Questo lavoro è stato supportato dal Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N; &quot;Eddy Merckx Research Grant&quot; e la &quot;Sporta Research Grant&quot; per Cardiologia Pediatrica, UZ Leuven, Belgio (JC); il Centro per Molecolare e Biologia Vascolare è supportato dal Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014), dal &quot;Geconcentreerde Onderzoeksacties&quot; (GOA 2009/13) presso l&#39;Università di Lovanio e un assegno di ricerca da Boehringer-Ingelheim.

Gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal Comitato Etico della KU Leuven. 1. I batteri Preparazione in vitro perfusione e in vivo <ol><li> Abbiamo usato S. aureus ceppo Newman per tutti gli esperimenti descritti in questo manoscritto. S. aureus Newman è stato memorizzato in Brain Heart Infusion (BHI) con il 10% di glicerolo a -80 ° C. </li><li> Utilizzare un&#39;ansa sterile per raschiare i batteri congelati off e inoculare in 5 ml Tryptic Soy Broth (TSB) O / N a 37 ° C (OD 600&gt; 3). </li><li> Lavare i batteri mediante centrifugazione (2.600 g, RT, 5 min) e risospendere il pellet batterico in 5 ml di PBS (tampone fosfato salino). </li><li> Preparare una soluzione di 1 mg / ml di 5 (6) estere -carboxy-fluoresceina N-hydroxysuccinimidyl (carbossi-fluoresceina) in etanolo. Diluire il / soluzione 1 mg ml di carbossi-fluoresceina a 150 mg / ml in acqua grado di laboratorio (ad esempio, acqua MilliQ). Proteggere i tubi di lucecon un foglio di alluminio e conservare a -20 ° C. </li><li> Centrifugare i batteri (2.600 xg, RT, 5 min). Risospendere il pellet batterico in 800 l di PBS e aggiungere 200 ml (concentrazione finale di 30 mg / ml per gli esperimenti di perfusione) o 400 ml (concentrazione finale 50 mg / ml per gli esperimenti in vivo) della / ml soluzione carbossi-fluoresceina 150 mcg. Proteggere i tubi dalla luce con un foglio di alluminio e incubare per 30 minuti a RT su un agitatore. </li><li> Dopo etichettatura, blocco con soluzione al 6% albumina di siero bovino (BSA) in PBS. </li><li> Diluire batteri utilizzando densitometria ottica (OD), un OD 600 di 0,65 per esperimenti in vitro (corrispondenti a circa 3 x 10 8 unità formanti colonie (CFU) / ml di S. aureus) e un diametro esterno di 600 1.8 per esperimenti in vivo ( corrispondente a circa 1 x 10 9 CFU / ml per S. aureus) in PBS. Proteggere i tubi dalla luce con un foglio di alluminio e lasciare sul ghiaccio. </li></ol> 2. Gli esperimenti in vitro perfusione <ol><li> Rivestimento di vetrini di vetro <ol><li> Diluire fattore di von Willebrand (VWF) (Haemate P, concentrazione della 2.400 mg / ml) in acqua grado di laboratorio (deionizzata distillata) ad una concentrazione finale di 50 mg / ml. </li><li> Diluire collagene in soluzione isotonica di glucosio (soluzione SKF, pH 2,7-2,9, come fornito dal produttore) ad una concentrazione finale di 160 mg / ml. </li><li> Coprioggetto di vetro Coat (24 × 50 mm) con VWF o collagene facendo cadere 200 ml di rivestimento sul parafilm e posizionare il vetrino in cima della goccia. La goccia si diffonderà lungo la superficie del vetrino. </li><li> Incubare il vetrino in un contenitore umidificato per 4 ore a temperatura ambiente. Sollevare con cautela i coprioggetti dal parafilm con un ago smussato. Montare il vetrino nella parte inferiore della camera di flusso. </li></ol></li><li> Rivestimento di plastica scivola con le cellule endoteliali <ol><li> Scivola Coat plastica(1-well camera di coltura cellulare PCA, Sarstedt, Germania) con 1 ml di una soluzione di gelatina 1% in PBS e incubare per 30 min a 37 ° C. Cellule umane Seed vena ombelicale endoteliali (HUVEC) sui gelatina rivestito scivola di plastica e di farle crescere al 70-80% di confluenza. Montare lo scorrimento in plastica nella parte inferiore della camera di flusso. </li></ol></li><li> Perfusion Experiment NOTA: Una panoramica schematica del modello di perfusione in vitro è rappresentata in figura 1. <ol><li> Eseguire in vitro studi adesione batterica in una camera di flusso lamiera microforata parallelo ad un carico laminare taglio tra 2,5 dyne / cm 2 e 20 dyne / cm 2 per simulare diverse condizioni di flusso fisiologiche. </li><li> Il (progettazione interno) camera di flusso è costituito da un telaio metallico e una camera di perfusione fatto di plexiglas (poli (metil) metacrilato (PMMA)). Collegando ad una pompa per infusione ad alta precisione (PHD 2000 Infusion, Harvard Apparatus, Stati Uniti d&#39;America), siamo in grado di generare flussi di raTES tra 0,0001 ml / min e 220,82 ml / min. </li><li> Collegare il tubo per la parte superiore della camera di flusso e iniettare fluido nel tubo. Posizionare delicatamente la parte superiore della camera di flusso sopra la parte inferiore e montare