Hirschil Trust, Michael Saperstein medici studiosi fondi di ricerca, e la comunione NYU Whitehead sostenuto questo lavoro.

1. Rivestimento del micropiastre Wells Nota: L&#39;obiettivo di questa fase è quello superfici cappotto polistirene con ICAM-1 per servire come ligandi per cellule T LFA-1. <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni: <ol><li> Preparare la soluzione di rivestimento risospendendo ricombinante ICAM-1 con tampone fosfato (PBS) (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7.4) arricchito con calcio (1 mM CaCl 2) e magnesio (2 nM MgCl 2). Assicurarsi che la concentrazione finale di ICAM-1 è di 10 mcg / ml, realizzati da uno stock di soluzione 0,7 mg / ml e conservati in una -80 ° C freezer. </li><li> Preparare la soluzione adesione arricchendo PBS con 0,5% umano (o bovina) albumina sierica (HSA / BSA), 2 mM MgCl 2, e 1 mM CaCl 2. </li><li> Preparare la soluzione di lavaggio con l&#39;aggiunta di 2 mM MgCl 2 e 1 mM CaCl 2 a PBS. Riscaldare tutte le soluzioni a 37° C prima dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Lavare 24 pozzi con 50 ml di soluzione di lavaggio. Ciò comprende i pozzi non lavate, (PMA cellule trattate) positive, e negative (pozzi rivestiti) controlli. Per ogni condizione impostata almeno tre pozzi (triplice copia). </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione di rivestimento a ciascun pozzetto. Non aggiungere ai pozzetti di controllo non rivestiti. Incubare per un&#39;ora dentro 37 ° C incubatore. </li><li> Aspirare la soluzione di rivestimento delicatamente, senza che questo venga a contatto del fondo dei pozzetti. Lavare una volta con 50 ml di soluzione di lavaggio. </li><li> Aggiungere 50 ml di soluzione di adesione e incubare la micropiastra per un hr dentro 37 ° C incubatore. </li><li> Aspirare delicatamente e lavare con una soluzione di lavaggio 50 microlitri. Utilizzare la piastra lo stesso giorno, tuttavia è possibile mantenere a 4 ° C durante la notte, e usarlo il giorno seguente. </li></ol> 2. T isolamento delle cellule da sangue <ol><li> Aggiungi T arricchimento di cellule umane cocktail a 50 microlitri / ml of sangue intero (ad esempio per 3 ml di anticoagulante (eparina, EDTA o citrato) sangue intero, aggiungere 150 ml di cocktail). Mescolare bene. </li><li> Incubare 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Per un tubo da centrifuga da 50 ml aggiungere 3 ml di sangue trattato e un volume uguale di PBS (senza calcio e magnesio) arricchito con 1% D-glucosio a temperatura ambiente. Mescolare delicatamente con una pipetta Pasteur. </li><li> Aggiungere 15 ml PLUS Ficoll-Paque al tubo da centrifuga. </li><li> Strato attentamente le 6 ml di diluito campione di sangue sul terreno di isolamento dei linfociti. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 20 min a 20 ° C con pausa off. </li><li> Raccogliere lo strato superiore mediante una pipetta Pasteur pulito, lasciando lo strato linfociti indisturbato all&#39;interfaccia. Lo strato superiore di plasma può essere conservato per un uso successivo. Usando una pipetta Pasteur pulito trasferire lo strato linfociti in una provetta da centrifuga pulita. </li><li> Aggiungere 3 volumi (9 ml) di PBS ai linfociti. Sospendere le cellule delicatamente drali ala dentro e fuori di una pipetta Pasteur. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 5 min a 20 ° C. </li><li> Rimuovere il surnatante. I linfociti devono ora essere sospese in mezzo appropriato per l&#39;applicazione. Trasferire le cellule in un pallone T-75 in 20 ml di coltura RPMI 1640 supporto contenente 10% FBS, 1% di penicillina / streptomicina. </li></ol> 3. Preparazione delle cellule Nota: Il presupposto è per le cellule da etichettare con un reagente fluorescente. In questo protocollo utilizzare carbossi fluoresceina estere succinimidyl (CFSE), proteina fluorescente tuttavia verde (GFP), le cellule che esprimono sono un&#39;alternativa accettabile. <ol><li> Conte 2.4 x 10 6 cellule T (1 x 10 5 per ogni pozzetto) utilizzando un emocitometro. </li><li> Risospendere le cellule in coltura privo di siero (deprivazione di siero). Incubare le cellule per 2 ore a 37 ° C incubatore. </li><li> Centrifugare le cellule per 5 min (400 xg). Aspirare i media erisospendere in 1 ml di PBS. </li><li> Aggiungi CFSE a 1:1000 diluizione (azione fatta a 5 mm). Coprire dalla luce e incubare per 8 