Questo lavoro è sostenuto da borse di ricerca dal National Institutes of Health (HL068915; HL088206) e contributi al Fondo di conduzione cardiaca presso il Children Hospital di Boston.

Parte 1: Preparare le soluzioni e il sistema isolato cuore perfuso <ol><li> La mattina del dell&#39;esperimento, 4,0 L di Krebs-Henseleit soluzione viene preparata come descritto in precedenza [5, 6]. </li><li> 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime (BDM) è sciolto in 1,0 L di Krebs-Henseleit soluzione decantata dal perfusato preparato al punto 1.1. </li><li> Altri 150 ml di Krebs-Henseleit viene rimosso dal perfusato preparato al passo 1.1 e mescolato con 5 mol / l di-8-ANEPPS (diluito da un mMol / L 10 magazzino sciolto in dimetilsolfossido (DMSO)). </li><li> Queste tre soluzioni sono trasferiti ad acqua con camicia in vetro serbatoi (Radnóti) dove sono pre-riscaldato a 41,0 ° C e ossigenata con un gorgogliatore sommerso (Radnóti) con 0,2 micron filtrata 95% O 2, 5% CO 2. Le soluzioni da 3 serbatoi magazzino vengono pompati al muro con sistema Langendorff Masterflex ™ L / S pompe peristaltiche ea basso assorbimento tubo al silicone (Cole-Parmer). </li><li> Prima del montaggio, il sistema Langendorff vetro (Radnóti) è meticolosamente lavata con E-Toxa-CLEAN reagente (Sigma-Aldrich) e risciacquata a fondo con 0,1 M / L HCl, 100% di etanolo e acqua distillata. </li><li> Il mancato ricircolo Langendorff apparato è stato costruito per fornire 70 mm Hg a pressione costante da 3 serbatoi separati ossigenati, che sono separati dal cuore con l&#39;acqua con camicia serpentine di riscaldamento e trappole bolla (Radnóti) [7]. Le 3 linee di perfusione indipendente convergono sopra il cuore a due rubinetti a 3 vie, che ci permette di controllare con precisione la consegna delle soluzioni preparate in passi 1,1-1,3. Acqua con camicia vetro è collegato in serie con tubi BPT Masterflex PharMed (Cole-Parmer) e riscaldato a 39 ° C con acqua distillata usando due circolatori E100 (Lauda). Perdita di calore attraverso il platino tubo al silicone vulcanizzato (Cole-Parmer) che collega la pressione di testa serbatoi per le bobine di riscaldamento e trappole bolla portato ad una temperatura di 37 ° C perfusato raggiungere il cuore. </li></ol> Parte 2: Raccolta del cuore di ratto e set-up perfusione Langendorff <ol><li> Per indurre profonda anestesia generale in 200-250 g ratti Lewis, 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg xylazina viene iniettato nella cavità intraperitoneale. A questa miscela, si aggiungono 500 U / kg di eparina per prevenire la coagulazione del sangue e l&#39;ischemia miocardica durante la procedura di espianto. </li><li> Per un facile accesso al cuore e dei grossi vasi, la parete toracica anteriore è stato rimosso. Dopo di che, il tessuto circostante è attentamente sezionato e aperto il sacco pericardico. </li><li> A seguito di identificazione della vena cava inferiore, il vaso è legatura con 5-0 seta (Ethicon) e l&#39;intero blocco cuore-polmone è espiantati. Tessuti è immediatamente posto in ghiacciata Krebs-Henseleit soluzione contenuta in un bicchiere da 50 ml su ghiaccio. </li><li> L&#39;aorta ascendente è rapidamente individuato e sezionato dal tessuto circostante. Una di dimensioni idonee cannula (Harvard Apparatus) è inserita nell&#39;aorta, avendo cura di evitare di interrompere la perfusione obbligatorio delle arterie coronarie mediante l&#39;inserimento della cannula troppo nella radice aortica. La cannula viene fissato l&#39;aorta ascendente con 5-0 seta (Ethicon). </li><li> Il cuore di ratto è poi situato su di esso Langendorff senza introdurre bolle d&#39;aria nella cannula. Retrograda perfusione vascolare coronarica è ormai consolidata con il caldo, ossigenata di Krebs-Henseleit soluzione dalla pressione a testa descritto al punto 1.6. </li><li> Tessuto extra, tra cui i polmoni, è ora rimosso e il cuore è perfuso per 20 minuti per permettere il recupero della funzione e stabilizzare il ritmo. Durante questo periodo, una sonda molto sottile di temperatura termocoppia (Cole-Parmer) è introdotto nella cavità ventricolare sinistra e suturato in posizione con 5-0 Prolene sutura (Ethicon). La sonda è collegata ad un termo-regolatore (di Digi-Sense) per garantire la temperatura del cuore è mantenuta a 37 ° C regolando le impostazioni di pompe di circolazione dell&#39;acqua. Moto da perfusato stillicidio dalla apice cardiaco è ridotto al minimo mettendo un pezzo di garza nel recipiente effluenti. </li></ol> Parte 3: il cuore di carico con colorante potenziometrica e acquisire segnali elettrografiche e ottici <ol><li> Di-8-ANEPPS (Invitrogen) viene caricato nel cuore passando alla linea di perfusione contenente il Krebs-Henseleit miscelato con il colorante fluorescente con un rubinetto. Inoltre, una cannula 18G è collocato nell&#39;atrio sinistro e / o diritto e ulteriori 50 ml di soluzione colorante sta lentamente somministrato in ognuna di queste camere perché non sono sufficientemente perfusi con colorante introdotto attraverso le arterie coronariche. </li><li> Durante la procedura di caricamento, 3 derivazioni ECG (Harvard Apparatus) sono gentilmente messo sulla superficie del cuore che non sta affrontando l&#39;ottica utilizzata per la mappatura. Elettrodo N o 1 è posizionato sulla parte posteriore apicale del ventricolo sinistro, N ° 2 sul atrio sinistro, e N <su<html> p&gt; o 