Gli autori ringraziano sentitamente il Dott. KK Fenrich, Dr. MC. Amoureux, P. Weber e A. Jaouen per voti discussioni; M. Hocine, C. Meunier, M. Metwaly, S. Bensemmane, J. Bonnardel, il personale della struttura animale in IBDML e il personale della piattaforma di imaging PicSIL a IBDML per il supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal Institut National du Cancer (INCA-DGOS-INSERM6038) a GR, Agence Nationale de la Recherche (ANR JCJC PathoVisu3Dyn), Fédération pour la Recherche sur le Cerveau (FRC) per FD, per borse di studio dalla Fédération de la Recherche Médicale e Cancéropôle PACA alla CR.

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con la legislazione francese e in conformità alla Direttiva del Consiglio della Comunità Europea del 24 novembre 1986 (86/609/CEE) per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. La ricerca sugli animali è stata autorizzata dalla Direzione Dipartimentale des Servizi Vétérinaires des Bouches-du-Rhône (licenza D-13-055-21) e approvato dal comitato etico della Provenza Costa Azzurra n ° 14 (Progetto 87-04122012) . 1. Spheroids Preparazione <ol><li> Preparazione delle piastre Petri agarosio rivestite <ol><li> Mescolare 1 g di agarosio con 100 ml di mezzo di coltura cellulare non addizionato con siero fetale bovino. Utilizzare un forno a microonde (850 W per 40 secondi, poi 3 x 15 sec; agitare la soluzione tra ogni sessione microonde) bollire la soluzione e per sciogliere completamente i agarosio. Autoclave questa soluzione di agarosio all&#39;1% per 20 min a 120 ° C per assicurare steri. lità Nota: Fare attenzione a sciogliere completamente l&#39;agarosio prima che il protocollo autoclave. Disomogeneità può compromettere la formazione di sferoidi. </li><li> Una volta recuperato dall&#39;autoclave, versare 10 ml della soluzione di agarosio 1% in 100 x 20 mm piastre di Petri. Lasciare il Petri-piatti 20 min a temperatura ambiente per permettere la soluzione di agarosio 1% a solidificare. </li><li> Aggiungere 10 ml di PBS sopra il agarosio a mantenere l&#39;umidità. Sigillare il coperchio delle scatole di Petri agarosio rivestite avvolgendoli con parafilm per evitare l&#39;evaporazione. Piastre di Petri possono essere conservati per un massimo di due mesi a 4 ° C se adeguatamente umidificata dal livello di PBS. </li></ol></li><li> Cultura Spheroid <ol><li> In un 75 centimetri 2 fiasco, coltivare le cellule del glioma nel loro mezzo raccomandata come un monostrato. </li><li> Sostituire il PBS da uno dei agarosio rivestite piastra Petri 1% in 1,5 ml di &quot;medium condizionato&quot; raccolti dal pallone contenente il monostrato di cellule di glioma 2Ds. </li><li> Rimuovere il terreno dal pallone contenente il monostrato di cellule di glioma 2D. </li><li> Lavare delicatamente il monostrato con 10 ml di PBS. </li><li> Aggiungere 2 ml di 0,05% di una soluzione di tripsina / EDTA e incubare la beuta 4 minuti a 37 ° C. Nota: Il tempo di incubazione può variare a seconda della linea cellulare utilizzata. </li><li> Aggiungere 8 ml di terreno di coltura per fermare l&#39;azione della tripsina, lavare delicatamente la sospensione cellulare. Nota: Fare attenzione a non svuotare aria nella sospensione cellulare in quanto aumenta la morte cellulare. </li><li> Mettere 6 ml della sospensione di cellule in una fiala sterile. </li><li> Centrifugare la fiala 4 min a 800 rpm. </li><li> Rimuovere il surnatante e delicatamente risospendere il sedimento cellulare in 3 ml di terreno di coltura. </li><li> Seed la sospensione cellulare nel piatto preparato agarosio rivestite Petri. </li><li> Mettere la piastra di Petri a 37 ° C in una atmosfera di CO 2 5% per 2 o 3 giorni finché si formano sferoidi del diametro desiderato. </li></ol></li></ol&gt; 2. Spheroid e Window impianto <ol><li> Preparazione del sistema di iniezione <ol><li> Capillari di vetro pulita (1 mm di diametro) per sonicazione in etanolo al 70% per 10 min. Lavare due volte con acqua prima immissione all&#39;interno di un incubatore fino a secco. </li><li> Tirare diversi capillari di vetro puliti con un estrattore pipetta al fine di preparare una piccola riserva. </li><li> Rompere la punta del capillare tirato da graffi estremità su un pezzo di carta velina avere una estremità smussato della dimensione desiderata: tipicamente un diametro esterno di 300-350 micron e un diametro interno di 250-300 micron. Durante questo processo di formatura, controllare il diametro del capillare usando un macroscopio cui oculare è dotato di una mira graduata. </li><li> Collegare l&#39;estremità non smussato del capillare ad un collettore 3 vie con un pezzo di tubo di plastica il cui diametro interno adatta al diametro esterno del capillare. </li><li> Utilizzo di plastica Tubing, collegare gli altri due modi di collettore di un 25 microlitri siringa microlitro e una siringa da 1 ml caricato con olio minerale compatibile isto. </li><li> Regolare il selettore collettore di stabilire un percorso tra la siringa microlitro e la siringa da 1 ml. Rimuovere il pistone della siringa microlitri e iniettare olio minerale all&#39;indietro nella siringa microlitro finché non fuoriesce spingendo il pistone della siringa da 1 ml. Sostituire il pistone della siringa microlitri pur non avendo cura di lasciare bolle d&#39;aria nel tubo. </li><li> Regolare il selettore collettore di stabilire un percorso tra il capillare e la siringa da 1 