Questo lavoro è stato sostenuto dal NCI R01 CA120659 (RS).

1. Un Matrigel-Based Formazione Assay tubo per valutare l&#39;attività vascolare delle cellule tumorali <ol><li> Preparazione delle cellule tumorali e cellule endoteliali: le cellule tumorali del cervello, come le cellule U87, B16F1 cellule di melanoma, cancro al seno MDA-MB-435, e le cellule del colon HCT116 sono state coltivate in DMEM supplementato con 10% FBS e la penicillina / streptomicina (tutti da Invitrogen ). Delle cellule endoteliali linea di cellule endoteliali microvascolari (HMVECs) sono state coltivate in EBM2 medio (Lonza) integrata con 1 mg / ml di idrocortisone e 1 ng / ml fattore di crescita epidermico, il 10% FBS e la penicillina / streptomicina. Le cellule sono state lavate con PBS per tre volte e distaccato con 0,05% tripsina / EDTA (Invitrogen). Dopo la centrifugazione con 2.000 rpm per 5 minuti, pellet cellulari sono stati lavati di nuovo con PBS. Poi, le cellule pellet sono stati contati con un emocitometro. </li><li> Preparazione Matrigel: Una frazione del fattore di crescita ridotto Matrigel (BD Bioscience) è stato riscaldato a temperatura ambiente. Prima di tutto scongelati, è stato trasferito su ghiaccio e il suo liquido è stato tenuto in ghiaccio per almeno 10 min. Di 50 ml di Matrigel è stato placcato da piastre a 96 pozzetti a livello orizzontale che permette al Matrigel per distribuire uniformemente, e incubate per 30 minuti a 37 ° C. </li><li> Formazione del tubo: Cells (1-2 x 10 4) sono stati nuovamente sospesi con DMEM senza siero per le cellule tumorali o EBM-2 per le cellule endoteliali, e caricate sulla parte superiore del Matrigel. Se questo test è stato utilizzato per misurare gli effetti di alcuni agenti di sviluppo tubulo, questi agenti (stimolatori o inibitori) sono stati aggiunti al mezzo privo di siero. Ogni gruppo condizionale contenute 4-6 pozzi. </li><li> Immagini e analisi dei dati: A seguito di incubazione a 37 ° C durante la notte, ogni pozzetto è stato analizzato direttamente al microscopio. Se tubuli erano necessari per la fissazione, 100 ml di formalina al 10% salina a base di soluzione è stata gentilmente aggiunto e dieci minuti dopo, era pronta per l&#39;analisi. Sotto un microscopio con contrasto di fase 10x, tubuli in ogni campo sono stati immaginati e una media di tubuli 3-5 campi aleatori in ogni pozzetto è stato contato. </li></ol> 2. Rappresentante dei risultati: HMVECs sono stati usati come controllo positivo, in quanto tali tubuli sono stati sviluppati da chiare corpi cellulari allungati che si connettono alla rete forma poligonale. Cellule B16F1, U87, e MDA-MB-435 sviluppato tubuli vascolari simili a quelle formate da HMVECs, ma HCT116 cellule non (Figura 1). Una cellula dose-dipendente formazione del tubo è stato testato in U87 cellule. Come dimostrato nella figura 2, 10.000 cellule formano tubuli interrotto. Una volta che le cellule sono state raddoppiate, una solida rete vascolare era paragonabile a quelli osservati in HMVECs. Al contrario, le cellule meno di 5.000 non è riuscito a formare un fenotipo vascolare. <img src="/files/ftp_upload/3040/3040fig1.jpg" alt="Figura 1"/> Figura 1. Metropolitana di formazione indotta da HMVECs, U87, MDA-MB-435, e B16F1 cellule, ma non HCT116 cellule. Tutte le cellule (2 x 10 4) sono stati caricati su Matrigel e incubate durante la notte. Tubuli erano ripreso con contrasto di fase. HMVECs sono stati usati come controllo positivo. Un rappresentante di 3-5 campi è stato mostrato. Bar: 100 micron. <img src="/files/ftp_upload/3040/3040fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. U87 cellulare indotta tubuli in un numero dipendente dalla cellula modo. U87 diverso numero di cellule, come indicato negli angoli sono stati utilizzati per la formazione del tubo. HMVECs sono stati utilizzati per un controllo positivo. Bar: 100 mm.