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Arrestare la reazione aggiungendo 10 ml di 37 ° C PBS e centrifugare a 400 xg per 5 min. </li><li> Risospendere pellet cellulare con 1,2 ml di soluzione di adesione pre-riscaldato (1 x 10 5 cellule per 50 microlitri). </li></ol> 4. Stimolazione delle cellule Nota: Per avviare l&#39;adesione, le cellule devono essere stimolate. Nel seguente esperimento le cellule vengono stimolate tramite il TCR utilizzando anticorpi anti-CD3 reticolazione, tuttavia solubile SDF-1 potrebbe servire come alternativa. A seconda della meta degli esperimenti, vari reagenti farmacologici potrebbero essere aggiunti prima o durante la stimolazione per studiare l&#39;impatto sulla adesione cellulare. Forbol myristate acetato (PMA) è un estere phorbol che è strutturalmente simile al secondo glicerolo messaggero diacyl (DAG) e quindi attiva la chinasi multiplasa valle del TCR (principalmente proteina chinasi C); qui viene utilizzato come controllo positivo. <ol><li> Riscaldare la micropiastra a 37 ° C. </li><li> Dividere le celle vuote in 8 provette da 1,5 ml (150 microlitri in ciascun tubo), un tubo per ogni condizione. </li><li> Trattare le cellule di conseguenza: <ol><li> Stimolare un tubo con PMA a 10 ng / ml per servire come controllo positivo. Mantenere tre tubi non trattata, per servire come controllo per la stimolazione (&quot;nessuno stimolo&quot;), il controllo di carico non lavati (&quot;no wash&quot;), e controllo per ICAM-1 coating (&quot;patinata&quot;). </li><li> Stimolare quattro tubi con differenti concentrazioni di anticorpi anti-CD3 (0,1, 1, 5, e 10 ug / ml). Continuare con il passaggio successivo, senza ritardi. </li></ol></li><li> Aliquota 50 ml di miscela di cellule stimolate in ciascun pozzo vuoto. Il numero totale di cellule per pozzetto è 1 x 10 5. </li><li> Posizionare la micropiastra in C incubatore a 37 ° per 15 min. Nota: alcune linee di cellule T necessitano di stimoli più breve<html> Tempo zione. Durante questo periodo, le cellule stabilirsi al fondo dei pozzetti e rispettare i ligandi bersaglio. </li></ol> 5. Dilavamento cellule non aderenti Nota: Lo scopo di questa fase è quello di rimuovere le cellule che non erano in grado di formare contatti stretti con le superfici rivestite con ligando. Utilizzare una pipetta multicanale per questo passo per assicurare che le stesse forze fisiche vengono applicati a tutti i pozzetti. E &#39;importante mantenere i pozzetti di controllo indicati non lavati per assistere nel calcolo della percentuale di cellule aderenti. <ol><li> Aggiungere 150 ml di soluzione di adesione caldo ad ogni pozzetti. Agitare la piastra delicatamente per alcuni secondi prima di rimuovere il terreno dai pozzetti. Non toccare il fondo dei pozzetti con le punte. </li><li> Ripetere questa operazione tre volte. Cambiare la direzione della pipetta durante la dispensazione del buffer in e out. </li></ol> 6. Determinazione della percentuale di cellule aderenti _content &quot;&gt; Nota: In questo passaggio un lettore di piastra fluorescente è utilizzato per misurare l&#39;intensità di fluorescenza in ogni pozzetto L&#39;intensità è in diretta correlazione con il numero delle cellule aderenti.. <ol><li> Accendere il lettore di piastre. Aprire il software lettore di piastre facendo clic sull&#39;icona di collegamento sul desktop. <ol><li> Dal menu &quot;Attività&quot; click &quot;Nuovo&quot; per creare un nuovo protocollo. </li><li> Dal menu &quot;Azioni&quot; scegliere l&#39;opzione &quot;Leggi&quot;. Fare clic su &quot;intensità di fluorescenza&quot;, e ha colpito la scheda &quot;Ok&quot;. </li><li> Dal menu a discesa selezionare &quot;Eccitazione 485&quot; e &quot;d&#39;onda di emissione 528&quot;. Hit la scheda &quot;Ok&quot;. </li><li> Nel menu delle opzioni &quot;Optic&quot;, selezionare &quot;Fine&quot; e premere la scheda &quot;Ok&quot;. Torna al menu &quot;Azioni&quot; e impostare la temperatura a 37 ° C e fare clic su &quot;Ok&quot;. </li><li> Inserire la micropiastra nel lettore piastra efare clic su &quot;Esegui&quot;. Il risultato sarà esportato in Excel foglio di calcolo. </li></ol></li><li> Calcolare la percentuale di cellule aderenti utilizzando la seguente formula: Percentuale di cellule aderenti = (intensità media fluorescente leggere nei pozzetti lavati) / (intensità media fluorescente leggere nelle cellule non lavate) x 100%. </li></ol>