3 come un elettrodo di riferimento sulla radice aortica (Figura 1). I segnali atriali e ventricolari elettrografiche sono poi amplificati, digitalizzati, e visualizzata accanto segnali ottici utilizzando il software (redshirt Imaging) (Figura 2). Un oscilloscopio (Tektronix TDS modello 1002) è utilizzato anche per visualizzare la superficie ECG s in tempo reale e per garantire la stimolazione adeguata. </li><li> ECG amplificatore (Hugo Sachs Elektronik) impostazioni: filtro passa-alto: 0,1 Hz Filtro passa basso: 150 Hz </li><li> La fotocamera CMOS (redshirt Imaging) e macroscopio stata posizionata mediante gli aggiustamenti XYZ modo che la superficie del cuore è a fuoco e centrata nella cornice di acquisizione. La fotocamera e le ottiche sono montate su un tavolo isolamento dalle vibrazioni (Minus K Technology) per ridurre al minimo le frequenze di risonanza. Allo stesso tempo, un elettrodo di stimolazione coassiale (Harvard Apparatus), controllato con un isolato, S48 elettrico-stimolazione unità (Grass), è posto sulla atrio destro e il cuore viene stimolato a 300 battiti al minuto (Figura 1). </li><li> Stimolazione elettrica (Erba) impostazioni: Vota: 5 impulsi al secondo Ritardo: 0,2 ms Durata: 2 ms Volt: 6-12 V Modalità: Ripetizione Pulse: Singolo </li><li> Per le registrazioni ottiche che mancano di artefatti da movimento di contrazione, il cuore ha bisogno di essere elettromeccanicamente disaccoppiato. Facciamo questo nuovo passaggio linee di perfusione a Krebs-Henseleit soluzione che contiene 11 mmol / L BDM. Tra acquisizioni, il cuore è perfuso con puro Krebs-Henseleit per aiutare a preservare la vitalità del preparato. </li><li> I parametri di registrazione sono impostati utilizzando il software (Imaging redshirt) con le impostazioni di acquisizione seguenti: Configurazione: 2.000 Hz; 128x128 gamma di pixel Intervallo di telaio: 0,5 ms Fotocamera Guadagno Amplificatore: 5x On-Chip Guadagno: 8x-12Me-bene Shutter: 500 ms di ritardo Numero di fotogrammi: 4000 Durata: 2000 ms </li><li> Tutte le luci della stanza e le attrezzature sono disattivati ​​o schermati per eliminare rumori di fondo durante la registrazione. La luce a LED illumina il cuore solo durante la registrazione ottica per ridurre fotometabolismo e tossicità colorante. L&#39;otturatore sorgente luminosa è controllata con un impulso di 5 V fornita attraverso il pannello di controllo per mezzo di un D-to-A bordo del computer (Imaging redshirt). </li></ol> Parte 4: Analisi delle informazioni di acquisizione utilizzando Imaging Software redshirt <ol><li> A seguito dell&#39;acquisizione, i dati vengono elaborati utilizzando diverse impostazioni del filtro. Noi di solito utilizzare le impostazioni predefinite, tranne quando si regola la Banda Stop / filtro passa, che è impostato con il confine a sinistra al 44,0 e il bordo destro a 98,0. In seguito le informazioni registrate vengono elaborate e un film è generato (Imaging redshirt). </li><li> I dati di uno di acquisizione corrisponde alla attivazione elettriche locali a 16.384 siti sulla superficie del cuore per un periodo di 2 secondi. Il software permette a questi segnali locali per essere direttamente confrontati tra loro e con le registrazioni atriali e ventricolari elettrografiche. I dati vengono quindi visualizzati con la mappatura locali attivazione elettrica per colorare e rendere queste informazioni come un&#39;animazione che mostra l&#39;attivazione spazio-temporale elettrico sulla superficie cardiaca. Per creare un&#39;animazione tale, si usa il software: <ul><li> temporalmente e / o spazialmente filtrare i dati </li><li> selezionare un orario di inizio e di fine per l&#39;animazione </li><li> segnali ottici mappa di colori in base a riposo l&#39;intensità luminosa di ogni pixel </li><li> sovrapporre i dati di colore risultante con una foto del cuore </li><li> generare l&#39;animazione </li></ul></li></ol> Parte 5: risultati Rappresentante Se la preparazione cuore perfuso era immobile durante la registrazione, i segnali ottici mostrano un picco distinto per ogni pixel coinvolti in un cambiamento della intensità di emissione di di-8-ANEPPS. I film corrispondente (figure 3 e 4) dimostrare un fronte d&#39;onda di eccitazione di propagazione attraverso la superficie epicardica del cuore così come le registrazioni acquisite simultaneamente elettrografiche (Figura 2). <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure3.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Una fotografia di un Langendorff-perfuso preparazione cuore raffiguranti le posizioni degli elettrodi sulla stimolazione atrio destro e il derivazioni come descritto al punto 3.2. <img src="/files/ftp_upload/1138/Figure4thumb.jpg" alt="Figura 2" border="0" /> Figura 2. Rappresentante segnali ottici e registrazioni elettrografiche da un cuore perfuso di ratto Lewis. Un pannello mostra un&#39;immagine della superficie epicardico utilizzato per l&#39;imaging ottico. La posizione dei pixel selezionati per dimostrare i cambiamenti nella emissione di fluorescenza nel tempo, nel Pannello di B sono indicati da frecce colorate. Segnali elettrografici sono mostrati in Pannello di C con la linea rossa che indica l&#39;attivazione atriale e la linea di luce blu che corrisponde al segnale ventricolare. Per favoreve.com/files/ftp_upload/1138/Figure4.jpg &quot;&gt; clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.

