Questo studio è stato sostenuto dal NCI (R01-R01-94160 e 155086), UI Simon Cancer Center e Centro di Wells per la Ricerca Pediatrica.

Questo studio è stato approvato dal Comitato IACUC presso l&#39;Indiana University School of Medicine. 1. Generare topi con genotipo corretto <ol><li> Stabilire un modello murino di BCC. Mate K14-CREER topi (Jackson laboratorio stock numero 005107) con R26-SmoM2 YFP topi (Jackson laboratorio stock numero 005.130) (18) per generare K14-CREER + e R26-SmoM2 YFP + topi. </li><li> Eseguire la genotipizzazione. Immergere i campioni coda (0,5 cm di lunghezza) in directPCR soluzione lisi coda con 1 mg / ml di proteinasi K a 55 ° C per una notte con agitazione. Il giorno successivo, rimuovere i residui di tessuto per centrifugazione a velocità massima in un micro-centrifuga (per mantenere il surnatante per la genotipizzazione). Usare 1 ml del supernatante per ciascuna reazione PCR con i primer e le condizioni raccomandate dal fornitore. Selezionare i topi con i genotipi giuste (all&#39;età di 3-6 settimane, buprenorfina a 0,05-0,1 mg / kg verrà applicata tramite SQ ogni 8-12 ore per 2-3 giorni dopo la coda snip) for il punto 2. </li></ol> 2. Indurre l&#39;espressione di SmoM2 nei cheratinociti della pelle Indurre SmoM2 espressione nei cheratinociti con somministrazione orale di tamoxifene (5 pg / kg di peso corporeo in 50 ml di olio vegetale in ciascuna alimentazione) per 5 giorni consecutivi mediante sonda gastrica con un ago di alimentazione (curva 20 gauge). 3. Preparazione di campioni della pelle In generale, i fenotipi sono più gravi sull&#39;orecchio e la coda in K14creER/R26SmoM2 GFP topi. Per preparare per le analisi delle cellule, abbiamo prima vendemmia della pelle del mouse dopo il sacrificio di animali con una procedura approvata istituzionale (CO 2 più dislocazione cervicale). 4. Isolando Epidermide <ol><li> Dopo i topi sacrificio con una procedura approvata (vedi punto 3), rimuovere pelliccia tramite trimmer. I campioni di pelle Immergere in soluzione dispasi (5 mg / ml in DMEM con 10% FBS) a 37 ° C per 1-2 ore (1 ora per i topi meno di 8 settimane e 2 hrper i topi vecchi di 8 settimane). </li><li> Dopo il trattamento dispasi, epidermide separata dal derma con il forcipe. </li></ol> 5. Generare cellule singole <ol><li> Per ottenere singola popolazione cellulare, tritare epidermide da forbici e poi immergere in soluzione IV collagenasi (1 mg / ml in DMEM con 10% FBS) per 1-2 ore a 37 ° C in un tubo da 50 ml. Provate a mescolare delicatamente i tubi ogni 20 min per aiutare dissociazione delle cellule. </li><li> Ispezionare dissociazione delle cellule al microscopio. Quando singole cellule possono essere rilevate nel medio collagenasi, incubare il campione per altri 30 min per aumentare la resa cella. In generale, l&#39;epidermide da un mouse può produrre fino a 10 7 cellule. </li><li> Filtrare la miscela tessuto attraverso colino cellula (diametro dei pori 70 micron), le cellule di spin giù a 1.500 giri tramite banco centrifugazione, e lavare una volta con PBS. </li></ol> 6. Cellule etichette ed eseguire analisi di flusso Citometria <ol><li> Risospendere le cellule in 10% FBSin PBS a 2,5 x 10 6 cellule / ml per bloccare il legame non specifico (in ghiaccio per 30 min) </li><li> Prelevare un&#39;aliquota di cellule a ciascuna di 1,5 ml per microtubi etichettatura anticorpo specifico. Aggiungere anticorpi differenti in ciascun tubo ad una concentrazione finale di 2 mg / ml. Mescolare gli anticorpi con le cellule attraverso un delicato vertice per alcuni secondi e lasciarli in ghiaccio per 30 minuti, quindi lavare con 1 ml di PBS. Per i campioni di BCC, abbiamo usato gli anticorpi per i seguenti marcatori: CD11b-PE più Gr1-APC (cellule mieloidi o cellule mieloidi soppressore-derivati); vimentina-FITC (fibroblasti) (vedi i reagenti per i dettagli). </li><li> Per la colorazione intracellulare, usiamo un kit e seguire il manuale del fornitore (vedi Reagenti per i dettagli). Usiamo cellule fresche per analizzare marcatori di superficie cellulare. Dopo superficie marcatore colorazione, lavare le cellule, e risospendere in PBS. DAPI aggiungere alla miscela cella ad una concentrazione finale di 1 mg / ml. DAPI si macchia le cellule morte che saranno gated fuori da ulteriori analisi. </li><li> Analizzare i dati con specifisoftware c. Abbiamo prima selezionare singole cellule in base alla FSC e SSC trama, e utilizziamo DAPI popolazione negativo (cellule vive) per ulteriori analisi. </li></ol>