<ol>
	<li>Dustin, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membranes+as+messengers+in+T+cell+adhesion+signaling.">Membranes as messengers in T cell adhesion signaling.</a> Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTPases+and+LFA-1+reciprocally+modulate+adhesion+and+signaling.">GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling.</a> Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).</li><li>Rose, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+modulation+and+signaling+in+leukocyte+adhesion+and+migration.">Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration.</a> Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).</li><li>Alon, R., Feigelson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-triggered+leukocyte+arrest:+force-regulated+bi-directional+integrin+activation+in+quantal+adhesive+contacts.">Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).</li><li>Griffith, J. W., Luster, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+cells+in+motion:+migrating+toward+improved+therapies.">Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies.</a> Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).</li><li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+and+actin+cytoskeleton+at+immune+synapses+and+kinapses.">Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses.</a> Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).</li><li>Springer, T. A., Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+inside-out+signaling+and+the+immunological+synapse.">Integrin inside-out signaling and the immunological synapse.</a> Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).</li><li>Mor, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=D1+regulates+lymphocyte+adhesion+via+upregulation+of+Rap1+at+the+plasma+membrane.">D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane.</a> Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).</li><li>Bivona, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rap1+up-regulation+and+activation+on+plasma+membrane+regulates+T+cell+adhesion.">Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion.</a> J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).</li><li>Zeltzer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+adhesion+of+CD4++T+cells+from+dialysis+patients+to+extracellular+matrix+and+its+components+fibronectin+and+laminin.">Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin.</a> Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).</li><li>Bhattacharyya, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Both+adhesion+to+immobilized+vitronectin+and+Fc+epsilon+RI+cross-linking+cause+enhanced+focal+adhesion+kinase+phosphorylation+in+murine+mast+cells.">Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells.</a> Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).</li><li>Dustin, M. L., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+signaling+clusters+in+the+immune+synapse.">Receptor signaling clusters in the immune synapse.</a> Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ci sono diversi saggi per studiare segnali di LFA-1 attivazione e T adesione cellulare 12. Citometria a flusso è utilizzato per misurare la LFA-1 affinità stati nelle cellule viventi utilizzando anticorpi monoclonali che si legano selettivamente a uno piegato o estesa LFA-1. Uno dei limiti di questo metodo è che non tiene conto avidità delle integrine. Saggi di migrazione sono strumenti utili ma che misurano la migrazione, e non l&#39;adesione misero in un dato momento. Modelli murini per studiare la migr...