<ol>
	<li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+heart.">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95 (1), 21-33 (2004).</li><li>Hucker, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Images+in+cardiovascular+medicine.+Optical+mapping+of+the+human+atrioventricular+junction.">Images in cardiovascular medicine. Optical mapping of the human atrioventricular junction.</a> Circulation. 117 (11), 1474-147 (2008).</li><li>Entcheva, E., Bien, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroscopic+optical+mapping+of+excitation+in+cardiac+cell+networks+with+ultra-high+spatiotemporal+resolution.">Macroscopic optical mapping of excitation in cardiac cell networks with ultra-high spatiotemporal resolution.</a> Prog Biophys Mol Biol. 92 (2), 232-257 (2006).</li><li>Entcheva, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+of+electrical+activity+in+cardiac+cells+using+an+all-solid-state+system.">Fluorescence imaging of electrical activity in cardiac cells using an all-solid-state system.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51 (2), 333-341 (2004).</li><li>Stamm, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+endotoxin-induced+alterations+in+myocardial+calcium+handling:+obligatory+role+of+cardiac+TNF-alpha.">Rapid endotoxin-induced alterations in myocardial calcium handling: obligatory role of cardiac TNF-alpha.</a> Anesthesiology. 95 (6), 1396-1405 (2001).</li><li>Choi, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+conduction+through+engineered+tissue.">Cardiac conduction through engineered tissue.</a> Am J Pathol. 169 (1), 72-85 (2006).</li><li>Skrzypiec-Spring, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolated+heart+perfusion+according+to+Langendorff---still+viable+in+the+new+millennium.">Isolated heart perfusion according to Langendorff---still viable in the new millennium.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 55 (2), 113-126 (2007).</li><li>Fedorov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts.">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4 (5), 619-626 (2007).</li></ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti secondo le linee guida e regolamenti stabiliti dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale uso in bambini Hospital di Boston.

