Questo nuovo protocollo consente allo sperimentatore di monitorare più parametri metabolici tra cui l'ossigenazione citosolica e mitocondriale e lo stato di redox citosolico. Misurando contemporaneamente le misure tradizionali della funzione miocardica. Il principale vantaggio di questa tecnica è un semplice monitoraggio dinamico non distruttivo di importanti elementi del metabolismo mitocondriale nel cuore perfuso che evita gli artefatti associati alla spettroscopia di riflessione.
Le novità di questa tecnica possono avere difficoltà a inserire il catetere senza danneggiare la valvola ed evitare la contaminazione della luce ambiente. Il catetere deve essere inserito e regolato con cura. La fibra di raccolta deve anche essere posizionata correttamente per massimizzare la luce trasmessa attraverso la parete libera ventricolare sinistra che può essere difficile.
Per iniziare tagliare un piccolo pezzo dell'appendice atriale sinistra e inserire un catetere in fibra ottica nel ventricolo sinistro attraverso la valvola mitrale. Quindi ruotarlo per ottenere una parete libera del ventricolo sinistro illuminato. Collegare l'altra estremità della fibra di prelievo a uno spettrometro a scansione rapida.
Posizionare la fibra ottica pick up direttamente di fronte alla regione di massima illuminazione del ventricolo sinistro a circa un centimetro dal cuore. Le sorgenti luminose della stanza dovrebbero essere pari a zero. La rotazione del catetere e il posizionamento della fibra ottica di prelievo devono essere regolati per ottenere una luce adeguata senza saturazione del rivelatore.
Spegnere le luci nell'area sperimentale per ottenere la completa oscurità. Avvia il programma personalizzato che incorpora driver spettrometrici per eseguire l'acquisizione dei dati e l'analisi in tempo reale della luce trasmessa. Spostarsi tra tutti i prompt selezionando le opzioni per la modalità di acquisizione della spettroscopia cardiaca perfusa.
Nella pagina successiva indicare se è in corso la raccolta di dati ausiliari. Immettere infine i parametri di acquisizione, inclusa la posizione degli spettri di riferimento del cromoforo e dei dati da salvare. Ora inserisci una larghezza di banda da 490 a 630 nanometri.
Immettere una frequenza di campionamento di due hertz. Raccogli una corrente scura o uno spettro di luce zero per correggere i livelli del segnale di fondo spegnendo la sorgente luminosa. Fate clic su per selezionare i riferimenti cromatoforici desiderati da utilizzare nella routine di raccordo.
Nella pagina dei dati di acquisizione regolare la posizione sia del catetere che della fibra di raccolta per massimizzare la luce trasmessa visualizzata sul software con particolare attenzione all'ampiezza del segnale nella regione di 500 nanometri in cui devono essere osservate le assorbanze di mioglobina ossigenata. Assicurarsi che la luce trasmessa non satura il rivelatore nella regione di 600 nanometri. Assicurarsi che nessuna sorgente luminosa esterna contribuisca allo spettro raccolto spegnendo l'illuminazione del catetere e confermando che non viene ora rilevata alcuna luce.
Avviare la raccolta dati facendo clic sul pulsante Salva spettri. Fate clic su Imposta come controllo (Set as Control) per visualizzare lo spettro di assorbimento delle differenze dagli spettri futuri rispetto allo spettro di controllo corrente. A questo punto eseguire qualsiasi perturbazione fisiologica come desiderato.
Ad esempio, per determinare gli effetti della cianidina sulle prestazioni cardiache e sull'assorbimento del cromoforo, interrompere il ricircolo del perfusato per evitare di riciclare il cianuro. Utilizzare una pompa per siringhe per iniettare cianuro a velocità diverse nel perfusato poco prima della canula aortica per ottenere le concentrazioni desiderate di cianuro nel perfusato che scorre nel cuore. Monitorare contemporaneamente la funzione cardiaca e le proprietà ottiche.