T linfociti adesione è un processo fondamentale nella risposta immunitaria 1. E &#39;richiesto per l&#39;interazione delle cellule T con le cellule endoteliali decorare le pareti dei capillari, per antigene scansione cellule presentanti (APC) entro linfonodi, e per la formazione di sinapsi immunologiche (IS) con cellule bersaglio 2. Questi requisiti sono funzionalmente e cineticamente distinti. Il processo di linfociti stravaso si compone di chemiotassi, laminazione, ferma adesione e la trasmigrazione. La transizione dalla laminazione a rassodare adesione richiede cellule T per rispondere a un segnale recettore accoppiato a proteina G rapidamente. Questa risposta produce un&#39;interazione ligando integrina che rallenta e arresti la cella di rotolamento 3. Un cambiamento immediato nel avidità delle integrine media questo processo. La migrazione richiede interazioni betweenTcells dinamici e cellule endoteliali, con la formazione di aderenze al &#39;front end&#39; e la rottura delle aderenze alla &#39;coda&#39;con un intervallo di circa un minuto tra formazione e la rottura 4. La IS forma inminutes, ma deve rimanere intatta per ore 6. È interessante notare che, una molecola di adesione, la funzione dei linfociti membro della famiglia delle integrine antigene associato (LFA) - 1, è essenziale per tutti questi processi 5. LFA-1 media l&#39;adesione attraverso interazioni con diversi membri della superfamiglia delle immunoglobuline. Il ligando più studiato con la più alta affinità di LFA-1 è la molecola di adesione intercellulare (ICAM) -1. Linfociti circolanti non attivati ​​esprimono bassa affinità LFA-1 sulla superficie cellulare, e quindi sono in grado di aderire alle superfici ICAM-1-rivestita. LFA-1 affinità è variabile e regolata da diversi eventi di segnalazione come la proteina recettore accoppiato attivazione G, stimolazione di citochine, e segnali mediati da recettori delle cellule T (TCR). La risultante forma alta affinità di LFA-1 trasmette l&#39;attivazione intracellulare allo spazio extracellulare tttraverso interazioni con ICAM-1. Questo percorso è definito dentro-fuori di segnalazione 7. Analogamente, la segnalazione attraverso LFA-1 dallo spazio extracellulare è chiamato dall&#39;esterno all&#39;interno segnalazione. Il intracellulare cascate di segnalazione coinvolte nel inside-out e outside-in di segnalazione sono un obiettivo importante della ricerca attuale. La piccola GTPasi Rap1 è recentemente emerso come il componente chiave di inside-out di segnalazione che è comune ad entrambi legatura TCR e citochine segnalazione 8. Il ruolo critico di Rap1 in attivazione integrina è evidenziata dalla scoperta che la sovraespressione di Rap1 stimola integrina-dipendente adesione delle cellule T, mentre l&#39;adesione delle cellule T è bloccato da espressione di dominante Rap1 negative 9. Questi progressi nella nostra comprensione della regolazione integrina da Rap1 sono state compiute utilizzando strumenti in vitro. Tra questi è il saggio adesione statica qui descritto. L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di studiare Tadesività e ICAM-1 superfici rivestite. Più specificamente, viene utilizzato per misurare obiettivamente e quantificare LFA-1 affinità verso i suoi contatore ligandi in cellule vive in tempo reale, in condizioni diverse. Questa tecnica utilizza pozzetti di polistirene rivestite con ICAM-1 per imitare le superfici cellulari che le cellule T interagiscono. Molti saggi di adesione delle cellule T statico precedentemente descritti potessero sperimentalmente complesso. Questi saggi spesso richiesti per le cellule T siano marcati radioattivamente, utilizzate cellule corneali bovina coltivate per creare una matrice extracellulare come substrato per l&#39;adesione delle cellule T, o chiamati per non fisiologica stimolazione delle cellule T durante un periodo prolungato di promuovere l&#39;adesione delle cellule T 10. L&#39;uso di misurazione fluorimetrica quantificare cellule T a seguito dell&#39;incubazione adesione è un metodo più sensibile e preciso di quantificazione rispetto alla citometria a flusso e microscopia, come sono utilizzati in molti altri sistemi di dosaggio 11. Inoltre, microscop singola cellaanalisi ic Geografica integrina non consente l&#39;ampio, popolazione sulla base dell&#39;analisi nello stesso modo come la misurazione fluorimetrica. Mentre LFA-1 anticorpi specifici dello stato di attivazione sono disponibili in commercio, questi anticorpi offrono una bassa sensibilità rispetto al metodo descritto qui. Il principale vantaggio rispetto alle tecniche alternative è la sua semplicità e la capacità di esaminare più condizioni sperimentali contemporaneamente. Quando si considera questo metodo per una specifica applicazione, si dovrà tener conto che le cellule T devono essere selezionati negativamente, appena isolate, e marcate con un marcatore fluorescente.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="828">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Plate reader</td>
			<td style="width:160px;">BioTek&#160;</td>
			<td style="width:136px;">Synergy H1 Hybrid</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Multichannel pipette</td>
			<td style="width:160px;">Fisher</td>
			<td style="width:136px;">21-377-829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">96-well microplate with optical bottom</td>
			<td style="width:160px;">Corning Costar</td>
			<td style="width:136px;">3603</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Recombinant ICAM-1</td>
			<td style="width:160px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:136px;">ADP4-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Anti-CD3 antibodies</td>
			<td style="width:160px;">Ancell</td>
			<td style="width:136px;">144-020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">PMA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">79346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">BSA</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:136px;">A2058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">CFSE</td>
			<td style="width:160px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:136px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">RPMI</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">DPBS containing calcium and magnesium</td>
			<td style="width:160px;">Gibco</td>
			<td style="width:136px;">14190250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Peripheral lymphocytes</td>
			<td style="width:160px;">e.g. mouse or human</td>
			<td style="width:136px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:444px;">Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>499609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Open Gen 5 software</td>
			<td>BioTek</td>
			<td>Version 2.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>71-7167-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">15 and 50 mL centrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>352099, 352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable plastic Pasteur pipettes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">T-75 culture flasks</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50-754-1366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RosetteSep T cell enricment kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>15061</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