la camera di flusso. Fare attenzione a evitare bolle d&#39;aria. Iniettare 1 ml di terreno attraverso la camera per assicurarsi che la camera non perde e per rimuovere la soluzione di rivestimento in eccesso. Evitare bolle d&#39;aria. </li><li> Posizionare il mouse su una piastra elettrica termo-controllata a 37 ° C su un vassoio microscopio. Poiché questo è un procedimento terminale, non vi è alcuna necessità di severe procedure asettiche. Fare un&#39;incisione vicino alla vena giugulare, rimuovere delicatamente il lato destro del muscolo cervicale e isolare la vena giugulare dal tessuto circostante. </li><li> Impostare la pompa di infusione e microscopio a fluorescenza. Impostazioni della pompa di infusione dipendono dal diametro siringa e la portata desiderata (vedere paragrafo 2.4). D&#39;ora in poi, lavorare in una stanza buia. </li><li> VWF Rivestimento: <ol><li> Riempire una siringa con batteri fluorescente e collegarlo al tubo di ingresso. Evitare bolle d&#39;aria. Avviare la pompa di infusione per 10 minuti. Il tempo di infusione dipende dalla velocità di deformazione e il rivestimento, batteri e mezzo utilizzato e dovrebbe rappresentare lo stato stazionario di aderenza. </li><li> Dopo 10 min, lavare via i batteri non legato collegando una siringa con PBS al tubo di ingresso e di avviare la pompa per infusione. </li><li> Prendere almeno 15 immagini o filmati in diversi punti dopo il processo di lavaggio. I batteri sono piccoli e potenzialmente difficile mettere a fuoco. Prima dell&#39;esperimento flusso in vitro, il piano focale appropriata può essere recuperato mettendo una goccia di batteri fluorescente su un vetrino e posizionare il vetrino nella camera di flusso. Quindi, cercare il piano focale appropriata e salvare le impostazioni. NOTA: Durante l&#39;esperimento flusso in vitro, catturando le immagini durante la fase di lavaggio (± 5 min dopo l&#39;avvio) assicura che solo lasegnale per i batteri aderenti viene catturato. </li></ol></li><li> Collagene Rivestimento: <ol><li> Aggiungere 60 mg / ml VWF ai batteri fluorescente appena prima di iniziare la perfusione. Riempire una siringa con batteri fluorescente o batteri fluorescente integrata con 60 mg / ml VWF e collegarlo al tubo di ingresso. Evitare bolle d&#39;aria. Ripetere i passaggi da 2.3.5.2 a 2.3.5.3 </li></ol></li><li> Cellule endoteliali: <ol><li> Attivare le cellule endoteliali mediante perfusione con una soluzione 0,1 mM di Ca 2+ -ionophore A23187 (soluzione stock 10 mM disciolto in dimetilsolfossido (DMSO)) in DMEM alla stessa velocità di taglio come la perfusione batterico per 10 min in perfusione con 0,1 mm. Ripetere i passaggi da 2.3.5.2 a 2.3.5.3. </li></ol></li></ol></li><li> Calcola gradiente di velocità e sforzo di taglio come segue. Tasso Shear = 6Q / wh 2 Dove: Q: portata in ml / min, w: larghezza in cm, h: altezza in cm Lo stress Shear (τ) = taglio rattoex viscosità (μ) Dove μ: media: 0.01 dynes x sec / cm 2, sangue intero: 0.04 dine x sec / cm 2 </li><li> L&#39;analisi delle immagini <ol><li> Ottenere le immagini dal vivo utilizzando un microscopio a fluorescenza invertito con una macchina fotografica in bianco e nero e sviluppare mediante software di imaging. Utilizzare il tempo di esposizione di 1,5 sec. Prendere istantanee multiple (almeno 15) distribuite casualmente sulla superficie rivestita della camera di flusso e salvarli nel formato di file appropriato. </li><li> Eseguire l&#39;analisi delle immagini con ImageJ. Sottrarre il fondo per rimuovere continui sfondi lisci dall&#39;immagine (Process - Contesto Sottrarre) e definire la soglia per impostare i valori di soglia inferiore e superiore, segmentando le immagini in scala di grigi in caratteristiche di interesse. Misurare l&#39;area limitata alla soglia. </li><li> Confronta adesione batterica, espresso in zona fluorescenti, ad esempio, utilizzando il software di analisi statistica. Confronta i gruppi utilizzando ANOVA unidirezionale o two-coda t-test di Student. Segnala tutti i valori medi errore ± standard della media (SEM). Si consideri un valore p- &lt;0,05 significative (* p &lt;0,05; ** p &lt;0.01; *** p &lt;0.001). </li></ol></li></ol> 3. In Vivo mesenterica Perfusion Modello <ol><li> Preparazione / chirurgia del mouse <ol><li> Digiunare il mouse la notte prima dell&#39;esperimento per limitare il movimento intestinale. </li><li> Dare un 6-8 settimane vecchio mouse (C57Bl / 6) l&#39;analgesia pre-operatoria per una iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,1 mg / kg di peso corporeo (BW)) 20-30 minuti prima dell&#39;intervento. </li><li> Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di ketamina (125 mg / kg di peso corporeo) e xilazina (12,5 mg / kg di peso corporeo). Controllare