Fermare la pompa della siringa al cianuro quando gli effetti del flusso coronarico e della frequenza cardiaca, insieme alla trasmissione ottica attraverso la parete cardiaca sono allo stato stazionario. Cinque minuti dopo aver interrotto l'infusione di cianuro, passare il gas gorgogliante dal 100% di ossigeno al 100% di azoto per rimuovere l'ossigeno dal sistema. Dopo circa 10 minuti interrompere il flusso per simulare una condizione ischemica e ipossica totale.
Per l'analisi spettrale dei dati eseguire il programma in modalità di analisi cardiaca perfusa. Selezionare il programma di analisi appropriato. Immettere il percorso del file di dati e il file degli spettri di riferimento.
Selezionare la sorgente luminosa del catetere che carica lo spettro pre-salvato della sorgente luminosa del catetere. Selezionare Leggi dati collocazione. Quindi, selezionare Imposta lunghezza d'onda minima e massima.
Immettere la larghezza di banda per l'analisi dei dati come da 490 a 630 nanometri. Selezionate Torna al menu principale (Return to Main Menu), quindi Leggi riferimenti (Read References). Confermate gli spettri di riferimento da utilizzare nell'analisi.
Selezionare Torna al menu principale e quindi Punti tempo nel menu principale. Selezionare ora un punto di tempo zero tempo come controllo e impostare l'intervallo su 100 punti. Selezionare anche un punto una volta come periodo sperimentale a un intervallo di 100 punti.
Osservate lo spettro delle differenze grezze nella scheda Spettro di assorbanza media. Selezionate Calcola coefficienti di adattamento e quindi fate clic sulla scheda Coefficienti di adattamento (Fit Coefficients) per osservare il corso del tempo dell'adattamento retrospettivo. Tornate al menu principale e selezionate Calcola assorbimento differenza (Calculate Difference Absorption).
Selezionare l'ora zero e la differenza tra il tempo zero e il tempo uno in tutte le posizioni. Osservare lo spettro montato nella diversa finestra dello spettro e gli elementi di raccordo nella finestra del peso di riferimento. Ripetere questa procedura per confrontare altri punti di tempo nell'esperimento.
Torna al menu principale. Salvare dati e analisi in un report foglio di calcolo digitando il nome desiderato e selezionando Salva dati per ulteriori analisi con altri programmi. Mostrato qui è lo spettro del catetere e lo spettro grezzo della luce trasmessa dalla parete priva di cuore di coniglio.
Questi dati rivelano un'attenuazione molto grande della luce nella regione blu dello spettro. Tuttavia, le bande di assorbanza dalla mioglobina e dai citocromi mitocondriali possono essere osservate direttamente tra 490 e 580 nanometri nell'inserto. Lo spettro di differenza del controllo e del cuore trattato con cianuro è mostrato qui.
Lo spettro di adattamento viene calcolato dagli spettri di riferimento. Lo spettro Residui è la sottrazione dell'adattamento dai dati grezzi. Qui sono mostrate le ampiezze degli spettri di riferimento.
Forti aumenti di assorbanza della maggior parte dei citocromi sono osservati poiché il flusso di elettroni lungo la catena del citocromo è stato bloccato dal cianuro allo stato stazionare. Inoltre, l'assorbanza della mioglobina ossigenata aumentò man mano che il consumo di ossigeno era eliminato dal cianuro. Lo spettro di differenza rispetto al washout al cianuro rispetto all'iniezione di cianuro rivela una parziale inversione dell'effetto cianuro.
Mostrato qui è lo spettro di differenza dello stato di ischemia senza flusso rispetto al controllo. Questo spettro rappresenta lo stato completamente deossigenato e ridotto dei mitocondri citosolenti verus la condizione di controllo. Attualmente stiamo studiando gli effetti dell'ossido nitrico sul metabolismo cardiaco.
Oltre ai suddetti cromofori possiamo anche tracciare altre specie otticamente rilevabili incluse la metmioglobina generata dall'ossido nitrico. Inoltre, il catetere può essere collegato a un laser per studiare il metabolismo lipidico usando la spettroscopia raman. Il metabolismo cardiaco del calcio può anche essere studiato mediante assorbimento di sonde di calcio incorporate esogenamente o geneticamente.