L&#39;asportazione del cuore di ratti anestetizzati deve essere eseguita rapidamente per evitare di ischemia miocardica. Se la perfusione ischemia coronarica o insufficiente si verifica, il cuore probabilmente sviluppare aritmie e può diventare infartuata. Inoltre, questi cuori si dimostrano insufficienti emissione di fluorescenza per le registrazioni informative e le analisi successive. Prima di caricare il colorante, le cellule del miocardio devono essere adeguatamente perfusi con soluzione Krebs-Henseleit di stabili...

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CardioCMOS-SM128f</td>
<td>Equipment</td>
<td>RedShirt Imaging, Decatur, GA 30030 USA </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CardioPlex Software</td>
<td>Equipment</td>
<td>RedShirt Imaging, Decatur, GA 30030 USA</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>LUXEON LED Light Source 460-490 nm </td>
<td>Equipment</td>
<td>Lumileds Lighting, US, LLC, San Jose, CA 95131 USA</td>
<td>LXHL-PB02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ECG Amplifier Type 689 Hugo Sachs Elektronik</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>730149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dichroic Mirror 505 nm</td>
<td>Equipment</td>
<td>Semrock, Rochester, NY 14624 USA</td>
<td>FF505-SDi01-25x36</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Emission Filter 605 nm Long Pass</td>
<td>Equipment</td>
<td>SciMedia, Costa Mesa, CA 92626 USA </td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>THT Sideways</td>
<td>Equipment</td>
<td>SciMedia, Costa Mesa, CA 92626 USA</td>
<td>25 BM-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Ball Joint Holder</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 73-0177</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Small Stimulation Electrode Set</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 73-0160</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BM-6 Benchtop Vibration Isolation Platform</td>
<td>Equipment</td>
<td>Technology Inc., Inglewood, CA 90301</td>
<td>25 BM-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Monopolar ECG Electrode</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 73-0200</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Roller Pump SCI 400</td>
<td>Equipment</td>
<td>Watson-Marlow Bredel Inc., Wilmington, MA 01887 USA</td>
<td>401U/D1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Roller Pump MasterFlex Easy Load II</td>
<td>Equipment</td>
<td>Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois 60061 USA</td>
<td>Model 77201-60</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tubing Marprene #14</td>
<td>Equipment</td>
<td>Watson-Marlow Bredel Inc., Wilmington, MA 01887 USA</td>
<td>902.0016.016</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>MasterFlex Tubing</td>
<td>Equipment</td>
<td>PharMed, Westlake, OH 44145 USA</td>
<td>06485-25</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>S48 Square Pulse Stimulator</td>
<td>Equipment</td>
<td>Grass Technologies, West Warwick, RI 02893 USA</td>
<td>Model S48</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SIU5 RF TRANSFORMER ISOLATION UNIT</td>
<td>Equipment</td>
<td>Grass Technologies, West Warwick, RI 02893 USA</td>
<td>Model SIU5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>5 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>120142-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>120142-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.5 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>120142-0</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>0.25 Liter Water Jacketed Reservoir</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA </td>
<td>120142-025</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>10 ml Heating Coil</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>158822</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Compliance Bubble Trap</td>
<td>Equipment</td>
<td>Radnoti Glass Technology Inc., Monrovia CA 91016 USA</td>
<td>130149</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Luer Disconnect Cannula</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>72-1444</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>3-Way stopcock, FLL to MLT, No Port Covers</td>
<td>Equipment</td>
<td>Harvard Apparatus, Holliston, MA 01746 USA</td>
<td>BS4 72-2630</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Thermocouple Thermometer</td>
<td>Equipment</td>
<td>Cole Parmer, Vernon Hills, Illinois 60061 USA</td>
<td>WU-91100-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ultra Fine IT-Series Flexible Microprobe </td>
<td>Equipment</td>
<td>PhysiTemp Instruments Inc., Clifton, NJ 07013 USA</td>
<td>IT-24P</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oscilloscope Tektronix TDS 1002</td>
<td>Equipment</td>
<td>Tektronix Inc., Beaverton, OR 97005 USA</td>
<td>TDS 1002B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2,3-Butanedione monoxime </td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma, St. Louis, MO 63132 USA</td>
<td>B0753</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ketamine HCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>Hospira Inc., Lake Forest, IL 60045 USA</td>
<td>RL-0065</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Xylazine</td>
<td>Reagent</td>
<td>Lloyd Inc., Iowa 51601 USA</td>
<td>LB15705A</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>E-TOXA-CLEAN&reg;</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma, St. Louis, MO 63132 USA </td>
<td>E9029</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Di-8-ANEPPS</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen, Carlsbad, CA 92008 USA</td>
<td>D-3167</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