<ol>
	<li>Rogers, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+estimate+of+nonmelanoma+skin+cancer+in+the+United+States.">Incidence estimate of nonmelanoma skin cancer in the United States.</a> Arch. Dermatol. 146, 283-287 (2006).</li><li>Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinomas:+attack+of+the+hedgehog.">Basal cell carcinomas: attack of the hedgehog.</a> Nat. Rev. Cancer. 8, 743-754 (2008).</li><li>Yang, L., Xie, G., Fan, Q., Xie, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+hedgehog-signaling+pathway+in+human+cancer+and+the+clinical+implications.">Activation of the hedgehog-signaling pathway in human cancer and the clinical implications.</a> Oncogene. 29, 469-481 (2010).</li><li>Johnson, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+homolog+of+patched,+a+candidate+gene+for+the+basal+cell+nevus+syndrome.">Human homolog of patched, a candidate gene for the basal cell nevus syndrome.</a> Science. 272, 1668-1671 (1996).</li><li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+patched+homolog+is+expressed+in+target+tissues+of+sonic+hedgehog+and+maps+to+a+region+associated+with+developmental+abnormalities.">A mammalian patched homolog is expressed in target tissues of sonic hedgehog and maps to a region associated with developmental abnormalities.</a> J. Biol. Chem. 271, 12125-12128 (1996).</li><li>Hahn, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+of+the+human+homolog+of+Drosophila+patched+in+the+nevoid+basal+cell+carcinoma+syndrome.">Mutations of the human homolog of Drosophila patched in the nevoid basal cell carcinoma syndrome.</a> Cell. 85, 841-851 (1996).</li><li>Xie, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activating+Smoothened+mutations+in+sporadic+basal-cell+carcinoma.">Activating Smoothened mutations in sporadic basal-cell carcinoma.</a> Nature. 391, 90-92 (1998).</li><li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Missense+mutations+in+SMOH+in+sporadic+basal+cell+carcinomas+of+the+skin+and+primitive+neuroectodermal+tumors+of+the+central+nervous+system.">Missense mutations in SMOH in sporadic basal cell carcinomas of the skin and primitive neuroectodermal tumors of the central nervous system.</a> Cancer Res. 58, 1798-1803 (1998).</li><li>Lam, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+frequent+activated+smoothened+mutation+in+sporadic+basal+cell+carcinomas.">A frequent activated smoothened mutation in sporadic basal cell carcinomas.</a> Oncogene. 18, 833-836 (1999).</li><li>Nilsson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+basal+cell+carcinomas+and+trichoepitheliomas+in+mice+overexpressing+GLI-1.">Induction of basal cell carcinomas and trichoepitheliomas in mice overexpressing GLI-1.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3438-3443 (2000).</li><li>Sheng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+the+oncogenic+potential+of+Gli2:+deletion+of+an+NH(2)-terminal+fragment+alters+skin+tumor+phenotype.">Dissecting the oncogenic potential of Gli2: deletion of an NH(2)-terminal fragment alters skin tumor phenotype.</a> Cancer Res. 62 (2), 5308-5316 (2002).</li><li>Reifenberger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+in+the+PTCH,+SMOH,+SUFUH+and+TP53+genes+in+sporadic+basal+cell+carcinomas.">Somatic mutations in the PTCH, SMOH, SUFUH and TP53 genes in sporadic basal cell carcinomas.</a> Br. J. Dermatol. 152, 43-51 (2005).</li><li>Guha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hedgehog+inhibitor+gets+landmark+skin+cancer+approval,+but+questions+remain+for+wider+potential.">Hedgehog inhibitor gets landmark skin cancer approval, but questions remain for wider potential.</a> Nat. Rev. Drug Discov. 11, 257-258 (2012).</li><li>Sekulic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+vismodegib+in+advanced+basal-cell+carcinoma.">Efficacy and safety of vismodegib in advanced basal-cell carcinoma.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2171-2179 (2012).</li><li>Tang, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+the+hedgehog+pathway+in+patients+with+the+basal-cell+nevus+syndrome.">Inhibiting the hedgehog pathway in patients with the basal-cell nevus syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 366, 2180-2188 (2012).</li><li>Aszterbaum, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+and+ionizing+radiation+enhance+the+growth+of+BCCs+and+trichoblastomas+in+patched+heterozygous+knockout+mice.">Ultraviolet and ionizing radiation enhance the growth of BCCs and trichoblastomas in patched heterozygous knockout mice.</a> Nat. 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Y., Wang, J., Mancianti, M. L., Epstein, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinomas+arise+from+hair+follicle+stem+cells+in+Ptch1(+/-)+mice.">Basal cell carcinomas arise from hair follicle stem cells in Ptch1(+/-) mice.</a> Cancer Cell. 19, 114-124 (2011).</li><li>Grachtchouk, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+cell+carcinomas+in+mice+arise+from+hair+follicle+stem+cells+and+multiple+epithelial+progenitor+populations.">Basal cell carcinomas in mice arise from hair follicle stem cells and multiple epithelial progenitor populations.</a> J. Clin. Invest. 121, 1768-1781 (2011).</li><li>Kasper, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wounding+enhances+epidermal+tumorigenesis+by+recruiting+hair+follicle+keratinocytes.">Wounding enhances epidermal tumorigenesis by recruiting hair follicle keratinocytes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 4099-4104 (2011).