ml. Riempire il capillare con olio minerale fino a quando non fuoriesce dalla punta facendo attenzione a non lasciare bolle d&#39;aria nel tubo. </li><li> Regolare il selettore collettore per stabilire una connessione tra la siringa microlitro e capillare. Espellere circa 10 ml di olio minerale. </li><li> Immergere la punta capillare nella soluzione PBSe usando lo spessore della siringa microlitri, aspirare 5μl di PBS nel capillare. Si noti che il menisco tra olio e PBS è chiaramente visibile. </li><li> Fissare il capillare su un micromanipolatore 3 assi montaggio sotto il macroscopio intervento chirurgico. Questo sistema viene utilizzato per indirizzare il capillare al sito di iniezione sotto controllo visivo. </li></ol></li><li> Impianto Spheroid <ol><li> Leggermente sedare il mouse per inalazione di isoflurano in una camera di induzione (1,5% in aria durante 1 a 1,5 min). </li><li> Anestetizzare l&#39;animale con una iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina / xilazina (120 mg / kg, 12 mg / kg). Si noti che l&#39;anestesia spesso riduce la temperatura corporea dell&#39;animale. Si raccomanda di procedere con la chirurgia in una stanza a 26 ° C e per mantenere caldo animale con un cuscinetto riscaldante termocontrollata sottostante. </li><li> Applicare una pomata oculare per evitare il disseccamento degli occhi. </li><li> Radere il cuoio capelluto dell&#39;animale. </li><li> Luogol&#39;animale in un telaio stereotassico utilizzando auricolari bar e un boccaglio. </li><li> Pulire la pelle con povidone iodio (3% sapone, quindi soluzione al 10%). </li><li> Fare un 1 cm di lunghezza incisione longitudinale al centro del cuoio capelluto con un bisturi. Utilizzando forbici tagliare e rimuovere la pelle sopra le ossa parietali. </li><li> Con una lama da bisturi rimuovere delicatamente il periostio sopra il cranio. Applicare generosamente cianoacrilato sopra l&#39;osso per generare una superficie ruvida per dopo cemento aderenza. </li><li> Perforare l&#39;osso parietale sotto un macroscopio chirurgica per generare una craniotomia di diametro di 4 mm. Ottimo aggiungere PBS ghiacciato contenente Pencillin (1.000 U / ml) e Streptomicin (1 mg / ml) durante la procedura generale per prevenire il riscaldamento. Rimuovere i piccoli frammenti ossei con una pinza e una garza sterile bagnata. Fate attenzione a forare di almeno 1 mm di distanza da suture del cranio parietali per evitare emorragie. </li><li> Sottile l&#39;osso al confine della craniotomia in cui verrà sigillato la finestra di vetro. Obiettivo è quello di indirizzo essicurarsi dopo posizionamento planare della finestra di vetro con massima superficie di contatto tra il cervello e il vetro. Rimuovere lentamente l&#39;osso con una pinza e pulire la durata mater esposta con la soluzione PBS. </li><li> Prendete un diametro di 5 millimetri rotonda vetrino di vetro, pulirlo con alcool ed asciugarlo con carta velina. Tentare di utilizzare il coprioggetto da coperchio per la craniotomia e confermare che una grande superficie piana del cervello entra in contatto con il vetro. Se necessario, rimuovere il vetrino di un ulteriore sottili le ossa laterali. Proseguire fino a quando il cervello può ottenere spremuto piatto se applicare delicatamente pressione sul vetrino una volta sul posto. </li><li> Pulire nuovamente il vetrino con l&#39;alcol, asciugarlo con carta velina, e salvarlo parte. </li><li> Con un ago 26 gauge fare un foro nella dura madre nel centro della craniotomia evitando però principali vasi sanguigni. Assicurarsi di non danneggiare il parenchima cerebrale come lo scopo di questa fase è solo per aprire la durata mater. </li><li> Pulire delicatamente la durata mater with soluzione PBS per rimuovere il sangue emorragico. Coprire con un foglio di carta velina mentre si prepara l&#39;iniezione sferoide. </li><li> Con il sistema di iniezione sferoide preparato al punto 2.1, succhiare uno sferoide rotondo montaggio del diametro interno capillare (circa 200-250 micron) dalla piastra Petri preparato al punto 1.2. Spheroid dovrebbe venire con circa 5 ml terreno di coltura. Dovrebbe cadere alla punta della capillarità sotto il suo peso. </li><li> Rimuovere la carta velina bagnata utilizzati per coprire la craniotomia e posizionare l&#39;animale sotto il sistema di iniezione. </li><li> Abbassare la pipetta di iniezione fino a toccare il foro praticato nella dura madre. Quindi, abbassare nuovamente da 250 micron. Attendere 30 sec. </li><li> Iniettare lentamente sferoide utilizzando il pistone della siringa microlitro (2-3 ml) mentre pompare il liquido in eccesso con un sottile foglio di carta tissue. Attendere 30 secondi e poi sollevare delicatamente la pipetta di iniezione da 50 micron verso la superficie. Attendere ancora 30 sec e ripett la procedura di sollevamento a passi di 50 pm fino alla superficie. I tempi di attesa evita l&#39;estrazione dello sferoide che si attacca alla pipetta. </li><li> Confermare la presenza dello sferoide nel cervello utilizzando un macroscopio fluorescenza. </li><li> Mescolare 100-300 micron di diametro reticolati perline gel di destrano con la soluzione PBS in una capsula di Petri. Attendere 1min e pescare alcune perle idratati. Metterli con l&#39;osso adiacente alla craniotomia. </li><li> Sotto il controllo macroscopico, scegliere una perlina di diametro simile alla dimensione dell&#39;apertura dura madre. Tagliare il cordone