a pedale reflex. Applicare veterinario pomata per prevenire la secchezza. </li><li> Posizionare il mouse su una piastra elettrica termo-controllata a 37 ° C su un vassoio microscopio. Poiché questo è un procedimento terminale, non vi è alcuna necessità di una rigorosa asceptiProcedure c. Fare un&#39;incisione vicino alla vena giugulare, rimuovere delicatamente il lato destro del muscolo cervicale e isolare la vena giugulare dal tessuto circostante. </li><li> Inserire un catetere endovenoso francese 2 nella vena giugulare destra per l&#39;infusione di batteri fluorescente o altre soluzioni. Aprire la cavità peritoneale attraverso un incisione addominale mediana e utilizzare tamponi di cotone per diffondere il mesentere e di visualizzare il arteriolare mesenterica e la circolazione venulare. </li><li> Posizionare il mouse sul lato destro su una lastra trasparente e fissare la cannula con nastro. Utilizzare un impacco caldo per prevenire l&#39;ipotermia. Per evitare la disidratazione del tessuto, goccia 500 ml 0,9% NaCl l&#39;intestino. </li></ol></li><li> Microscopia a fluorescenza di adesione batterica alla circolazione mesenterica <ol><li> Lavorare in una stanza buia. Usare tamponi di cotone per immobilizzare i vasi e li visualizza sotto un microscopio invertito. </li><li> Topicamente applicare 5 ml di una soluzione 10 mM of Ca 2+ -ionophore A23187 disciolto in DMSO. Dopo 10 secondi, iniettare 100 pl batteri etichettati (vedi punto 1) attraverso il catetere giugulare. Prendere immagini time-lapse. Dopo l&#39;esperimento è finito, eutanasia il mouse secondo le linee guida istituzionali approvate. </li></ol></li><li> Image Analysis <ol><li> Ottenere le immagini dal vivo usando un microscopio a fluorescenza invertito, catturata con una macchina fotografica in bianco e nero e sviluppato utilizzando qualsiasi software di imaging. Applicare tempo di esposizione automatizzato e ottimizzazione contrasto specifici per l&#39;apparecchiatura utilizzata. </li><li> Acquisire time-lapse immagini utilizzando lo strumento &#39;acquisizione&#39; nella barra degli strumenti (Acquisizioni multidimensionale - Time) con 40 cicli di 1.000 immagini / sec. Salvare le immagini in un formato di file immagine appropriato. </li><li> Le immagini del processo utilizzando il software di analisi ImageJ per misurare l&#39;area del segnale fluorescente per immagine. Definire la soglia per impostare i valori di soglia inferiore e superiore, segmentando le immagini in scala di grigi in features di interesse. Identificare la regione di interesse (vaso sanguigno) e misurare l&#39;area limitata alla soglia e la regione di interesse. Confronta adesione batterica, espresso in zona fluorescenti utilizzando qualsiasi software statistico o grafica. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-thrombotic+therapy+in+infective+endocarditis.">Anti-thrombotic therapy in infective endocarditis.</a> Expert Rev Cardiovasc Ther. 9 (9), 1203-1219 (2011).</li><li>Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-binding+proteins+and+clumping+factor+A+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis:+FnBPA+is+sufficient+to+activate+human+endothelial+cells.">Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells.</a> Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).</li><li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultralarge+von+Willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress.">Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).</li><li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall+under+flow+is+mediated+by+von+Willebrand+factor&#8211;binding+protein.">Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor&#8211;binding protein.</a> Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).</li><li>Thiene, G., Basso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+pathogenesis+of+infective+endocarditis+in+native+heart+valves.">Pathology and pathogenesis of infective endocarditis in native heart valves.</a> Cardiovasc Pathol. 15 (5), 256-263 (2006).</li><li>Sixma, J. J., Schiphorst, M. E., Verweij, C. L., Pannekoek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+deletion+of+the+A1+domain+of+von+Willebrand+factor+on+its+binding+to+heparin,+collagen+and+platelets+in+the+presence+of+ristocetin.">Effect of deletion of the A1 domain of von Willebrand factor on its binding to heparin, collagen and platelets in the presence of ristocetin.</a> Eur J Biochem/FEBS. 196 (2), 369-375 (1991).</li><li>Theilmeier, G., Lenaerts, T., Remacle, C., Collen, D., Vermylen, J., Hoylaerts, M. 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A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Kr&#246;tz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+cyclooxygenase-2+enhances+platelet+adhesion+in+hamster+arterioles+in+vivo.">Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo.</a> Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).</li><li>Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+heterotypic+platelet-neutrophil+interactions+on+the+activated+endothelium+during+vascular+inflammation+and+thrombus+formation+in+live+mice.">Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice.</a> J Vis Exp. 2 (74), (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Lo stress Shear è un fattore cruciale per l&#39;adesione batterica presto alla parete del vaso e per la successiva generazione di endovascolare o vegetazioni endocardial e infezioni metastatiche 4,5. Abbiamo descritto complementari in vitro e in vivo per studiare la patogenesi delle infezioni endovascolari sotto sforzo di taglio fisiologico. Questi modelli hanno permesso di individuare von Willebrand factor-binding protein (vWbp) come la principale S. proteine ​​aureus di interagire in corrente con una parete vascolare lesa esporre VWF 4. Infezioni endovascolari e endocardite infettiva in particolare, sono fonte di preoccupazione non solo per insufficienza d&#39;organo indotta dalla sepsi e la morte, ma anche a causa della (&quot;metastatico&quot;) complicanze locali e distanti. Per causare endocardite infettiva e infezioni metastatiche, i batteri devono aderire alla parete del vaso e resistere alla sollecitazione di taglio del sangue che scorre così. Piùstudi sui batteri fattori di virulenza sono stati eseguiti in condizioni statiche. Tuttavia, queste interazioni stabiliti non potrebbero sopportare le forze di taglio e gli studi in condizioni di flusso può rivelare nuovi fattori precedentemente non riconosciute in gioco batteri-ospite. Utilizzando la camera di flusso micro-parallelo, noi e altri hanno mostrato l&#39;importanza di VWF per l&#39;adesione vascolare. Sotto sforzo di taglio, VWF progressivamente dispiega dalla sua struttura globulare di riposo, ed espone il dominio A1 che interagisce con le piastrine attraverso il suo recettore GPIb 6. Camere di flusso sono stati ampiamente utilizzati per studiare la funzione piastrinica 7. Sorprendentemente, anche S. aureus adesione sotto flusso richiede VWF, in particolare dominio A1 che è esposto sul taglio. Abbiamo identificato vWbp per mediare VWF vincolante. vWbp è un coagulasi che contribuisce ad S. aureus fisiopatologia attivando protrombina del padrone di casa. Staphylothrombin, la resulting complesso di un coagulasi batterica e protrombina, converte il fibrinogeno in fibrina insolubile 8,9. I nostri studi hanno dimostrato che vWbp non solo attiva protrombina, ma innesca la formazione di aggregati batteri fibrina-piastrine, che esaltano l&#39;adesione di vasi sanguigni sotto flusso 4,10,11. Il flusso modello di camera in vitro permette di studiare i diversi attori in adesione batterica di componenti cellulari e della matrice. Fattori di virulenza batterici possono essere studiati utilizzando mutanti o batteri innocui che esprimono proteine ​​di superficie specifici. In alternativa, inibitori farmacologici o anticorpi bloccanti possono essere aggiunti al mezzo nella camera di flusso. Il ruolo dei fattori dell&#39;ospite, come diversi elementi costitutivi del matrice extracellulare può essere studiato utilizzando coprioggetto con diversi rivestimenti. I vetrini possono essere coperti con le cellule endoteliali, di cui lo stato di attivazione può essere modulata con l&#39;aggiunta di stimolatori specifici. Apart dalla parete vascolare, il contributo delle cellule del sangue dell&#39;ospite e proteine ​​del plasma può essere studiata aggiungendo questi fattori per mezzo fluente. Così, differenti condizioni di crescente complessità possono essere studiati in condizioni standardizzate di flusso laminare per svelare le interazioni che permettono ai batteri di aderire alla parete del vaso in vivo. Interazioni individuate nel modello in vitro sono poi studiati in un modello animale per testare la loro rilevanza in un organismo complesso. Altri modelli in vivo per studiare interazioni dinamiche sotto flusso sono stati descritti, ad esempio la camera di criceto dorsale plica 12 e il modello cremastere 13. In confronto, il modello perfusione mesenterica qui descritto presenta diversi vantaggi per la sua facilità di utilizzo, la possibilità di variare ospitare background genetico dei topi e per valutare interventi farmacologici. In conclusione, i modelli descrittioffrire la possibilità di studiare proteine ​​di superficie, non solo di S. aureus, ma di molti altri microrganismi in diversi ambiti di accoglienza, per comprendere meglio la patogenesi delle infezioni vascolari.