static adhesion assay for the study of integrin activation in t lymphocytes

È richiesto T linfociti adesione per molteplici funzioni delle cellule T, compresa la migrazione ai siti di infiammazione e formazione di sinapsi immunologica con cellule presentanti l&#39;antigene. Cellule T compiere adesione regolata controllando le proprietà adesive delle integrine, una classe di molecole di adesione cellulare composti da coppie eterodimeri di proteine ​​transmembrana che interagiscono con le molecole bersaglio sulle cellule partner o matrice extracellulare. Il più importante integrina cellule T è la funzione dei linfociti antigene associato (LFA) -1, composto da subunità αL e β2, il cui obiettivo è la molecola di adesione intracellulare (ICAM) -1. La capacità di una cellula T per controllare adesione deriva dalla capacità di regolare gli stati affinità dei singoli integrine. Inside-out di segnalazione descrive il processo attraverso il quale i segnali all&#39;interno di una cella causano i domini esterni delle integrine ad assumere uno stato attivato. Gran parte della nostra conoscenza di questi fenomeni complessi si basa su meccanicisticastudi effettuati in semplificata in sistemi modello in vitro. Il test dei linfociti T adesione qui descritto è un ottimo strumento che consente alle cellule T di aderire a bersaglio molecole, in condizioni statiche, e poi utilizza un lettore di piastra fluorescente quantificare adesività. Questo test è stato utile per definire sostanze adesione-stimolatorio o inibitorio che agiscono sui linfociti, così come caratterizzare gli eventi di segnalazione coinvolte. Anche se qui descritta per LFA-1 - ICAM-1 di adesione mediata; questo dosaggio può essere facilmente adattato per consentire lo studio di altre interazioni adesive (ad esempio VLA-4 - fibronectina).

Di seguito è riportato un esempio di saggi di adesione usando cellule T primarie stimolate con diverse concentrazioni di anticorpi anti-CD3. È utile conoscere la fluorescenza delle cellule non lavate (cioè il carico totale). Cellule non stimolate servono come controllo negativo e cellule trattate PMA sono il controllo positivo per gli anticorpi anti-CD3. Cellule piastrate in pozzetti rivestiti servono come controllo per ICAM-1. In un tipico esperimento la percentuale di cellule trattate con PMA aderenti è t...

