Il nostro protocollo consente approfondimenti unici sui meccanismi molecolari e a livello di tessuto sfuso della vasculogenesi che possono aiutare nella vascucolatura funzionale ingegneristica per la terapia delle malattie cardiovascolari nella modellazione. Questo protocollo consente la creazione di solide reti vascolari tridimensionali per valutare il potenziale vascolare di varie piattaforme e fornisce anche una pipeline computazionale open source gratuita per l'analisi della topologia di rete finale. Inizia aggiungendo 250 microlitri di soluzione di distacco cellulare per pozzo della coltura cellulare differenziata D5D6 per 10 minuti a 37 gradi Celsius.
Alla fine dell'incubazione, utilizzare una punta della pipetta P1000 per dissociare le cellule in sospensioni a singola cella. Mettere in comune le soluzioni cellulari in un unico tubo conico da 15 millilitri per la centrifugazione. Sospendiamo il pellet in 200 microlitri di tampone di cernita a freddo ghiacciato ed etichettiamo le cellule con cinque microlitri di anticorpo CD34 coniugato a fluorescenza concentrata per 10 minuti a quattro gradi Celsius.
Alla fine dell'incubazione, lavare le cellule in cinque mililitri di tampone di cernita a freddo ghiacciato. Filtrare la sospensione attraverso un filtro di versamento di 40 micrometri in un tubo a celle attivate a fluorescenza a cinque millilitri o FACS. Prima di eseguire il campione, ordinare una volta per 10 delle quattro cellule senza etichetta sul fluocitometro, sferrando una regione con un'alta intensità di fluorescenza che non contiene nessuna delle cellule senza etichetta per fungere da controllo negativo.
Quindi ordinare il campione etichettato contiene progenitori endoteliali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte in base alla loro alta espressione CD34. Alla fine del tipo, trasferire le cellule progenitrici endoteliali in un tubo di microcentrifugo per la centrifugazione. Per l'incapsulamento dell'idrogel di collagene delle cellule progenitrici, sospendiamo il pellet cellulare ordinato in 200 microlitri di Endothelial Growth Medium 2, integrati con 10 micromilitri dell'inibitore ROCK Y-27632.
Aggiungere le cellule a 400 microlitri di mezzo di semina in un tubo di microcentrifugo da 1,8 mililiter sul ghiaccio. Mescolare 350 microlitri di collagene nella sospensione cellulare. La soluzione diventerà giallo pallido.
Successivamente, mescolare dieci microlitri di idrossido di sodio 1-Muller nella soluzione di collagene e cellule. La soluzione diventerà ora rosa brillante. Pipetta 56 microlitri di questa soluzione di cellule di collagene neutralizzata in singoli pozzi di una piastra di coltura cellulare con fondo u ben ultra-basso per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius.
Alla fine dell'incubazione, esaminare i pozzi al microscopio a campo luminoso per verificare che le cellule siano state distribuite uniformemente. Quindi aggiungere 100 microlitri di Endotelial Growth Medium 2 appena preparato, integrati con INIbitore ROCK e fattore di crescita endoteliale vascolare ad ogni pozzo e riportare la piastra all'incubatore di 37 gradi Celsius. Dopo una settimana di coltura, aggiungere 250 microlitri di paraformaldeide al 4% a un pozzo di una piastra di 48 pozza per idrogel e rimuovere il mezzo dagli idrogel.
Quindi utilizzare una pinzetta a punta fine per trasferire gli idrogel alla paraformaldeide contenente pozzi. Dopo 10 minuti a temperatura ambiente, lavare rapidamente gli idrogel con PBS e permeabilizzare le colture 3D con 250 microlitri di un tensioattivo non ionico allo 0,5% per cinque minuti a temperatura ambiente. Lavare gli idrogel con due lavaggi di cinque minuti a temperatura ambiente con 250 microlitri di PBS, integrati con glicina da 300 millilitri per lavaggio, seguiti dall'immersione di ogni idrogel in 250 microlitri di tampone di blocco per 30 minuti a temperatura ambiente.
Etichettare le cellule con gli anticorpi primari appropriati diluiti nel tampone di blocco durante la notte a quattro gradi Celsius, seguiti da due lavaggi nel reagente emulsionante dello 0,5% e PBS di Dulbecco. Dopo il secondo lavaggio, etichettare le cellule con l'anticorpo secondario specifico della specie appropriato per due ore a temperatura ambiente protetta dalla luce, prima di lavare le colture 3D due volte nello 0,5% emulsionando il reagente e il PBS di Dulbecco, come dimostrato. Per visualizzare i nuclei cellulari, aggiungere DAPI, diluito a una concentrazione da uno a 10000 in PBS ai campioni per un'incubazione di due minuti a temperatura ambiente, seguito da due lavaggi in reagente emulsionante allo 0,5% e PBS di Dulbecco.
Quindi utilizzare una pinzetta a punta fine per trasferire ogni campione su una nave di visualizzazione appropriata. Dopo la differenziazione, lo smistamento e l'incapsulamento negli idrogel di collagene, le cellule rimarranno in genere arrotondate per 24 ore, prima di iniziare a migrare e formare lumen iniziali. Dopo circa sei giorni di coltura, un plesso capillare primitivo sarà visibile nell'idrogel se visto con microscopia a campo luminoso.
Dopo aver imaging degli idrogel fissi, macchiati e carichi di cellule su un microscopio confocale, le immagini pre-elaborate vengono convertite in uno scheletro che consente un'analisi della lunghezza complessiva e della connettività della rete. È imperativo aggiungere antibiotici dopo facs, poiché sterilizzare l'interno di questo strumento è difficile e rimuovere gli antibiotici 24 ore dopo l'incapsulamento cellulare. Utilizzando questa tecnica, siamo stati in grado di determinare quali caratteristiche fisiche e chimiche la matrice extracellulare che imita i biomateriali governa il potenziale vasculogenico dei progenitori endoteliali derivati da iPSC.