di destrano gel reticolato in due metà con pinze. </li><li> Mettere delicatamente un destrano gel emi-bead reticolato nel foro di iniezione con la faccia convessa verso il sferoide. Fare attenzione a non rimuovere il sferoide e premere delicatamente verso il basso fino alla frontiera del concavo entrare in contatto con l&#39;ambiente circostante dura madre. </li><li> Mettere una goccia di colla cianoacrilato su un vetrino; immergere la punta di uno stuzzicadenti nel Drop di prendere una piccola quantità di colla. Sigillare rapidamente i bordi del destrano gel emi-bead reticolato all&#39;adiacente dura madre mediante stampaggio colla intorno. Aver cura di effettuare movimenti rapidi e precisi per evitare l&#39;incollaggio del destrano gel emi-bead reticolato allo stuzzicadenti. Evitare eccesso di colla che può diffondersi e ostacolare se non impedire l&#39;imaging volta essiccato. Attendere 2 minuti per asciugare la colla e poi pulire la craniotomia e l&#39;osso circostante con soluzione PBS. </li></ol></li><li> Finestra impianto <ol><li> Mettere il 5 mm di diametro intorno coprioggetto sopra la craniotomia (vedi 2.2.12). I bordi del coprioggetto devono essere sul cranio diluito al l&#39;esterno della craniotomia. Il coprioggetto deve essere in contatto con la dura madre e l&#39;osso assottigliato sui bordi. E &#39;molto importante avere un contatto diretto tra la dura madre e il vetrino di vetro altrimenti tessuto cicatriziale può sviluppare e impedire chiarezza ottica. </li><li> Con un tessuto, assorbire il PBS su °bordi e coprioggetto in modo che la soluzione non copre completamente la craniotomia quando si applica una piccola pressione nel centro del vetrino. Questo farà sì che l&#39;osso, vetro e cervello sono incollati insieme sul lato della regione di interesse. </li><li> Mantenere una leggera pressione al centro del vetrino con una pinza mentre delicatamente applicando cianoacrilato al confine tra l&#39;osso e il vetrino. La colla spontaneamente espandersi fino all&#39;interfaccia con la soluzione PBS. Soluzione fungerà da barriera dato l&#39;idrofobicità della colla. Tenuta dovrebbe essere efficace in meno di un minuto, ma prendere una cura estrema di non spostare il vetrino finché non viene risolto. Ciò altrimenti causare perdite cianoacrilato sulla dura madre quindi portare ad un fallimento della chirurgia. </li><li> In caso colla sarebbe diffusa sulla parte superiore del vetro, rimuoverlo con una lama micro-bisturi effettuando movimenti a spirale altrimenti può ridurre chiarezza ottica. Attenzione a non rompere il vetrino di vetro During la procedura a causa della pressione eccessiva. </li><li> Consolidare la fissazione vetro applicando cemento dentale sui bordi del coprioggetto verso il cranio adiacente. Assicurati di coprire l&#39;intero cranio esposto fino al cuoio capelluto. Con cemento in più, costruire pareti laterali intorno al vetrino per creare il pool necessaria per l&#39;immersione dell&#39;obiettivo. Il cemento dentale curerà in meno di 10 min. </li></ol></li></ol> 3. Assistenza post-operatoria e preparazione per l&#39;imaging <ol><li> Assistenza post-operatoria <ol><li> Rimuovere il mouse dal telaio stereotassico, iniettare Dexamethazon (0,2 mg / kg) e Rimadyl (5 mg / kg) sc sulle regioni pelvica e la sua giaceva in una gabbia con un caldo tessuto-nido. </li><li> Monitorare l&#39;animale fino a quando gli effetti dell&#39;anestesia sono scomparsi. In generale 2 a 3 ore dopo l&#39;intervento chirurgico, i topi sono completamente mobile. Assicurarsi che l&#39;animale ha un facile accesso al cibo e all&#39;acqua. Fornire l&#39;animale con agarosio contenente glucosio (agarosio3%, glucosio 3%). </li><li> Monitorare il peso dell&#39;animale ogni giorno e iniettare Dexamethazon (0,2 mg / kg) e Rimadyl (5 mg / kg) sc per la prima 10d dopo l&#39;intervento chirurgico. Per considerazioni etiche, eutanasia i topi quando la perdita supera il 15% del suo peso originale. Pressione intracranica aumenta con le dimensioni del tumore che porta a difficoltà motorie per l&#39;animale. Questo è linea cellulare tumorale dipendente e si verifica a vari ritardi post-operatorie. Particolare attenzione dovrebbe essere presa per caratterizzare il punto finale della sperimentazione con la linea cellulare utilizzata. </li></ol></li><li> Preparazione per l&#39;imaging <ol><li> Leggermente sedare il mouse per inalazione di isoflurano in una camera di induzione (1,5% in aria per 1 a 1,5 min). </li><li> Anestetizzare l&#39;animale con una iniezione intraperitoneale di una miscela di ketamina / xilazina (100 mg / kg, 10 mg / kg). Un tale anestesia permette tipicamente 45 min di osservazione. Per eseguire sessioni di imaging più lunghi, mouse viene posizionato sotto inalazione continua di isoflurano inaria (0,25-0,75%). </li><li> Applicare una pomata oculare per evitare il disseccamento degli occhi. </li><li> Mettere l&#39;animale su un telaio stereotassico e bloccare il cranio con le earbars. </li><li> Per visualizzare i vasi sanguigni, un colorante fluorescente può essere iniettato per via endovenosa. </li><li> Se la finestra appare sporco, può essere pulito rimuovendo delicatamente i detriti con una lama sottile e l&#39;angolo di un tessuto. Non utilizzare alcool per pulire la finestra in quanto non sempre è compatibile con cemento dentale e può raffreddare il cervello sotto la finestra. </li></ol></li></ol>