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Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

Saggi di adesione statica è un potente strumento che può essere utilizzato per modellare le interazioni tra linfociti T e altri tipi di cellule. Interazioni sono generati iniettando cellule T etichettati in pozzetti rivestiti con molecole di adesione, mentre un lettore di piastra viene utilizzato per quantificare il numero di cellule aderenti seguente lavaggi seriali.

Static Adesione saggio per lo Studio della integrina attivazione nei linfociti T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

static-adhesion-assay-for-study-integrin-activation-t

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15.9K Views.  New York University School of Medicine.  Saggi di adesione statica è un potente strumento che può essere utilizzato per modellare le interazioni tra linfociti T e altri tipi di cellule. Interazioni sono generati iniettando cellule T etichettati in pozzetti rivestiti con molecole di adesione, mentre un lettore di piastra viene utilizzato per quantificare il numero di cellule aderenti seguente lavaggi seriali. 

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Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

Metodi per valutare la morte delle cellule beta Mediata da linfociti T citotossici

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

In vitro di Adesione batterica su mammiferi cellule epiteliali

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

Differenziazione Regia di cellule staminali pluripotenti indotte verso Linfociti T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay misurare Adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets including Th1, Th2, and regulatory T cells. Th17 cells have emerged as a central culprit in overzealous inflammatory immune responses associated with many autoimmune disorders. In this method we purify T lymphocytes from the spleen and lymph nodes of C57BL/6 mice, and stimulate purified CD4+ T cells under control and Th17-inducing environments. The Th17-inducing environment includes stimulation in the presence of anti-CD3 and anti-CD28 antibodies, IL-6, and TGF-&#946;. After incubation for at least 72 hours and for up to five days at 37 &#176;C, cells are subsequently analyzed for the capability to produce IL-17 through flow cytometry, qPCR, and ELISAs. Th17 differentiated CD4+CD25- T cells can be utilized to further elucidate the role that Th17 cells play in the onset and progression of autoimmunity and host defense. Moreover, Th17 differentiation of CD4+CD25- lymphocytes from distinct murine knockout/disease models can contribute to our understanding of cell fate plasticity.

Isolation and Th17 Differentiation of Na&amp;#239;ve CD4 T Lymphocytes

With effector functions distinct from other T cell subsets, Th17 cells have been centrally implicated in inflammatory autoimmunity. This in vitro Th17 differentiation protocol provides a means to determine whether na&#239;ve CD4+ T lymphocytes can differentiate into Th17 cells, and to further examine their role in autoimmunity and host response.

Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un flusso di Adesione saggio per studiare Leucocyte reclutamento a epatici umani sinusoidali Endotelio in condizioni di stress Shear

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Umano camera di flusso neutrofili saggio

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro e in vivo modello per studiare l&#39;adesione batterica alla parete del serbatoio in condizioni di flusso

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Efficient Isolation Protocol for B and T Lymphocytes from Human Palatine Tonsils

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to the palatine tonsils situated at the lateral walls of the oral part of the pharynx. Surgically removed palatine tonsils provide a convenient accessible source of B and T lymphocytes to study the interplay between foreign pathogens and the host immune system. This video protocol describes the dissection and processing of surgically removed human palatine tonsils, followed by the isolation of the individual B and T cell populations from the same tissue sample. We present a method, which efficiently separates tonsillar B and T lymphocytes using an antibody-dependent affinity protocol. Further, we use the method to demonstrate that human adenovirus infects specifically the tonsillar T cell fraction. The established protocol is generally applicable to efficiently and rapidly isolate tonsillar B and T cell populations to study the role of different types of pathogens in tonsillar immune responses.

Palatine tonsils are a rich source of B and T lymphocytes. Here we provide an easy, efficient and rapid protocol to isolate B and T lymphocytes from human palatine tonsils. The method described has been specifically adapted for studies of the viral etiology of tonsil inflammation known as tonsillitis.

Efficiente protocollo Isolamento da B e T linfociti umani da Palatine Tonsille

Tonsils form a part of the immune system providing the first line of defense against inhaled pathogens. Usually the term &#8220;tonsils&#8221; refers to ...