optical mapping of langendorff-perfused rat hearts

Mappatura ottica della superficie cardiaca con coloranti fluorescenti voltaggio-sensibile è diventato un importante strumento per indagare l&#39;eccitazione elettrica in modelli sperimentali che vanno in scala da colture di cellule di interi organi<sup&gt; [1, 2]</sup&gt;. Utilizzando state-of-the-art sistemi di imaging ottico, generazione e propagazione dei potenziali d&#39;azione durante il normale ritmo cardiaco o per tutto l&#39;inizio e la manutenzione di aritmie possono essere visualizzati quasi istantaneamente<sup&gt; [1]</sup&gt;. L&#39;ultima disponibile in commercio di sistemi in grado di fornire informazioni spazio-temporali a risoluzioni estremamente elevate e si basano su custom-built attrezzature inizialmente sviluppato per superare gli ostacoli imposti dalla elettrofisiologici metodi più convenzionali<sup&gt; [1]</sup&gt;. I progressi in alta risoluzione e ad alta velocità Complementary Metal-Oxide-Semiconductor (CMOS), macchine fotografiche e intensamente brillante, diodi emettitori di luce (LED), così come tensione-sensibili coloranti, ottica, ed i filtri hanno cominciato a fare l&#39;aquisizione del segnale elettrico pratiche per i biologi cellulari cardiovascolari che sono più abituati a lavorare con microscopi. Anche se l&#39;ultima generazione di telecamere CMOS in grado di acquisire 10.000 frame al secondo su di un array 16.384 pixel, a seconda del tipo di preparazione del campione, ormai consolidata tecnologie di acquisizione di fluorescenza come array fotodiodo, sistemi di scansione laser, e raffreddato charged-coupled device (CCD telecamere) hanno ancora alcuni distinti vantaggi rispetto alla gamma dinamica e rapporto segnale-rumore e efficienza quantica<sup&gt; [1, 3]</sup&gt;. Nel presente studio, i cuori di ratto Lewis sono stati perfusi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Con un perfusato cristalloidi (Krebs-Henseleit soluzione) a 37 ° C in un apparecchio Langendorff modificato. Dopo un periodo di stabilizzazione di 20 minuti, i cuori erano intermittente perfusi con 11 mmol / L 2,3-butanedione monoxime per eliminare le contrazioni associate movimento durante l&#39;acquisizione dell&#39;immagine. Per la mappatura ottica, abbiamo caricato i cuori con la risposta rapida sonda potenziometrica di-8-ANEPPS<sup&gt; [4]</sup&gt; (5 mmol / L) e brevemente illuminato la preparazione con 475 ± 15 nm luce di eccitazione. Durante un tipico 2 secondo periodo di illuminazione,&gt; 605 nm luce emessa dalla preparazione cardiaco è stato ripreso con una telecamera ad alta velocità CMOS collegata ad un macroscopio orizzontale. Per questa dimostrazione, i cuori sono stati ritmo di 300 battiti al minuto con un elettrodo coassiale collegato ad un&#39;unità isolata stimolazione elettrica. Registrazioni simultanee bipolare elettrografiche sono stati acquisiti e analizzati insieme con i segnali di tensione utilizzando un software facilmente reperibili. In questo modo, i potenziali d&#39;azione sulla superficie del Langendorff-cuori di ratto perfusi possono essere visualizzati e registrati con segnali elettrografiche.