</li><li>Youssef, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cell+lineage+at+the+origin+of+basal+cell+carcinoma.">Identification of the cell lineage at the origin of basal cell carcinoma.</a> Nat Cell Biol. 12, 299-305 (2010).</li><li>Yauch, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Smoothened+mutation+confers+resistance+to+a+Hedgehog+pathway+inhibitor+in+medulloblastoma.">Smoothened mutation confers resistance to a Hedgehog pathway inhibitor in medulloblastoma.</a> Science. 326, 572-574 (2009).</li><li>Buonamici, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interfering+with+resistance+to+smoothened+antagonists+by+inhibition+of+the+PI3K+pathway+in+medulloblastoma.">Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma.</a> Sci. Transl. Med. 2, 51ra70 (2010).</li><li>Dijkgraaf, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+molecule+inhibition+of+GDC-0449+refractory+smoothened+mutants+and+downstream+mechanisms+of+drug+resistance.">Small molecule inhibition of GDC-0449 refractory smoothened mutants and downstream mechanisms of drug resistance.</a> Cancer Res. 71, 435-444 (2011).</li><li>Guo, Z., Draheim, K., Lyle, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+epithelial+stem+cells+from+human+skin.">Isolation and culture of adult epithelial stem cells from human skin.</a> J. Vis. Exp. 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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Abbiamo descritto un metodo per l&#39;analisi di popolazione cellulare in BCC. Tessuti tumorali sono coerenti di molti tipi di cellule, e ciascun tipo cellulare si comporta diversamente in un determinato momento di carcinogenesi, che è molto difficile da recuperare anche nelle migliori condizioni in vitro. Usando questo protocollo, abbiamo dimostrato che lo sviluppo di carcinoma a cellule basali si accompagna l&#39;espansione delle cellule staminali epidermiche e reclutamento di cellule mieloidi. In confronto con le analisi immunoistochimica o immunofluorescenza, analisi di popolazione di cellule danno una valutazione più quantitativa delle variazioni di popolazione di cellule da anticorpi specifici per una varietà di tipi di cellule sono ora disponibili. Per questo protocollo, 10 settimane sono necessari per completare lo studio perché il cambiamento fenotipico da induzione genica richiede tempo. E &#39;quindi importante pianificare l&#39;esperimento prima del tempo. Per l&#39;isolamento delle cellule e di analisi, possono essere necessari due giorni interi. Poiché le cellule vive sono usati per analyses, è importante prenotare un FACSCalibur prima del tempo. Abbiamo anche elencato i problemi comuni quando si lavora con questo protocollo (vedi sotto). Nella nostra esperienza, di seguito sono i problemi più comuni che abbiamo incontrato: <ol><li> Scarsa separazione dell&#39;epidermide: questo può essere causato da un trattamento dispasi incompleto (prego aumentare il tempo di trattamento diapase) o di soluzione dispasi insufficiente (La pelle deve essere completamente immersa in soluzione dispasi). Usiamo almeno 5 ml di soluzione dispasi per un mouse. Il volume può variare in base alle dimensioni della pelle. </li><li> Bassa resa del numero di cellule: Può essere dovuto alla incompleta digestione con collagenasi IV. Per favore prima concentrazione collagenasi assegno o la data di scadenza. Questo può anche essere causato da insufficiente quantità di epidermide utilizzato. Inoltre, digestione enzimatica deve essere effettuata a 37 ° C con agitazione (si prega di regolare la temperatura prima di eseguire la digestione). </li><li> Grumi di cellule: Questo è molto comune per le cellule della pelle (cellule pipetteun paio di volte dopo aver attraversato il filtro (prima della centrifugazione), o l&#39;esistenza di Mg 2 + e Ca 2 + nella soluzione (si prega di utilizzare Mg 2 + e Ca 2 + libero PBS per il lavaggio delle cellule). </li><li> Troppe le cellule morte: questo potrebbe essere il risultato di tessuti degradati (si prega di utilizzare tessuti freschi), o over-digestione (evitare di incubazione con dispasi e collagenasi IV). </li></ol> Questo protocollo può essere combinato con trapianto di midollo osseo o trapianto di tessuto per esaminare l&#39;origine cella. Ad esempio, il trapianto di GFP che esprimono cellule del midollo osseo in topi letalmente irradiati ci permetterà di esaminare il contributo delle cellule del midollo osseo di fibroblasti associati al tumore e le cellule mieloidi. Allo stesso modo, i tumori della pelle possono essere trapiantate in un nuovo host mouse per esaminare le interazioni tumore-ospite. Oltre a esaminare i cambiamenti di popolazione di cellule durante la carcinogenesi, questo protocollo consentirà inoltre ai ricercatori di esaminareeffetti dei trattamenti farmacologici verso le cellule del tumore ambiente. Sebbene questo protocollo è progettato per utilizzare per analisi di popolazioni cellulari durante carcinogenesi della pelle, lievi modifiche possono essere fatte per altri tipi di cancro. In sintesi, le analisi di popolazione di cellule in modelli murini di cancro della pelle possono darci le modifiche dinamiche cellulari durante la carcinogenesi, portando ad una migliore comprensione della biologia cellulare nella trasformazione neoplastica e diversi eventi cellulari nel processo di trasformazione.