<ol>
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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Questo approccio consente l&#39;uso di metodi di imaging ottico per monitorare per giorni e settimane la crescita di un glioma ortotopicamente impiantato. Lo stesso animale può successivamente essere sottoposto a qualsiasi modalità di imaging cerebrale durante il corso della patologia; eppure la preparazione specifica microscopia a due fotoni offre l&#39;opportunità unica di ottenere una risoluzione subcellulare all&#39;interno del cervello dell&#39;animale vivente. Il nostro protocollo presenta il vantaggio di far r...

Glioblastoma multiforme appare come la forma più aggressiva di tumore cerebrale negli adulti con una sopravvivenza mediana di 12 mesi e 5 anni tasso di sopravvivenza del 5%. Gestione clinica si basa sulla chirurgia, radioterapia e chemioterapia spesso usati in combinazione. Tuttavia, gli effetti di questi trattamenti rimangono palliative 1-3. Fino ad ora, la maggior parte degli studi neuro-oncologia si basano su tecniche che sono solo in grado di fornire una visione statica ed eseguiti su grandi coorti di tumore animali recanti sacrificati a diversi punti temporali (si veda ad esempio 4,5). Il recente sviluppo di metodi di follow-up sulla base di imaging intravitale consente di studiare la crescita del glioma e le interazioni tra cellule tumorali e il loro microambiente fisiopatologica sullo stesso animale nel corso del tempo. Questo apre la strada per pezzo esclusivo di informazione che è stato finora irrealizzabile 6. Gli animali transgenici che esprimono tag fluorescenti in cellule di interesse possono essere utilizzatid per studiare le interazioni specifiche tra le cellule tumorali e ad esempio i neuroni in questo documento. Negli ultimi dieci anni, intravital microscopia a due fotoni 7 è diventato un gold standard negli studi di neuro-oncologia fondamentali e sperimentazioni precliniche 8,9 per la sua capacità di eseguire profonda osservazione intravital di cervello di topo (&gt; 500 micron al di sotto della dura madre) con una risoluzione spaziale micrometrica 10. Uso intravital microscopia a due fotoni con modelli animali orthotopical impiantati con una finestra cranica cronica 11, è possibile seguire la progressione tumorale nel tempo sulla stessa 9,12 mouse. Uno dei principali inconvenienti di questi modelli animali precedentemente pubblicati è tuttavia che non imitano i vincoli fisici che regolano la crescita tumorale come la dura madre non è sigillato dopo l&#39;iniezione della sospensione cellulare 9,13,14. Cellule del glioma possono perdere inspazio extradurale trasformazione di un modello di glioma ortotopico in uno eterotopico. Il modello animale qui presentato consiste nella iniezione di uno sferoide di cellule di glioma fluorescenti nella corteccia cerebrale ad una profondità di 200 micron seguita dalla sigillatura della dura madre con destrano gel emi-bead reticolato e colla compatibile isto . La crescita tumorale è poi limitato al parenchima cerebrale che mantiene vincoli fisici patofisiologici. Una finestra di vetro cronica impiantato al di sopra del tumore consente un accesso ottico facile per intravital microscopia a due fotoni. L&#39;uso di animali transgenici che esprimono tag fluorescenti in cellule di interesse è possibile eseguire un follow-up della crescita glioma nel tempo e per studiare la sua interazione con il suo microambiente (qui con neuroni e vasi evidenziati con destrani fluorescenti).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1337">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:425px;">Drill</td>
			<td style="width:383px;">Dremel (Germany)</td>
			<td style="width:156px;">398</td>
			<td style="width:375px;">any high quality surgical bone drill would suffice</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:425px;">Drill burr (#1/4 Carbide Round Burr)</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>501860 (#1/4)</td>
			<td>also sold by Harvard Apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Tissue scissors</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>14395</td>
			<td style="width:375px;"></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Dumont tweezers M5S</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>501764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Dental cement</td>
			<td>GACD (USA)</td>
			<td>12-565 &#38; 12-568</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Cyanoacrylate</td>
			<td>Eleco-EFD (France)</td>
			<td>Cyanolit 201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Glass capillaries without filament</td>
			<td>Clark Electromedical Instruments (UK)</td>
			<td>GC100-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Microliter syringe (25 &#181;l)</td>
			<td>Hamilton (USA)</td>
			<td>702</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Micromanipulator</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>Kite-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">T derivation (3-way stopcock - Luer lock)</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>14035-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Stereotactic frame (mouse adaptor)</td>
			<td style="width:383px;">World Precision Instruments (USA)</td>
			<td>502063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Glass coverslips</td>
			<td>Warner Instruments (USA)</td>
			<td>CS-5R (64-0700)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Cross-linked dextran gel (Sephadex) G50 Coarse 100-300 &#181;m beads</td>
			<td>Available from various suppliers including Sigma (Germany)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Eye ointment</td>
			<td>TVM (France)</td>
			<td>Ocry-gel</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Fluorescence macroscope</td>
			<td>Leica MZFLIII (Germany)</td>
			<td></td>
			<td>also sold by other companies</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Two-photon microscope</td>
			<td>Zeiss LSM 7MP (Germany)</td>
			<td></td>
			<td>also sold by other companies (Nikon, &#8230;)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;">Infrared tunable femtosecond laser (Ma&#239;-Ta&#239;)</td>
			<td>Spectra Physics (USA)</td>
			<td></td>
			<td>also sold by other companies</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an orthotopic glioblastoma mouse model maintaining brain parenchymal physical constraints and suitable for intravital two-photon microscopy