<ol>
	<li>Shao, R., Guo, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microvascular+endothelial+cells+immortalized+with+human+telomerase+catalytic+protein:+a+model+for+the+study+of+in+vitro+angiogenesis.">Human microvascular endothelial cells immortalized with human telomerase catalytic protein: a model for the study of in vitro angiogenesis.</a> Biochemical &#38; Biophysical Research Communications. 321, 788-794 (2004).</li><li>Ribeiro, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemostatic+properties+of+the+SV-40+transfected+human+microvascular+endothelial+cell+line+(HMEC-1).+A+representative+in+vitro+model+for+microvascular+endothelium.">Hemostatic properties of the SV-40 transfected human microvascular endothelial cell line (HMEC-1). A representative in vitro model for microvascular endothelium.</a> Thromb Res. 79, 153-1561 (1995).</li><li>Ades, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HMEC-1:+establishment+of+an+immortalized+human+microvascular+endothelial+cell+line.">HMEC-1: establishment of an immortalized human microvascular endothelial cell line.</a> J Invest Dermatol. 99, 683-690 (1992).</li><li>Shao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acquired+expression+of+periostin+by+human+breast+cancers+promotes+tumor+angiogenesis+through+up-regulation+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor+2+expression.">Acquired expression of periostin by human breast cancers promotes tumor angiogenesis through up-regulation of vascular endothelial growth factor receptor 2 expression.</a> Molecular &#38; Cellular Biology. 24, 3992-4003 (2004).</li><li>Shao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YKL-40,+a+secreted+glycoprotein,+promotes+tumor+angiogenesis.">YKL-40, a secreted glycoprotein, promotes tumor angiogenesis.</a> Oncogene. 28, 4456-4468 (2009).</li><li>Basu, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+role+for+cyclooxygenase-2+in+regulating+vascular+channel+formation+by+human+breast+cancer+cells.">A novel role for cyclooxygenase-2 in regulating vascular channel formation by human breast cancer cells.</a> Breast Cancer Research. 8, R69-R69 (2006).</li><li>Scavelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenic+mimicry+by+bone+marrow+macrophages+in+patients+with+multiple+myeloma.">Vasculogenic mimicry by bone marrow macrophages in patients with multiple myeloma.</a> Oncogene. 27, 663-674 (2008).</li><li>El Hallani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+alternative+mechanism+in+glioblastoma+vascularization:+tubular+vasculogenic+mimicry.">A new alternative mechanism in glioblastoma vascularization: tubular vasculogenic mimicry.</a> Brain. 133, 973-982 (2010).</li><li>Maniotis, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+channel+formation+by+human+melanoma+cells+in+vivo+and+in+vitro:+vasculogenic+mimicry.">Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry.</a> American Journal of Pathology. 155, 739-752 (1999).</li><li>Hendrix, M. J., Seftor, E. A., Hess, A. R., Seftor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenic+mimicry+and+tumour-cell+plasticity:+lessons+from+melanoma.">Vasculogenic mimicry and tumour-cell plasticity: lessons from melanoma.</a> Nature Reviews Cancer. 3, 411-421 (2003).</li><li>Folberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+cell+plasticity+in+uveal+melanoma:+microenvironment+directed+dampening+of+the+invasive+and+metastatic+genotype+and+phenotype+accompanies+the+generation+of+vasculogenic+mimicry+patterns.">Tumor cell plasticity in uveal melanoma: microenvironment directed dampening of the invasive and metastatic genotype and phenotype accompanies the generation of vasculogenic mimicry patterns.</a> American Journal of Pathology. 169, 1376-1389 (2006).</li><li>Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prostate-specific+membrane+antigen+directed+selective+thrombotic+infarction+of+tumors.">Prostate-specific membrane antigen directed selective thrombotic infarction of tumors.</a> Cancer Research. 62, 5470-5475 (2002).</li><li>Sood, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+clinical+significance+of+tumor+cell-lined+vasculature+in+ovarian+carcinoma:+implications+for+anti-vasculogenic+therapy.">The clinical significance of tumor cell-lined vasculature in ovarian carcinoma: implications for anti-vasculogenic therapy.</a> Cancer Biology &#38; Therapy. 1, 661-664 (2002).</li><li>Shirakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemodynamics+in+vasculogenic+mimicry+and+angiogenesis+of+inflammatory+breast+cancer+xenograft.">Hemodynamics in vasculogenic mimicry and angiogenesis of inflammatory breast cancer xenograft.</a> Cancer Research. 62, 560-566 (2002).</li><li>Ruf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+role+of+tissue+factor+pathway+inhibitors+1+and+2+in+melanoma+vasculogenic+mimicry.">Differential role of tissue factor pathway inhibitors 1 and 2 in melanoma vasculogenic mimicry.</a> Cancer Research. 63, 5381-5389 (2003).</li><li>Seftor, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cooperative+interactions+of+laminin+5+gamma2+chain,+matrix+metalloproteinase-2,+and+membrane+type-1-matrix/metalloproteinase+are+required+for+mimicry+of+embryonic+vasculogenesis+by+aggressive+melanoma.">Cooperative interactions of laminin 5 gamma2 chain, matrix metalloproteinase-2, and membrane type-1-matrix/metalloproteinase are required for mimicry of embryonic vasculogenesis by aggressive melanoma.</a> Cancer Research. 61, 6322-6327 (2001).</li><li>Shirakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vasculogenic+mimicry+and+pseudo-comedo+formation+in+breast+cancer.">Vasculogenic mimicry and pseudo-comedo formation in breast cancer.</a> International Journal of Cancer. 99, 821-828 (2002).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Perché questo test per avere successo, la qualità del Matrigel deve essere testato prima. Un piccolo campione possono essere ottenute presso Bioscience BD per pre-eseguire il test utilizzando HMVECs. Prodotti lotti diversi possono visualizzare qualità dissimili in cui alcuni lotti non forniscono una condizione ottimale per la formazione del tubo. In secondo luogo, tutte le bolle dovrebbe essere evitato quando un&#39;aliquota del Matrigel viene caricato in piastre a 96 pozzetti, perché le bolle possono interrompere l...