Come il tipo più comune di cancro umano, il carcinoma a cellule basali (BCC) colpisce circa 2 milioni di americani ogni anno 1. Accumulando evidenze indicano che l&#39;attivazione anormale del riccio (Hh) di segnalazione è la forza trainante alla base dello sviluppo BCC (Inviato a 2,3). Alterazioni di segnale hedgehog nel BCC comprendono mutazioni inattivanti PTCH1 4-6, mutazioni guadagno-di-funzione di SMO 7-9, e l&#39;espressione aberrante di Hh percorso fattori di trascrizione GLI1 10 e Gli2 11 o rare mutazioni inattivati ​​di Su regolatore negativo (FU ) 12. Attraverso tutti questi e altri studi, Federal Drug Administration (FDA) ha recentemente approvato l&#39;uso del segnale hedgehog inibitore Vismodegib per trattare metastatico e localmente avanzato BCC 13-15. Nonostante tutti questi risultati 16, noi ancora non comprendiamo i meccanismi molecolari e cellulari con la quale il segnale hedgehog drives carcinogenesis. Creazione di modelli animali con attivazione tessuto-specifica del segnale hedgehog è ancora importante per questi studi e per la nostra comprensione della resistenza ai farmaci. Nei topi, topi wild-type non sviluppano BCC, anche in presenza di forti dosi di agenti cancerogeni, radiazioni UV o ionizzanti. In contrasto, Ptch1 + / - topi sono suscettibili di sviluppo BCC 17,18. La penetranza di sviluppo BCC in Ptch1 + / - mice è di oltre il 50%, anche se PTCH1 18,19 + / - mice raramente sviluppano BCC full-grown se conservato in condizioni normali. Causa della letalità embrionale di Ptch1 - / -, tessuto-specifico knockout di PTCH1 è generalmente utilizzato per lo studio 20. Inoltre, l&#39;espressione condizionale pelle-specifica di oncogeno SmoM2 YFP (Krt14-CREER: R26-SmoM2 YFP o Krt14-cre: R26-SmoM2 YFP) porta alla formazione di molteplici BCC microscopici in età molto precoce, fornendo un semplice test genetico per segnalazione di Hh fannownstream di SMO 21. Ci sono tre grandi questioni della nostra conoscenza della biologia BCC. In primo luogo, l&#39;origine cellulare delle BCC non è del tutto chiaro. Mentre alcuni studi supportano l&#39;mosse del follicolo pilifero come sito cellula staminale 22-24, Youssef et al. 25 localizza il cellulare murina di origine dei tumori cutanei Hh-driven per essere nella regione nell&#39;epidermide inter-follicolare, non nel follicolo pilifero , utilizzando cellule specifiche Cre per attivare l&#39;espressione di un ROSA26-driven transgenico mutante SMO. In secondo luogo, interazioni cellulari durante lo sviluppo del BCC non sono ben compresi. E &#39;noto che i cheratinociti con segnale hedgehog attivi possono portare alla formazione di BCC, ma altri cambiamenti cellulari non sono ben compresi. Inoltre, il trattamento di Smo antagonisti nei topi può portare a farmacoresistenza 26-28. Urgono dunque nuovi obiettivi per BCC. La comprensione di questi tre problemi richiede l&#39;analisi dei cambiamenti cellulari in topi durante Carcinogenesis. Mentre diversi metodi sono stati pubblicati per la coltura dei cheratinociti, citometria a flusso e la pelle isolamento delle cellule staminali 29-31, al momento non ci sono procedure complete per l&#39;analisi di cellule in BCC del mouse. Grazie alla combinazione di metodi per modello murino di BCC, la separazione di epidermide, generazione di singole cellule da tessuti e analisi cellulari, forniremo ai lettori una serie di procedure per lo studio segnalazione cellulare, cellulari e interazioni molecolari durante lo sviluppo del BCC. Noi crediamo che questo protocollo permetterà ai lettori di vedere come ogni procedura è compiuta. Inoltre, abbiamo fornito alcuni dati per illustrare ciò che i risultati dovrebbero essere simile, e la risoluzione dei problemi per aiutare i lettori a superare le difficoltà durante l&#39;esecuzione di queste procedure.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Reagents</td>
 <td> Company</td>
 <td> Cat#</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>directPCR lysis reagent (tail) </td>
 <td>Viagen Biotech </td>
 <td>102-T </td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>proteinase K </td>
 <td> Sigma </td>
 <td>P2308 </td>
 <td>store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>ApliTag 360 taq polymerase </td>
 <td>Applied biosystems </td>
 <td>N8080155 </td>
 <td> store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tamoxifen </td>
 <td>Sigma </td>
 <td>T5648 </td>
 <td> store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Feeding needle (20 gauge) </td>
 <td>Fisher scientific </td>
 <td>01-290-9B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Dispase </td>
 <td>Roche Diagnostic </td>
 <td>04942078001</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Collagenase IV </td>
 <td>Worthington </td>
 <td>LS004189</td>
 <td>store @ -20 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cell strainer </td>
 <td>Fisher scientific </td>
 <td>08-771-2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-CD11b-PE </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td> 12-0112-81</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-Gr1-APC </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td> 17-5931-81</td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Anti-vimentin-FITC </td>
 <td>eBioscience </td>
 <td>11-9897-80 </td>
 <td>store @ 4 &deg;C</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