Glioblastoma multiforme (GBM) è la forma più aggressiva di tumore cerebrale senza trattamenti curativi ad oggi disponibili. Modelli murini di questa patologia basano sull&#39;iniezione di una sospensione di cellule di glioma nel parenchima cerebrale dopo incisione della dura madre. Considerando che le cellule devono essere iniettato superficialmente per essere accessibile a intravital microscopia a due fotoni, iniezioni superficiali non riescono a riepilogare le condizioni fisiopatologiche. Infatti, in fuga attraverso il tratto di iniezione maggior parte delle cellule tumorali raggiungono lo spazio extra-durale dove si espandono eccessivamente veloce, in assenza di vincoli meccanici del parenchima. I nostri miglioramenti consistono non solo in focally impiantare uno sferoide glioma piuttosto che iniettare una sospensione di cellule di glioma negli strati superficiali della corteccia cerebrale, ma anche in intasamento sito di iniezione da un destrano gel emi-bead reticolato che è incollato alla cirding parenchima e sigillato a dura madre con cianoacrilato. Complessivamente queste misure rispettare la fisiologica espansione e l&#39;infiltrazione delle cellule tumorali all&#39;interno del parenchima cerebrale. Craniotomia è stato finalmente chiuso con una finestra di vetro cementato al cranio per consentire l&#39;imaging cronica nel corso di settimane, in assenza di sviluppo del tessuto cicatriziale. Approfittando di animali transgenici fluorescenti innestate con cellule tumorali fluorescenti Abbiamo dimostrato che le dinamiche di interazioni che avvengono tra le cellule del glioma, i neuroni (ad es Thy1-CFP topi) e vascolare (evidenziato da una iniezione endovenosa di un colorante fluorescente) possono essere visualizzati da intravital microscopia a due fotoni durante la progressione della malattia. La possibilità di un tumore immagine a risoluzione microscopica in un ambiente cerebrale minimamente compromesso rappresenta un miglioramento degli attuali modelli animali di GBM che dovrebbero beneficiare campo della neuro-oncologia e test anti-droga. </p&gt;

Una volta che il protocollo chirurgico viene eseguito (Figura 1), gli animali possono essere osservati mediante microscopia a fluorescenza per settimane fino al sacrificio. Una reazione infiammatoria può essere osservata dopo l&#39;intervento chirurgico che scompare entro una o due settimane. La crescita del tumore può essere osservato da varie tecniche di microscopia a fluorescenza incluse macroscopia e microscopia a due fotoni (Figura 2). Immagini di esempio qui raffigurati sono sta...

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An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

Abbiamo stabilito un modello glioblastoma ortotopico corticale nei topi per intravital microscopia a due fotoni che ricapitola i vincoli biofisici normalmente in gioco durante la crescita del tumore. Una finestra di vetro cronica sostituzione del cranio sopra il tumore consente il seguito della progressione tumorale nel tempo mediante microscopia a due fotoni.