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Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Questo articolo descrive una tecnica ad alta risoluzione temporale e spaziale a otticamente movimento immagine del potenziale d&#39;azione sulla superficie del Langendorff-cuore perfuso di ratto utilizzando un colorante potenziometrica (di-8-ANEPPS).

Mappatura ottica di Langendorff-perfusi Hearts Rat

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

optical-mapping-of-langendorff-perfused-rat-hearts

Research

JoVE Journal

Biology

20.7K Views.  Children's Hospital Boston and Harvard Medical School. Questo articolo descrive una tecnica ad alta risoluzione temporale e spaziale a otticamente movimento immagine del potenziale d'azione sulla superficie del Langendorff-cuore perfuso di ratto utilizzando un colorante potenziometrica (di-8-ANEPPS).

Video: Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Proper Care and Cleaning of the Microscope

Keeping the microscope optics clean is important for high-quality imaging. Dust, fingerprints, excess immersion oil, or mounting medium on or in a microscope causes reduction in contrast and resolution. DIC is especially sensitive to contamination and scratches on the lens surfaces. This protocol details the procedure for keeping the microscope clean.

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Manutenzione e pulizia adeguata del microscopio

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Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy

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We have developed a method for analyzing high speed optical recordings from Drosophila, zebrafish and embryonic mouse hearts (Fink, et. al., 2009). Our ...

Single Cell Fate Mapping in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, lymphatic, and blood vessel lineages arise in developing embryos requires fate mapping and lineage tracing of undifferentiated precursor cells. Recently, photoactivatable proteins which include: Eos1, 2, PAmCherry3, Kaede4-7, pKindling8, and KikGR9, 10 have received wide interest as cell tracing probes. The fluorescence spectrum of these photosensitive proteins can be easily converted with UV excitation, allowing a population of cells to be distinguished from adjacent ones. However, the photoefficiency of the activated protein may limit long-term cell tracking11. As an alternative to photoactivatable proteins, caged fluorescein-dextran has been widely used in embryo model systems7, 12-14. Traditionally, to uncage fluorescein-dextran, UV excitation from a fluorescence lamp house or a single photon UV laser has been used; however, such sources limit the spatial resolution of photoactivation. Here we report a protocol to fate map, lineage trace, and detect single labeled cells. Single cells in embryos injected with caged fluorescein-dextran are photoactivated with near-infrared laser pulses produced from a titanium sapphire femtosecond laser. This laser is customary in all two-photon confocal microscopes such as the LSM 510 META NLO microscope used in this paper. Since biological tissue is transparent to near-infrared irradiation15, the laser pulses can be focused deep within the embryo without uncaging cells above or below the selected focal plane. Therefore, non-linear two-photon absorption is induced only at the geometric focus to uncage fluorescein-dextran in a single cell. To detect the cell containing uncaged fluorescein-dextran, we describe a simple immunohistochemistry protocol16 to rapidly visualize the activated cell. The activation and detection protocol presented in this paper is versatile and can be applied to any model system. 
Note: The reagents used in this protocol can be found in the table appended at the end of the article.

A method is described to photoactivate single cells containing a caged fluorescent protein using two-photon absorption from a Ti:Sapphire femtosecond laser oscillator. To fate map the photoactivated cell, immunohistochemistry is used. This technique can be applied to any cell type.

Singolo Destino Mapping di celle in Zebrafish

The ability to differentially label single cells has important implications in developmental biology. For instance, determining how hematopoietic, ...