cell population analyses during skin carcinogenesis

Lo sviluppo del cancro è un processo a più fasi che coinvolga molti tipi cellulari, comprese le cellule tumorali, cellule precursori immunitarie, fibroblasti e cellule endoteliali. Ogni tipo di cellule subisce segnalazione e funzionale cambiamenti durante la carcinogenesi. La sfida attuale per molti ricercatori del cancro è di sezionare questi cambiamenti in ciascun tipo cellulare durante il processo più fasi in vivo. Negli ultimi anni, gli autori hanno sviluppato una serie di procedure per isolare le diverse popolazioni di cellule durante lo sviluppo del cancro della pelle utilizzando K14creER/R26-SmoM2 topi YFP. La procedura è divisa in 6 parti: 1) la generazione di topi appropriati per lo studio (K14creER + e R26-SmoM2 YFP + topi in questo protocollo), 2) che induce SmoM2 espressione YFP in pelle di topo, 3) preparazione del mouse biopsie cutanee, 4) isolamento epidermide dalla pelle; 5) preparare le singole cellule di epidermide; 6) l&#39;etichettatura popolazioni di cellule singole per l&#39;analisi di citometria a flusso.Generazione di numero sufficiente di topi con genotipo destra è il passo limitante in questo protocollo, che può richiedere fino a due mesi. Il resto dei passaggi prendere un paio di ore ad alcuni giorni. All&#39;interno di questo protocollo, includiamo anche una sezione per la risoluzione dei problemi. Anche se ci concentriamo sul cancro della pelle, questo protocollo può essere modificato per fare domanda per altri modelli animali di malattie umane.

