del lembo della membrana tagliata e rimuovere delicatamente la membrana porosa dall'inserto e il costrutto VHSE. Se il costrutto rimane bloccato sul lato della camera, utilizzare le forcep della punta fine o una piccola scoopula per spostarlo nel pozzo.
Una volta che il VHSE è nel pozzo, scartare tutti i pezzi rimanenti della membrana dell'inserto e mantenere l'alloggiamento dell'inserto di coltura in ogni pozzo per tenere i VHSE in posizione sommersa durante la colorazione. Due giorni prima dell'imaging, preparare polidimetilsiloxano o PDMS. Posizionare qualsiasi recipiente di miscelazione pulito su una bilancia di pesatura e tarare la bilancia.
Aggiungere la base, quindi aggiungere il retino. Mescolare vigorosamente la soluzione per almeno quattro minuti, creando piccole bolle. Dopo una miscelazione sufficiente, versare il PDMS in una piastra di Petri da 90 o 100 millimetri.
Degasa il PDMS in una camera a vuoto fino a quando tutte le bolle scompaiono e il PDMS è chiaro. Rilasciare lentamente il vuoto e rimuovere il PDMS. Mettere il piatto in un forno per curare durante la notte a 50-60 gradi Celsius, assicurandosi che il piatto sia seduto piatto per la cura uniforme del PDMS.
Un giorno prima dell'imaging, utilizzare un punzone in acciaio o un coltello di precisione portatile per punzonare o tagliare un pozzo circolare dal foglio PDMS, all'incirca delle stesse dimensioni del costrutto VHSE. Tagliare una patch quadrata attorno al pozzo circolare per creare un singolo pozzo PDMS. Utilizzando un coperchio di vetro di dimensioni simili al PDMS aggiungere bene colla cianoacrilato sulla superficie inferiore del PDMS e spalmare uniformemente con una punta di pipetta usa e getta.
Centrare il vetro e premerlo bene sul PDMS lasciando una finestra di vetro trasparente all'interno del cerchio perforato. Lasciare asciugare la colla durante la notte prima dell'uso. La caratterizzazione dell'epidermide e del derma mostra marcatori immunofluorescenti appropriati per la pelle umana nei costrutti VHSE.
La citocheratina 10 è un marcatore cheratinocita di differenziazione precoce che di solito segna tutti gli strati soprabasali negli equivalenti della pelle. Involucrina e filaggrina sono marcatori di differenziazione tardiva nei cheratinociti e segnano gli strati superiori più sovrabasali negli equivalenti della pelle. La cancellazione del VHSE ha permesso immagini semplici in un'unica impostazione ed eliminato la necessità di riorientare il costrutto per immaginare separatamente il derma e l'epidermide.
Le immagini volumetriche consente di generare rendering 3D per mappare la vascucolatura in ogni costrutto. Gli stack di immagini sono stati caricati in software computazionale e un algoritmo personalizzato è stato utilizzato per il rendering e la quantificazione 3D. La scheletrizzazione ha determinato il centro definitivo di ogni vaso marcato collagene IV e i dati risultanti sono stati utilizzati per calcolare il diametro del vaso e la frazione vascolare.
Seguendo questa procedura, metodi di caratterizzazione come l'analisi delle barriere, la microscopia elettronica a scansione, i profili lipidici e altri possono essere eseguiti per capire come la vascucolatura influenzi specificamente la maturazione e la stabilità epidermica. Questo protocollo consente studi rilevanti per i tessuti e specifici del tipo cellulare in un modello cutaneo vascolarizzato. È particolarmente adatto per la ricerca in medicina dell'invecchiamento e personalizzata.