Un ortotopico Glioblastoma modello di mouse mantenimento di vincoli Cervello parenchimale fisiche e adatto per intravitale due fotoni Microscopia

Glioblastoma multiforme (GBM) is the most aggressive form of brain tumors with no curative treatments available to date.
Murine models of this pathology ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

19.6K Views.  Aix Marseille University.  Abbiamo stabilito un modello glioblastoma ortotopico corticale nei topi per intravital microscopia a due fotoni che ricapitola i vincoli biofisici normalmente in gioco durante la crescita del tumore. Una finestra di vetro cronica sostituzione del cranio sopra il tumore consente il seguito della progressione tumorale nel tempo mediante microscopia a due fotoni. 

Video: An Orthotopic Glioblastoma Mouse Model Maintaining Brain Parenchymal Physical Constraints and Suitable for Intravital Two-photon Microscopy

An Orthotopic Model of Murine Bladder Cancer

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and subsequent cell adhesion. After their bladders are transurethrally catheterized and drained, animals are again catheterized to permit insertion of a platinum wire into bladders without damaging the urethra or bladder. The catheters are made of Teflon to serve as an insulator for the wire, which will conduct electrical current into the bladder to create a burn injury. An electrocautery unit is used to deliver 2.5W to the exposed end of the wire, burning away extracellular layers and providing attachment sites for carcinoma cells that are delivered in suspension to the bladder through a subsequent catheterization. Cells remain in the bladder for 90 minutes, after which the catheters are removed and the bladders allowed to drain naturally. The development of tumor is monitored via ultrasound. Specific attention is paid to the catheterization technique in the accompanying video.

Bladder tumors are established in female mice in a minimally invasive fashion through catheterization, local cauterization, and subsequent adhesion of carcinoma cells to the burn sites.

Un modello ortotopico di cancro alla vescica Murine

In this straightforward procedure, bladder tumors are established in female C57 mice through the use of catheterization, local cauterization, and ...

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Medicina

Multi-photon Imaging of Tumor Cell Invasion in an Orthotopic Mouse Model of Oral Squamous Cell Carcinoma

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient management strategies. Orthotopic mouse models of oral cancer have been developed to facilitate the study of factors that impact invasion and serve as model system for evaluating anti-tumor therapeutics. In these systems, visualization of disseminated tumor cells within oral cavity tissues has typically been conducted by either conventional histology or with in vivo bioluminescent methods. A primary drawback of these techniques is the inherent inability to accurately visualize and quantify early tumor cell invasion arising from the primary site in three dimensions. Here we describe a protocol that combines an established model for squamous cell carcinoma of the tongue (SCOT) with two-photon imaging to allow multi-vectorial visualization of lingual tumor spread. The OSC-19 head and neck tumor cell line was stably engineered to express the F-actin binding peptide LifeAct fused to the mCherry fluorescent protein (LifeAct-mCherry). Fox1nu/nu mice injected with these cells reliably form tumors that allow the tongue to be visualized by ex-vivo application of two-photon microscopy. This technique allows for the orthotopic visualization of the tumor mass and locally invading cells in excised tongues without disruption of the regional tumor microenvironment. In addition, this system allows for the quantification of tumor cell invasion by calculating distances that invaded cells move from the primary tumor site. Overall this procedure provides an enhanced model system for analyzing factors that contribute to SCOT invasion and therapeutic treatments tailored to prevent local invasion and distant metastatic spread. This method also has the potential to be ultimately combined with other imaging modalities in an in vivo setting.

A comprehensive overview of the techniques involved in generating a mouse model of oral cancer and quantitative monitoring of tumor invasion within the tongue through multi-photon microscopy of labeled cells is presented. This system can serve as a useful platform for the molecular assessment and drug efficacy of anti-invasive compounds.

Multi-fotone Imaging di invasione delle cellule tumorali in un modello di mouse ortotopico di carcinoma orale a cellule squamose

Loco-regional invasion of head and neck cancer is linked to metastatic risk and presents a difficult challenge in designing and implementing patient ...

Combination Radiotherapy in an Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the understanding of the mechanics of tumor invasion, and direct intracerebral inoculation of tumor provides the opportunity of observing the invasive process in a physiologically appropriate environment2. As far as human brain tumors are concerned, the orthotopic models currently available are established either by stereotaxic injection of cell suspensions or implantation of a solid piece of tumor through a complicated craniotomy procedure3. In our technique we harvest cells from tissue culture to create a cell suspension used to implant directly into the brain. The duration of the surgery is approximately 30 minutes, and as the mouse needs to be in a constant surgical plane, an injectable anesthetic is used. The mouse is placed in a stereotaxic jig made by Stoetling (figure 1). After the surgical area is cleaned and prepared, an incision is made; and the bregma is located to determine the location of the craniotomy. The location of the craniotomy is 2 mm to the right and 1 mm rostral to the bregma. The depth is 3 mm from the surface of the skull, and cells are injected at a rate of 2 &mu;l every 2 minutes. The skin is sutured with 5-0 PDS, and the mouse is allowed to wake up on a heating pad. From our experience, depending on the cell line, treatment can take place from 7-10 days after surgery. Drug delivery is dependent on the drug composition. For radiation treatment the mice are anesthetized, and put into a custom made jig. Lead covers the mouse's body and exposes only the brain of the mouse. The study of tumorigenesis and the evaluation of new therapies for GBM require accurate and reproducible brain tumor animal models. Thus we use this orthotopic brain model to study the interaction of the microenvironment of the brain and the tumor, to test the effectiveness of different therapeutic agents with and without radiation.