E &#39;noto che i topi non sviluppano carcinomi a cellule basali salvo Hh attivazione segnalazione. Figura 1 mostra il fenotipo pelle seguente espressione indotta di oncogeno spianato SmoM2 YFP. Figura 2 mostra l&#39;analisi di cellule mieloidi in topi normali e di tumore. CD11b + Gr1 + cellule derivano da cellule mieloidi, e alcuni di loro sono cellule derivate mieloidi soppressore. In situazione normale, il CD11b + + Gr1 popolazione cellulare è difficilmente rilevabile, ma aumenta in risposta ad infiammazione o sviluppo del tumore. Abbiamo mostrato che l&#39;espressione indotta di SmoM2YFP nei risultati cutanee in un aumento CD11b + Gr1 + cellule. Attualmente, i meccanismi molecolari alla base di questo cambiamento nella BCC non sono chiare. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig1.jpg" /> Figura 1. Morphologicacambia l dopo induzione SmoM2YFP in pelle di topo. alto mostra un diagramma di genotipi del mouse. Il pannello centrale: la K14creER + e R26-SmoM2 YFP + topo trattato con tamoxifene mostrato grossolanamente anomalia nella pelle (a destra), tumori cutanei nella sezione H &amp; E (a sinistra). Il pannello inferiore: il mouse senza SmoM2YFP induzione mostrava normale in cerca della pelle (a destra) e non morfologia anormale nella sezione H &amp; E (a sinistra). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50311/50311fig2.jpg" /> Figura 2. Analisi del flusso di CD11b + Gr1 + cellule. Per esaminare il cambiamento di CD11b + Gr1 + cellule durante lo sviluppo del cancro della pelle, abbiamo isolato cellule singole e colorate con anticorpi marcati con fluorescenza a CD11b e Gr1. Dopo l&#39;analisi con FlowJo, abbiamo notato un aumento di questa popolazione di cellule nei tessuti cutanei da topi trattati con tamoxifene.

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Cell Population Analyses During Skin Carcinogenesis

Carcinogenesi è un processo che coinvolge le interazioni tra cellule tumorali e il microambiente cancro. Per sezionare gli eventi molecolari, si ha la necessità di isolare diverse popolazioni di cellule in diverse fasi durante lo sviluppo del cancro. Utilizzando un modello murino di carcinoma a cellule basali, si descrive un protocollo per l&#39;analisi di cellule durante la carcinogenesi.

Analisi popolazione cellulare Durante carcinogenesi della pelle

Cancer development is  a multiple-step process involving many cell types including cancer precursor  cells, immune cells, fibroblasts and endothelial ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

12.3K Views.  Indiana University. Carcinogenesi è un processo che coinvolge le interazioni tra cellule tumorali e il microambiente cancro. Per sezionare gli eventi molecolari, si ha la necessità di isolare diverse popolazioni di cellule in diverse fasi durante lo sviluppo del cancro. Utilizzando un modello murino di carcinoma a cellule basali, si descrive un protocollo per l'analisi di cellule durante la carcinogenesi.

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Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&beta; using a Whole Blood Stimulation Assay

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues as well as altered cytokine homeostasis. The innate immune system plays a crucial role in recognizing pathogens and other endogenous danger stimuli. One of the major cytokines released by innate immune cells is Interleukin (IL)-1. Therefore, we utilize a whole blood stimulation assay in order to measure the secretion of inflammatory cytokines and specifically of the pro-inflammatory cytokine IL-1&beta; 1, 2, 3.
Patients with genetic dysfunctions of the innate immune system causing autoinflammatory syndromes show an exaggerated release of mature IL-1&beta; upon stimulation with LPS alone. In order to evaluate the innate immune component of patients who present with inflammatory-associated pathologies, we use a specific immunoassay to detect cellular immune responses to pathogen-associated molecular patterns (PAMPs), such as the gram-negative bacterial endotoxin, lipopolysaccharide (LPS). These PAMPs are recognized by pathogen recognition receptors (PRRs), which are found on the cells of the innate immune system 4, 5, 6, 7. A primary signal, LPS, in conjunction with a secondary signal, ATP, is necessary for the activation of the inflammasome, a multiprotein complex that processes pro-IL-1&beta; to its mature, bioactive form 4, 5, 6, 8, 9, 10.
The whole blood assay requires minimal sample manipulation to assess cytokine production when compared to other methods that require labor intensive isolation and culturing of specific cell populations. This method differs from other whole blood stimulation assays; rather than diluting samples with a ratio of RPMI media, we perform a white blood cell count directly from diluted whole blood and therefore, stimulate a known number of white blood cells in culture 2. The results of this particular whole blood assay demonstrate a novel technique useful in elucidating patient cohorts presenting with autoinflammatory pathophysiologies.