To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1. 
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood. 
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest. 
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4. 
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="border-collapse:
 collapse;width:192pt">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI)</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM0129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td>D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21878-25MG-F</td>
			<td>fluorescent labeling&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Roch</td>
			<td colspan="2">10 735 086 001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>PL 15036/0010</td>
			<td>VWF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horm collagen</td>
			<td>Takeda</td>
			<td align="right">10500</td>
			<td>collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well PCA cell culture chambers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td align="center" class="xl63">########</td>
			<td>plastic slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td align="right">283716</td>
			<td>bruprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum))</td>
			<td>Eurovet</td>
			<td>BE-V136516</td>
			<td>ketamin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine))</td>
			<td>VMD Arendonk</td>
			<td>BE-V170581</td>
			<td>xylazine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 french intravenous catheter green</td>
			<td>Portex</td>
			<td colspan="2">200/300/010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,9% Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>W7124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton swabs</td>
			<td>International Medical Product</td>
			<td align="right">300230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+-ionophore solution A23187</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">C7522-10 MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160;&#160;</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160; with needle</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300015</td>
			<td>intra-peritoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810-R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td colspan="2">5811 000.320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips (24x50)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BB02405A11</td>
			<td>Thickness No, 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD 2000 Infusion</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td align="right">702100</td>
			<td>High-accuracy Harvard infusion pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio-observer DI</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td colspan="2">National Institute of Health</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5,0</td>
			<td colspan="2">Graphpad Software</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam MRm</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss&#160;</td>
			<td>Black and white camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo model to study bacterial adhesion to the vessel wall under flow conditions