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11995 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16000-044 </td></tr><tr><td> Fattore di crescita ridotto Matrigel </td><td> BD Bioscience </td><td> 47743-720 </td></tr><tr><td> EBM2 kit </td><td> Lonza </td><td> CC-3156 </td></tr><tr><td> Nikon ECLIPSE TS100 microscopio </td><td> Nikon </td><td></td></tr></tbody></table>

a matrigel-based tube formation assay to assess the vasculogenic activity of tumor cells

Nel corso degli ultimi decenni, un saggio di formazione del tubo utilizzando il fattore di crescita-è stato ridotto Matrigel tipicamente impiegato per dimostrare l&#39;attività angiogenica delle cellule dell&#39;endotelio vascolare in vitro 1-5. Tuttavia, l&#39;evidenza di recente crescita ha dimostrato che questo saggio non si limita a testare il comportamento per le cellule endoteliali vascolari. Invece, è stato anche utilizzato per testare la capacità di un certo numero di cellule tumorali di sviluppare un fenotipo vascolare 6-8. Questa capacità è stata coerente con il loro comportamento vascolare identificato in animali xenotransplanted, un processo noto come mimetismo vascolare (VM) 9. C&#39;è una moltitudine di prove che dimostrano che cellule tumorali mediata VM svolge un ruolo fondamentale nello sviluppo del tumore, indipendentemente angiogenesi delle cellule endoteliali 6, 10-13. Per esempio, le cellule tumorali sono stati trovati a partecipare al perfuso sangue, la formazione di canali vascolari in campioni di tessuto da pazienti affetti da melanoma e glioblastoma 8, 10, 11. Qui, abbiamo descritto questa analisi tubolare rete come uno strumento utile nella valutazione dell&#39;attività vascolare delle cellule tumorali. Abbiamo scoperto che alcune linee cellulari tumorali come il melanoma B16F1 cellule, le cellule di glioblastoma U87, e il cancro al seno MDA-MB-435 cellule sono in grado di formare tubuli vascolare, ma alcuni non lo fanno come il cancro del colon HCT116 cellule. Inoltre, questo fenotipo vascolare dipende dal numero di cellule placcato sul Matrigel. Pertanto, questo test può servire come potente utility per lo screening del potenziale vascolare di una varietà di tipi cellulari tra cui le cellule vascolari, le cellule tumorali oltre che altre cellule.

Watch this Scientific Journal Video about A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells at JoVE.com

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Un test formazione del tubo viene usato per valutare l&#39;attività vascolare delle cellule tumorali.

Un Matrigel-Based Formazione Assay tubo per valutare l&#39;attività vascolare delle cellule tumorali

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

a-matrigel-based-tube-formation-assay-to-assess-vasculogenic-activity

Research

JoVE Journal

Biology

65.8K Views.  University of Massachusetts. Un test formazione del tubo viene usato per valutare l'attività vascolare delle cellule tumorali.