HuVEC Analisi della formazione di tubi per valutare l'impatto dei prodotti naturali sull'angiogenesi

Il saggio di formazione del tubo è un test in vitro per studiare i meccanismi molecolari alla base di diversi passaggi che portano alla formazione di nuovi vasi sanguigni. Questo saggio consente di identificare composti e segnalare cascate associate all'angiogenesi. Con un test, siamo in grado di dimostrare che un composto naturale come RGWE riduce la capacità delle cellule endoteliali di formare una struttura simile a un tubo, non influisce sulla vitalità cellulare e che questo effetto dipende dall'attivazione della via MEK / ERK. È importante eseguire il test con il giusto numero di celle. In effetti, troppe poche o troppe cellule non potevano consentire la giusta formazione di tubi. Per questo motivo, è consigliabile eseguire un test preliminare per scoprire il numero corretto delle cellule. Luca Olga Pastorino, dottorando nel mio laboratorio, mostrerà le procedure. In primo luogo, raccogliere le foglie di Ruta graveolens durante i mesi primaverili ed estivi. Metti 250 grammi di foglie tritate in un pallone conico e aggiungi un litro di acqua distillata, far bollire e filtrare, come descritto nel manoscritto. Il giorno dopo, usa un liofilizzatore per liofilizzare l'estratto fogliare. Dopo aver ottenuto la polvere, pesarla e dividerla in aliquote. Cultura gli HUVEC nel mezzo di crescita delle cellule endoteliali, secondo il protocollo di testo. Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, passare le cellule con un rapporto da uno a tre. Utilizzare le cellule ottenute tra il passaggio due e il passaggio cinque. Una volta che gli HUVEC passaggi raggiungono il 70% di confluenza, traslitterarli con un microgrammo del vettore contenente il gene di interesse.Combinare un microgrammo di DNA con tre microlitri di lipofectamina diluita 2000.Quindi, rimuovere il mezzo dagli HUVEC e sostituirlo con un millilitro di mezzo fresco completo. Aggiungere la soluzione transvettive alle cellule e incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica. Tre ore dopo la trasvezione, aggiungere sette millilitri di mezzo fresco completo e incubare le cellule per altre 24-48 ore. Immediatamente prima della preparazione del seminterrato, mettere una piastra pre-refrigerata da 96 po 'sul ghiaccio e aggiungere 50 microlitri di matrice fredda ad ogni pozzo. Mentre la piastra incuba, lavare gli HUVEC con un millilitro di soluzione PBS/EDTA. Quindi, aggiungere un millilitro di soluzione di tripina-EDTA alle cellule e incubare per cinque minuti a 37 gradi Celsius.Raccogliere il mezzo contenente le cellule sospese e raccogliere le cellule tramite centrifugazione. Quindi, rimospend le cellule in un millilitro di PBS. Trasferire 0,2 millilitri della sospensione cellulare a 0,5 millilitri di PBS con soluzione blu tripano. Dopo aver tenuto la sospensione a temperatura ambiente per cinque minuti, contare le cellule in un