The purpose of this article is to describe the use of an orthotopic glioblastoma model for chemoradiation studies. This article will go though cell processing, implanting, and radiotherapy of the mouse using an intracranial model.

La radioterapia combinata in un modello di tumore ortotopico cervello di topo

Glioblastoma multiforme (GBM) are the most common and aggressive adult primary brain tumors1. In recent years there has been substantial progress in the ...

An Orthotopic Mouse Model of Anaplastic Thyroid Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer cells into immunodeficient mice. Subcutaneous xenograft models have been valuable for preclinical screening and evaluation of new therapeutic treatments. There are a number of advantages to using a subcutaneous model; 1) rapid, 2) reproducible, and 3) tumor establishment, growth, and response to therapeutic agents may be monitored by visual inspection. However, substantial evidence has shed light on the short-comings of subcutaneous xenograft models1-3. For instance, medicinal treatments demonstrating curative properties in subcutaneous xenograft models often have no notable impact on the human disease. The microenvironment of the site of xenographic transplantation or injection lies at the heart of this dissimilarity.
Orthotopic tumor xenograft models provide a more biologically relevant context in which to study the disease. The advantages of implanting diseased cells or tissue into their anatomical origin equivalent within a host animal includes a suitable site for tumor-host interactions, development of disease-related metastases and the ability to examine site-specific influence on investigational therapeutic remedies. Therefore, orthotopic xenograft models harbor far more clinical value because they closely reproduce human disease. For these reasons, a number of groups have taken advantage of an orthotopic thyroid cancer model as a research tool4-7.
Here, we describe an approach that establishes an orthotopic model for the study of anaplastic thyroid carcinoma (ATC), which is highly invasive, resists treatment, and is virtually fatal in all diagnosed patients. Cultured ATC cells are prepared as a dissociated cellular suspension in a solution containing a basement membrane matrix. A small volume is slowly injected into the right thyroid gland. Overall appearance and health of the mice are monitored to ensure minimal post-operative complications and to gauge pathological penetrance of the cancer. Mice are sacrificed at 4 weeks, and tissue is collected for histological analysis. Animals may be taken at later time-points to examine more advance progression of the disease. Production of this orthotopic mouse model establishes a platform that accomplishes two objectives: 1) further our understanding of ATC pathology, and 2) screen current and future therapeutic agents for efficacy in combating ATC.

Generation of an orthotopic mouse model of anaplastic thyroid carcinoma is described here. This technique employs surgical placement of human anaplastic thyroid cancer cells into the thyroid of immunodeficient mice, thus creating a more clinically relevant setting to study disease progression as well as screen innovative therapeutic interventions.

Un modello di mouse ortotopico di anaplastico della tiroide Carcinoma

Several types of animal models of human thyroid carcinomas have been established, including subcutaneous xenograft and orthotopic implantation of cancer ...

An Orthotopic Bladder Cancer Model for Gene Delivery Studies

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are needed. The tumor microenvironment can significantly influence tumor development and therapy response. It is therefore often desirable to grow tumor cells in the organ from which they originated. This protocol describes an orthotopic model of bladder cancer, in which MB49 murine bladder carcinoma cells are instilled into the bladder via catheterization. Successful tumor cell implantation in this model requires disruption of the protective glycosaminoglycan layer, which can be accomplished by physical or chemical means. In our protocol the bladder is treated with trypsin prior to cell instillation. Catheterization of the bladder can also be used to deliver therapeutics once the tumors are established. This protocol describes the delivery of an adenoviral construct that expresses a luciferase reporter gene. While our protocol has been optimized for short-term studies and focuses on gene delivery, the methodology of mouse bladder catheterization has broad applications.

Implantation of cancer cells into the organ of origin can serve as a useful preclinical model to evaluate novel therapies. MB49 bladder carcinoma cells can be grown within the bladder following intravesical instillation. This protocol demonstrates catheterization of the mouse bladder for the purpose of tumor implantation and adenoviral delivery.

Un ortotopico cancro della vescica Modello di Gene Studi di consegna

Bladder cancer is the second most common cancer of the urogenital tract and novel therapeutic approaches that can reduce recurrence and progression are ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

Un ortotopico Modello murino di Human Prostate Cancer Metastasi

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Acute Brain Trauma in Mice Followed By Longitudinal Two-photon Imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no effective treatment for it yet. Limitations of currently used animal models impede understanding of the pathology mechanism. Multiphoton microscopy allows studying cells and tissues within intact animal brains longitudinally under physiological and pathological conditions. Here, we describe two models of acute brain injury studied by means of two-photon imaging of brain cell behavior under posttraumatic conditions. A selected brain region is injured with a sharp needle to produce a trauma of a controlled width and depth in the brain parenchyma. Our method uses stereotaxic prick with a syringe needle, which can be combined with simultaneous drug application. We propose that this method can be used as an advanced tool to study cellular mechanisms of pathophysiological consequences of acute trauma in mammalian brain in vivo. In this video, we combine acute brain injury with two preparations: cranial window and skull thinning. We also discuss advantages and limitations of both preparations for multisession imaging of brain regeneration after trauma.