Per causare infezioni endovascolari, endocardite infettiva, batteri devono essere in grado di aderire alla parete del vaso mentre viene esposta alla sollecitazione di taglio del flusso sanguigno. Per identificare i fattori batterici e di accoglienza che contribuiscono alla adesione vascolare di microrganismi, sono necessari modelli appropriati che studiano queste interazioni in condizioni fisiologiche di taglio. Qui, descriviamo un modello vitro camera di flusso che permette di indagare adesione batterica alle diverse componenti della matrice extracellulare o alle cellule endoteliali, e un modello di microscopia intravitale che è stato sviluppato di visualizzare direttamente l&#39;adesione iniziale dei batteri alla circolazione splancnica in vivo . Questi metodi possono essere utilizzati per identificare i fattori batterici e host richiesto per l&#39;adesione dei batteri sotto flusso. Illustriamo la rilevanza di sforzo di taglio e il ruolo del fattore di von Willebrand per l&#39;adesione di Staphylococcus aureus utilizzando sia in vitro e in modelli in vivo.

S. aureus adesione alla VWF, matrice subendoteliale e cellule endoteliali è un fenomeno dipendente sforzo di taglio Per sottolineare il ruolo dello stress di taglio nell&#39;interazione tra S. aureus e VWF, abbiamo eseguito perfusioni oltre VWF vetrini rivestiti a differenti velocità di taglio (una visione schematica del modello di perfusione in vitro è dato in Figura 1. Adesione di S. aureus per VWF aumentato con l&#39;aumento dei tassi di taglio da 250 sec -1 a 2.000 sec -1 (Figura 2), indicando che elevate forze di taglio non inibiscono ma rinforzano l&#39;adesione dei batteri alle VWF. Per investigare il contributo di VWF per adesione batterica al collagene, il componente principale della matrice subendoteliale, abbiamo perfuso fluorescente S. aureus sopra collagene in presenza o assenza di VWF. In assenza di VWF, adesione di S. unureo al collagene è diminuita con l&#39;aumentare i tassi di taglio. Tuttavia, quando VWF era presente nel mezzo, l&#39;adesione di S. aureus aumentava con l&#39;aumentare shear rate (Figura 3). Il modello di flusso in vitro ci permette anche di valutare l&#39;adesione dei batteri alle cellule endoteliali sotto flusso. Abbiamo perfuso HUVECs con fluorescente S. aureus a velocità di taglio da 500 a 2.000 sec -1. Dove indicato, HUVECs sono stati attivati ​​con un Ca 2+ -ionophore, a causare il rilascio di VWF. Attivazione delle cellule endoteliali e del successivo rilascio VWF, maggiore adesione di S. aureus (Figura 4A), che costituiva schemi tipici &quot;stringa-like&quot; di fluorescente cluster batteriche allineati nella direzione della forza di taglio (Figura 4B), suggerendo il legame di batteri lungo una VWF molecola lineare allungata. Iniziale in vivoadesione batterica nelle vene splancnico è mediato da VWF Da S. aureus è in grado di aderire a VWF, abbiamo utilizzato topi di tipo selvatico (VWF + / +) e VWF topi con deficit (VWF - / -) per indagare adesione batterica alla parete del vaso attivata in vivo. In tempo reale videomicroscopia delle vene splancnici permesso la visualizzazione in vivo di far circolare fluorescente S. aureus (Schema del modello in vivo perfusione è rappresentato in figura 5). Dopo l&#39;attivazione farmacologica dell&#39;endotelio dal Ca 2+ -ionophore, abbiamo osservato rapido accumulo locale dei singoli batteri e aggregati di batteri alla parete del vaso di topi WT (supplementare Video 1 e 2). Quasi nessuna adesione dei batteri è stato osservato sulla parete del vaso attivato di vWF -deficient topi (supplementare Video 3) rispetto ad adesione in topi WT (Figura 6). L&#39;assenza di VWF diminuisce la capacità di S. aureus di aderire alla parete del vaso attivato. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" /> Figura 1. Una rappresentazione schematica del modello di flusso in vitro. Il modello di flusso in vitro è un modello multifunzionale, che consente lo studio di diversi meccanismi dipendenti taglio come adesione batterica alla matrice sottoendoteliale ma anche la formazione di trombi. La camera di flusso micro-parallelo è posto su un vetrino (plastica o vetro) con differenti rivestimenti di proteine ​​e cellule endoteliali. L&#39;adesione dei batteri diversi (arancione e punti grigi) possono essere analizzati, e l&#39;impatto della presenza di proteine ​​plasmatiche, piastrine e sangue intero può essere valutato. Marcatori fluorescenti per piastrine (ovali blu) o fibrinogit (stringhe blu) può essere utilizzato in combinazione con diversi inibitori (ovali neri) di distinguere fattori batterici e di accoglienza. Immagini rappresentative della adesione batterica di S. aureus a rivestimento di collagene in presenza (in basso) o assenza (superiore) del VWF sono mostrati (barra della scala è di 100 micron). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" /> Figura 2. Adesione di S. aureus di VWF aumenta con l&#39;aumentare i tassi di taglio. Micro-parallelo perfusione camera di flusso su patinata VWF (50 mg / ml) con fluorescente S. aureus Newman a velocità di taglio di 250 a 2000 sec -1 (sec -1) a medio (n&gt; 5). Tutti i risultati sono espressi come media ± SEM. * P &lt;0.05, ** p &lt;0,01. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" /> Figura 3. Adesione di S. aureus a subendothelium è taglio e VWF dipendente. Micro-parallelo perfusione camera di flusso su collagene rivestito (160 mg / ml) con fluorescente S. aureus Newman a velocità di taglio di 250 a 2000 sec -1 in media (n&gt; 5). VWF (60 ug / ml) era presente nel mezzo di dove indicato. Tutti i risultati sono espressi come media ± SEM. ** P &lt;0.01. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" /> Figura 4. Adesione di S. aureus alle cellule endoteliali attivate è taglio dipendente. Micro-parallelo perfusione camera di flusso su cellule endoteliali. (A) cellule endoteliali umane della vena ombelicale sono state attivate con l&#39;Università Ca 2+ -ionophore A23187 (0.1 mM) seguito da 10 minuti di perfusione fluorescente S. aureus Newman a velocità di taglio di 500 a 2000 sec -1 in media (n&gt; 5). Tutti i risultati sono espressi come media ± SEM. * P &lt;0,05. (B) L&#39;immagine di micro-parallelo perfusione camera di flusso su HUVECs attivati ​​con S. aureus ad una velocità di taglio di 1.000 sec -2. S. aureus forma stringhe di ± 200 micron di lunghezza, il che suggerisce l&#39;adesione di multimeri VWF (barra della scala è di 100 micron). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" /> Figura 5. Una panoramica schematica del modello di perfusione mesenterica in vivo. Un catetere giugulare destra (linea gialla) è inserito per la somministrazione di fluorobatteri escently etichettati (punti arancione), anestetici aggiuntivi o di altri componenti come gli inibitori farmaceutiche e gli anticorpi. La cavità peritoneale è aperta e il mesentere si sviluppa per visualizzare i vasi sanguigni (arteriosi e venosi) sotto un microscopio a fluorescenza. Dopo l&#39;attivazione farmacologica dell&#39;endotelio da Ca 2+ -ionophore, che induce il rilascio di VWF, batteri possono essere iniettati attraverso il catetere vena giugulare. In tempo reale video microscopia intravascolare permette di visualizzare in vivo di circolante batteri fluorescente e la conseguente formazione di batteri-piastrinici trombi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" /> Figura 6. L&#39;adesione iniziale di S. aureusdi endotelio attivato in vivo è mediata da VWF In vivo venosa mesenterica modello perfusione con C57BL / 6- VWF + / + e C57BL / 6- FvW -. / - mice. Adesione di fluorescente S. aureus alla parete del vaso localmente attivato è significativamente più bassa in VWF - / - mice. Tutti i risultati sono espressi come media ± SEM. *** P &lt;0,001, n&gt; 7. <img alt="Video Figura 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" /> Video 1: in tempo reale adesione di S. aureus a parete dei vasi attivato al VWF + / + topo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">Cliccate qui per vedere il video.</a> Video 2: la formazione di aggregati in tempo reale e embolizzazione di S. aureus in VWF + / + topo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere il video.</a> <img alt="Video Figura 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" /> Video 3: tempo reale adesione di S. aureus a parete dei vasi attivato al VWF - / -. topi in vivo modello perfusione mesenterica con VWF + / + e VWF - / - mice. Cinque microlitri di Ca 2+ -ionophore (10 mM) è stato applied alla regione del letto vascolare visualizzato. Una sospensione di carbossi-fluoresceina S. aureus è stato iniettato attraverso il catetere giugulare. La circolazione mesenterica è stato visualizzato sotto un microscopio invertito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere il video.</a>

