I tumori della regione della testa e del collo stanno diventando sempre più diffusi. Tuttavia, c'è una comprensione limitata del microambiente tumorale e dei meccanismi di resistenza al trattamento in questa regione. Questa tecnica può essere utilizzata per ricapitolare il microambiente nativo dei tumori testa/collo in modo accessibile e produce manifestazioni cliniche simili a quelle osservate nell'uomo.
Quando la coltura delle cellule tumorali ha raggiunto il 70% di confluenza, lavare le cellule tre volte con PBS freddo per lavaggio e attaccare le cellule con abbastanza 0,25% di tripside per coprire la superficie inferiore del pallone di coltura. Dopo tre o quattro minuti nell'incubatore di coltura cellulare, confermare il distacco al microscopio leggero e neutralizzare la tripina con 12 millilitri di mezzo DMEM F12, integrato con siero bovino fetale. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 millilitri e mescolare le cellule da tre a quattro volte per inversione.
Quindi raccogliere le cellule per centrifugazione e sospendere di nuovo il pellet nel siero e dmem privo di antibiotici a una volta 10 alla sesta cellule tumorali per 50 microlitri di media concentrazione sul ghiaccio. Immediatamente prima dell'iniezione, mescolare le cellule a una o una sospensione delle cellule tumorali al rapporto della matrice della membrana basale sul ghiaccio. Caricare una siringa da 0,5 millilitri dotata di un ago calibro 23 con 100 microlitri di cellule per animale ricevente.
Posizionare le siringhe sul ghiaccio e confermare una mancanza di risposta al dito del dito in un topo anestetizzato. Successivamente, inserire l'ago nella regione buccale destra o sinistra attraverso lo spazio aperto disponibile su entrambi i lati della bocca mantenendo la siringa parallela alla regione del buccale mentre si trova all'interno della cavità orale per facilitare l'iniezione dell'intero volume di 100 microliter della sospensione della matrice della membrana basale cellulare per un periodo di cinque secondi. Mantenere la siringa in posizione per altri cinque secondi per assicurarsi che tutto il materiale sia stato iniettato prima di ritirare delicatamente la siringa.
I tumori diventeranno grossolanamente visibili tra circa una settimana. Una settimana dopo l'iniezione, utilizzare le pinze per misurare la lunghezza e la larghezza di ogni tumore per determinare il volume tumorale da una a due volte a settimana. E misurare il peso di ogni animale per valutare gli effetti della crescita tumorale sull'alimentazione.
All'endpoint sperimentale appropriato, utilizzare forbici affilate e forcep smussate per fare un'incisione cutanea attraverso la linea mediana nel collo. E inserire delicatamente le forbici sotto la pelle che coprono il tumore per creare sacche d'aria spingendo le forbici attraverso e nella pelle. Una volta che la pelle è sufficientemente staccata dal tumore, asportare i linfonodi drenante per evitare che il tessuto tumorale sia confuso dalla presenza di tessuto linfatico e tagliare i bordi del tumore fino a quando l'intero volume non viene staccato.
Per elaborare il tumore per l'analisi a valle, tagliare il tumore in pezzi di dimensioni da uno a due millimetri e posizionare i pezzi in un tubo conico da 50 millilitri contenente collagenasi tre, DNA uno e inibitore della tripparina. Dopo aver incubato i pezzi tumorali a 37 gradi Celsius per 30 minuti, con scuotimento ogni 10 minuti, aggiungere 20 millilitri di HBSS al tubo e passare la sospensione contenente i pezzi tumorali attraverso un colino di nylon pour da 70 micrometri. Utilizzare uno stantuffo per siringhe da cinque millilitri per schiacciare i pezzi tumorali nel colino e aggiungere altri 10 millilitri di HBSS attraverso il colino.
Spingi giù le cellule per centrifugazione. Sospendere il pellet in due o tre millilitri di tampone dilisi dei globuli rossi con pipettazione rigorosa, neutralizzando lalisi con 20 millilitri di HBSS fresco dopo due minuti a temperatura ambiente. Quindi sospendere di nuovo le cellule in altri 20 millilitri di HBSS per un'altra centrifugazione e filtrare le cellule attraverso un filtro di versamento di 40 micrometri per rimuovere eventuali detriti finali dalla sospensione della cellula tumorale.
I tumori LY2 crescono ad un tasso più elevato, rispetto ai tumori B4B8. E i topi che mostrano uno spostamento della mascella sviluppano rapidamente la perdita di peso, a causa della disfagia. La sopravvivenza mediana nei topi LY2 è anche meno della metà di quella osservata per i topi che portano tumore B4B8.
La risonanza magnetica dei topi portanti di tumore mostra tumori ben delimitati che si estendono nello strato interno della mucosa buccale, ma non nella lingua o in altri organi vicini. L'esame istologico indica che tutti i topi portanti di tumore LY2 sviluppano carcinoma a cellule squamose scarsamente differenziato, mentre i topi che portano tumori B4B8 sviluppano carcinoma a cellule squamose moderatamente differenziato. Tutti i topi portanti di tumore LY2 hanno anche necrosi istologicamente confermata, con la maggior parte che dimostra necrosi da moderata a grave.
In questo esperimento rappresentativo, un tumore LY2 è stato raccolto e lavorato tre settimane dopo l'iniezione di cellule tumorali della regione buccale, come dimostrato. Le cellule immunitarie positive al CD45 rappresentavano il 7,3% della popolazione totale di cellule tumorali. Le cellule mieloidi positive al CD11b rappresentavano il 37,8% di tutte le cellule positive del CD45, la maggior parte delle quali erano determinate come macrofagi F480-positivi, con piccole popolazioni di neutrofili e cellule soppressori derivate da mieloidi osservate.
Le cellule T comprendevano il 15,9% della popolazione di cellule immunitarie positiva al CD45, il 53,4% delle quali erano cellule T regolatorie foxp3 positive cd4. Le cellule killer naturali comprendevano meno del 2% di tutte le cellule positive del CD45. È importante praticare l'iniezione al fine di sviluppare fiducia e comfort nel tenere l'ago e il topo ricevente e nell'esporre la bocca dell'animale.
Una volta eseguita con successo la procedura, possono essere eseguiti esperimenti che comportano la valutazione della risposta tumorale alla terapia o la valutazione dei fattori intrinseci e microambientali del tumore. Questa tecnica ha spianato la strada alla progettazione di uno studio clinico avviato da investigatori, valutando gli effetti della combinazione della radioterapia con la terapia anti-PL1 nei pazienti con cancro alla testa e al collo.