Acute brain trauma is a severe injury that has no adequate treatment to date. Multiphoton microscopy allows studying longitudinally the process of acute brain trauma development and probing therapeutical strategies in rodents. Two models of acute brain trauma studied with in vivo two-photon imaging of brain are demonstrated in this protocol.

Acuta cerebrale Trauma nei topi Seguito By longitudinale a due fotoni di imaging

Although acute brain trauma often results from head damage in different accidents and affects a substantial fraction of the population, there is no ...

Bioluminescence Imaging of an Immunocompetent Animal Model for Glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and histopathologic features of the human disease. When GL261 cells are implanted intracranially in syngeneic C57BL/6 mice, the model has the added advantage of maintaining an intact immune microenvironment. Stable expression of luciferase in GL261 cells allows non-invasive cost effective bioluminescence monitoring of intracranial tumor growth. We have recently demonstrated that luciferase expression in GL261 cells does not affect the tumor growth properties, tumor cell immunomodulatory cytokine expression, infiltration of immune cells into the tumor, or overall survival of animals bearing the intracranial tumor. Therefore, it appears that the GL261 luciferase glioma model can be useful in the study of novel chemotherapeutic and immunotherapeutic modalities. Here we report the technique for generating stable luciferase expression in GL261 cells and how to study the in vitro and in vivo growth of the tumor cells by bioluminescence imaging.

GL261 glioma cells provide a useful immunocompetent animal model of glioblastoma. The goals of this protocol are to demonstrate proper techniques for monitoring intracranial tumor growth using in vivo bioluminescence imaging, and to verify the utility of luciferase-modified GL261 cells for studying tumor immunology and immunotherapeutic approaches for treating glioblastoma.

Bioluminescenza Imaging di un Modello immunocompetenti Animal Glioblastoma

In contrast to commonly reported human glioma xenograft animal models, GL261 murine glioma xenografts recapitulate nearly all relevant clinical and ...

An Orthotopic Mouse Model of Spontaneous Breast Cancer Metastasis

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer metastasis, is largely unknown and is a focus in cancer research. Various breast cancer spontaneous metastasis mouse models have been established. Here, we report a simplified procedure to establish orthotopic transplanted breast cancer primary tumor and resultant spontaneous metastasis that mimic human breast cancer metastasis. Combined with the bioluminescence live tumor imaging, this mouse model allows tumor growth and progression kinetics to be monitored and quantified. In this model, a low dose (1 x 104 cells) of 4T1-Luc breast cancer cells was injected into BALB/c mouse mammary fat pad using a tuberculin syringe. Mice were injected with luciferin and imaged at various time points using a bioluminescent imaging system. When the primary tumors grew to the size limit as in the IACUC-approved protocol (approximately 30 days), mice were anesthetized under constant flow of 2% isoflurane and oxygen. The tumor area was sterilized with 70% ethanol. The mouse skin around the tumor was excised to expose the tumor which was removed with a pair of sterile scissors. Removal of the primary tumor extends the survival of the 4T-1 tumor-bearing mice for one month. The mice were then repeatedly imaged for metastatic tumor spreading to distant organs. Therapeutic agents can be administered to suppress tumor metastasis at this point. This model is simple and yet sensitive in quantifying breast cancer cell growth in the primary site and progression kinetics to distant organs, and thus is an excellent model for studying breast cancer growth and progression, and for testing anti-metastasis therapeutic and immunotherapeutic agents in vivo.

An orthotopic breast cancer primary tumor model and surgical removal of primary tumor to extend mouse life to generate spontaneous metastasis are described. The tumor growth and progression are monitored and quantified by luciferase fluorescence imaging.

Un modello murino ortotopico di spontanea Breast Cancer metastasi

Metastasis is the primary cause of mortality of breast cancer patients. The mechanism underlying cancer cell metastasis, including breast cancer ...

Intravital Microscopy and Thrombus Induction in the Earlobe of a Hairless Mouse

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions between cellular and non-cellular blood components during thrombus formation, reliable studies of the physiology and pathophysiology of thrombosis can only be performed in vivo. Therefore, this article presents an ear model in hairless mice and focuses on the in vivo analysis of microcirculation, thrombus formation, and thrombus evolution. By using intravital fluorescence microscopy and the intravenous (iv) application of the respective fluorescent dyes, a repetitive analysis of microcirculation in the auricle can easily be performed, without the need for surgical preparation. Furthermore, this model can be adapted for in vivo studies of different issues, including wound healing, reperfusion injury, or angiogenesis. In summary, the ear of hairless mice is an ideal model for the in vivo study of skin microcirculation in physiological or pathophysiological conditions and for the evaluation of its reaction to different systemic or topical treatments.

The ear model of the hairless SKH1-Hrhr mouse enables intravital fluorescence microscopy of microcirculation and phototoxic thrombus induction without prior surgical preparation in the examined microvascular bed. Therefore, the ear of the hairless mouse is an excellent in vivo model to study the complex interactions during microvascular thrombus formation, thrombus evolution, and thrombolysis.

Intravitale Microscopia e Trombo induzione nel lobo di un mouse Hairless

Thrombotic complications of vascular diseases are one leading cause of morbidity and mortality in industrial nations. Due to the complex interactions ...