Accurate and Simple Measurement of the Pro-inflammatory Cytokine IL-1&#946; using a Whole Blood Stimulation Assay

We describe a simple immunoassay to measure the production of pro-inflammatory cytokines, such as IL-1 beta production, in patients presenting with autoinflammatory phenotypes. By activating cells in whole blood cultures with pathogen-associated molecular patterns, specifically with lipopolysaccharide, cytokine secretion can be conveniently evaluated in whole blood supernatants.

Misurazione accurata e semplice della citochina pro-infiammatoria IL-1β utilizzando un intero saggio stimolazione del sangue

Inflammatory processes resulting from the secretion of soluble mediators by immune cells, lead to various manifestations in skin, joints and other tissues ...

Ricerca

Medicina

Renal Capsule Xenografting and Subcutaneous Pellet Implantation for the Evaluation of Prostate Carcinogenesis and Benign Prostatic Hyperplasia

New therapies for two common prostate diseases, prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend critically on experiments evaluating their hormonal regulation. Sex steroid hormones (notably androgens and estrogens) are important in PrCa and BPH; we probe their respective roles in inducing prostate growth and carcinogenesis in mice with experiments using compressed hormone pellets. Hormone and/or drug pellets are easily manufactured with a pellet press, and surgically implanted into the subcutaneous tissue of the male mouse host. We also describe a protocol for the evaluation of hormonal carcinogenesis by combining subcutaneous hormone pellet implantation with xenografting of prostate cell recombinants under the renal capsule of immunocompromised mice. Moreover, subcutaneous hormone pellet implantation, in combination with renal capsule xenografting of BPH tissue, is useful to better understand hormonal regulation of benign prostate growth, and to test new therapies targeting sex steroid hormone pathways.

We describe the manufacture of compressed hormone pellets, as well as subcutaneous surgical implantation into mice. This strategy can be combined with the growth of cell and tissue xenografts under the renal capsule of athymic nude mice to evaluate hormonal carcinogenesis and regulation of benign prostate growth.

Renale Capsule xenotrapianto e sottocutanea Pellet impianto per la valutazione di carcinogenesi della prostata e dell&#39;iperplasia prostatica benigna

New therapies for two common prostate diseases,  prostate cancer (PrCa) and benign prostatic hyperplasia (BPH), depend  critically on experiments ...

Dried Blood Spot Collection of Health Biomarkers to Maximize Participation in Population Studies

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spots meet this need, and can be collected in the field with high response rates. These elements are particularly important in longitudinal study designs including interventions where attrition is critical to avoid, and high response rates improve the interpretation of results. Dried Blood Spot sample collection is simple, quick, relatively painless, less invasive then venipuncture, and requires minimal field storage requirements (i.e.&#160;samples do not need to be immediately frozen and can be stored for a long period of time in a stable freezer environment before assay). The samples can be analyzed for a variety of different analytes, including cholesterol, C-reactive protein, glycosylated hemoglobin, numerous cytokines, and other analytes, as well as provide genetic material. DBS collection is depicted as employed in several recent studies.

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease or health. In population and social sciences, biomarkers need to be easy to obtain, transport, and analyze. Dried Blood Spot (DBS) collection meets this need, can be collected in the field with high response rates&#160;and analyzed for a variety of biomarkers.

Sangue secco Spot Raccolta di salute biomarcatori per massimizzare la partecipazione negli studi di popolazione

Biomarkers are directly-measured biological indicators of disease, health, exposures, or other biological information. In population and social sciences, ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Sequenziale<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di osteogeniche cellule staminali / progenitrici durante la frattura di riparazione

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

Murino Endoscopia per<em&gt; In Vivo</em&gt; Guarigione Imaging Multimodale di Cancerogenesi e valutazione della ferita intestinale e infiammazione

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Un Mouse fetale Modello Skin of Wound Repair scarless

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, diagnosis, prognosis and treatment. In recent years, microRNAs (miRNAs) have emerged as promising alternate biomarkers for prostate cancer diagnosis and prognosis. However, the development of miRNAs as effective biomarkers for prostate cancer heavily relies on their accurate detection in clinical tissues. miRNA analyses in prostate cancer clinical specimens is often challenging owing to tumor heterogeneity, sampling errors, stromal contamination etc. The goal of this article is to describe a simplified workflow for miRNA analyses in archived FFPE or fresh frozen prostate cancer clinical specimens using a combination of quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH). Within this workflow, we optimize the existing methodologies for miRNA extraction from FFPE and frozen prostate tissues and expression analyses by Taqman-probe based miRNA RT-PCR. In addition, we describe an optimized method for ISH analyses formiRNA detection in prostate tissues using locked nucleic acid (LNA)- based probes. Our optimized miRNA ISH protocol can be applied to prostate cancer tissue slides or prostate cancer tissue microarrays (TMA).