Cell Labeling and Injection in Developing Embryonic Mouse Hearts

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect their in vivo potential. Preferably, these cells should be placed in a proper embryonic environment in order to acquire their definite phenotype. Furthermore, cell lineage tracing studies in the mouse after labeling cells with dyes or retroviral vectors has remained mostly limited to early stage mouse embryos with still poorly developed organs. To overcome these limitations, we designed standard and ultrasound-mediated microinjection protocols to inject various agents in targeted regions of the heart in mouse embryos at E9.5 and later stages of development. &#160;Embryonic explant or embryos are then cultured or left to further develop in utero. These agents include fluorescent dyes, virus, shRNAs, or stem cell-derived progenitor cells. Our approaches allow for preservation of the function of the organ while monitoring migration and fate of labeled and/or injected cells. These technologies can be extended to other organs and will be very helpful to address key biological questions in biology of development.

We describe a series of methods to inject dyes, DNA vectors, virus, and cells in order to monitor both cell fate and phenotype of endogenous and grafted cells derived from embryonic or pluripotent cells within mouse embryos at embryonic day (E)9.5 and later stages of development.

Etichettatura cellulare e iniezione nello sviluppo embrionali Cuori mouse

Testing the fate of embryonic or pluripotent stem cell-derivatives in in vitro protocols has led to controversial outcomes that do not necessarily reflect ...

Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and purification of RNA, DNA, and proteins. All of these applications demand the rapid recovery of significant numbers of zebrafish hearts to avoid gene regulatory, metabolic, and other changes that begin after death. Adult zebrafish hearts are also required for studying heart structure for a variety of mutants and for studying heart regeneration. However, the traditional zebrafish heart dissection is slow and difficult and requires specialized tools, making large-scale dissection of adult zebrafish hearts tedious. Traditional methods also harbor the risk of damaging the heart during the dissection. Here, we describe a method for dissection of adult zebrafish hearts that is fast, reproducible, and preserves heart architecture. Furthermore, this method does not require specialized tools, is painless for the zebrafish, can be performed on fresh or fixed specimens, and can be performed on zebrafish as young as one month old. The approach described expands the use of adult zebrafish for cardiovascular research.

Use of zebrafish for cardiovascular research is expanding towards research on adult hearts. For these applications, quick and simple isolation of cardiac tissues is key to avoid post-mortem changes and to obtain an adequate number of samples. Here, we describe a fast and reproducible method for dissecting adult zebrafish hearts.

Recupero di Zebrafish adulti cuori per applicazioni ad alta velocità effettiva

Use of the zebrafish model system for studying development, regeneration, and disease is expanding toward use of adult hearts for cell dissociation and ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

Tensione e Calcio mappatura ottica a doppio canale di Colta HL-1 atriale miociti monostrato

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

This article describes the detailed protocol and equipment necessary for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ in the Langendorff-perfused rabbit heart. This method allows for direct observation and quantification of Vm and SR Ca2+ dynamics in the intact heart.

Mappatura ottica di Intra-reticolo sarcoplasmatico Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; E transmembrana potenziale nel Rabbit Heart Langendorff-perfuso

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The development of novel pharmacological therapies to cure these patients relies on the thorough understanding of both normal physiology and pathophysiology of the SAN. Among the studies of cardiac pacemaking, the mouse SAN is widely used due to its feasibility for modifications in the expression of different genes that encode SAN ion channels or calcium handling proteins. Emerging evidence from electrophysiological and histological studies has also proved the representativeness and similarity of the mouse SAN structure and functions to larger mammals, including the presence of specialized conduction pathways from the SAN to the atrium and a complex pacemakers' hierarchy within the SAN. Recently, the technique of optical mapping has greatly facilitated the exploration and investigation of the origin of excitation and conduction within and from the mouse SAN, which in turn has extended the understanding of the SAN and benefited clinical treatments of SAN dysfunction associated diseases. In this manuscript, we have described in detail how to perform the optical mapping of the mouse SAN from the intact, Langendorff-perfused heart and from the isolated atrial preparation. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of mouse SAN physiology and pathophysiology.

Here, we present a protocol for optical mapping of electrical activity from the mouse right atrium and especially the sino-atrial node, at a high spatial and temporal resolution.