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

Analisi miRNA nel tumore alla prostata tessuti cliniche

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

A Method of Trigonometric Modelling of Seasonal Variation Demonstrated with Multiple Sclerosis Relapse Data

This report describes a novel Stata-based application of trigonometric regression modelling to 55 years of multiple sclerosis relapse data from 46 clinical centers across 20 countries located in both hemispheres. Central to the success of this method was the strategic use of plot analysis to guide and corroborate the statistical regression modelling. Initial plot analysis was necessary for establishing realistic hypotheses regarding the presence and structural form of seasonal and latitudinal influences on relapse probability and then testing the performance of the resultant models. Trigonometric regression was then necessary to quantify these relationships, adjust for important confounders and provide a measure of certainty as to how plausible these associations were. Synchronization of graphing techniques with regression modelling permitted a systematic refinement of models until best-fit convergence was achieved, enabling novel inferences to be made regarding the independent influence of both season and latitude in predicting relapse onset timing in MS. These methods have the potential for application across other complex disease and epidemiological phenomena suspected or known to vary systematically with season and/or geographic location.

Combining plot analysis with trigonometric regression is a robust method for exploring complex, cyclical phenomena such as relapse onset timing in multiple sclerosis (MS). This method enabled unbiased characterisation of seasonal trends in relapse onset permitting novel inferences around the influence of seasonal variation, ultraviolet radiation (UVR) and latitude.

Un metodo di trigonometrica Modellazione di variazione stagionale dimostrata con sclerosi multipla recidiva dati

This report describes a novel Stata-based application of trigonometric regression modelling to  55 years of multiple sclerosis relapse data from 46 ...

Cutaneous Surgical Denervation:  A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies have suggested that nerves may also modulate skin disorders including atopic dermatitis, psoriasis and cancer. Here, we describe protocols for testing the requirement for nerves in maintaining a cutaneous mechanosensory organ, the touch dome (TD). Specifically, we discuss methods for genetically labeling, harvesting and visualizing TDs by whole-mount staining, and for performing unilateral surgical denervation on mouse dorsal back skin. Together, these approaches can be used to directly compare TD morphology and gene expression in denervated as well as sham-operated skin from the same animal. These methods can also be readily adapted to examine the requirement for nerves in mouse models of skin pathology. Finally, the ability to repeatedly sample the skin provides an opportunity to monitor disease progression at different stages and times after initiation.

This article includes detailed protocols for genetic labeling of mouse skin, surgical denervation, skin biopsy and visualizing labeled epithelia by whole-mount &#946;-galactosidase staining. These methods can be used to test the requirement for nerves in mouse models of normal and pathological skin.

Cutanea denervazione chirurgica: Un metodo per il test il requisito per i nervi in ​​modelli murini di malattia della pelle

Cutaneous somatosensory nerves function to detect diverse stimuli that act upon the skin. In addition to their established sensory roles, recent studies ...

Assessment of Child Anthropometry in a Large Epidemiologic Study

A high proportion of children have overweight and obesity in the United States and other countries. Accurate assessment of anthropometry is essential to understand health effects of child growth and adiposity. Gold standard methods of measuring adiposity, such as dual X-ray absorptiometry (DXA), may not be feasible in large field studies. Research staff can, however, complete anthropometric measurements, such as body circumferences and skinfold measurements, using inexpensive portable equipment. In this protocol we detail how to obtain manual anthropometric measurements from children, including standing and sitting height, weight, waist circumference, hip circumference, mid-upper arm circumference, triceps skinfold thickness, and subscapular skinfold thickness, and procedures to assess the quality of these measurements. To demonstrate accuracy of these measurements, among 1,110 school-aged children in the pre-birth cohort Project Viva we calculated Spearman correlation coefficients comparing manual anthropometric measurements with a gold standard measure of body fat, DXA fat mass1. To address reliability, we evaluate intra-rater technical error of measurement at a quality control session conducted on adult female volunteers.

In epidemiologic studies of children, well-trained research staff can accurately and precisely assess weight, height, sitting height, skinfold thicknesses, and body circumferences.

La valutazione del bambino Antropometria In un ampio studio epidemiologico

A high proportion of children have overweight and obesity in the United States and other countries. Accurate assessment of anthropometry is essential to ...