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In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro e in vivo modello per studiare l&#39;adesione batterica alla parete del serbatoio in condizioni di flusso

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

10.5K Views.  KU Leuven. To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion. 

Video: In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host cells1. These adhesins rely on interactions with host cell surface receptors or soluble proteins acting as a bridge between bacteria and host. Adhesion is a critical first step prior to invasion and/or secretion of toxins, thus it is a key event to be studied in bacterial pathogenesis. Furthermore, adhered bacteria often induce exquisitely fine-tuned cellular responses, the studies of which have given birth to the field of 'cellular microbiology'2. Robust assays for bacterial adhesion on host cells and their invasion therefore play key roles in bacterial pathogenesis studies and have long been used in many pioneer laboratories3,4. These assays are now practiced by most laboratories working on bacterial pathogenesis.
Here, we describe a standard adherence assay illustrating the contribution of a specific adhesin. We use the Escherichia coli strain 27875, a human pathogenic strain expressing the autotransporter Adhesin Involved in Diffuse Adherence (AIDA). As a control, we use a mutant strain lacking the aidA gene, 2787&Delta;aidA (F. Berthiaume and M. Mourez, unpublished), and a commercial laboratory strain of E. coli, C600 (New England Biolabs). The bacteria are left to adhere to the cells from the commonly used HEp-2 human epithelial cell line. This assay has been less extensively described before6.

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

This protocol is a simple bacterial adhesion assay consisting in counting the numbers of bacterial colony forming units that are adhered onto cultured cells. The assay is robust, independent of the adhesin studied, and numerous variations are used in most laboratories working on bacterial pathogenesis.

In vitro di Adesione batterica su mammiferi cellule epiteliali

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

Uso di un terreno dell&#39;espettorato artificiale per testare l&#39;efficacia degli antibiotici contro<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; In condizioni più rilevanti al polmone Fibrosi Cistica

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolamento di cellule umane endoteliali della vena ombelicale e il loro uso nello studio della trasmigrazione dei neutrofili in condizioni di flusso

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modello per studiare eterogeneità di differenziazione dei macrofagi umani e polarizzazione

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In vitro</em&gt; Assay misurare Adesione neutrofili attivati ​​per primarie umane endoteliali microvascolari in condizioni statiche

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood vessels resulting in vascular leak, the development of purpuric rashes and eventual tissue necrosis. Studying the pathogenesis of this infection was previously limited by the human specificity of the bacteria, which makes in vivo models difficult. In this protocol, we describe a humanized model for this infection in which human skin, containing dermal microvessels, is grafted onto immunocompromised mice. These vessels anastomose with the mouse circulation while maintaining their human characteristics. Once introduced into this model, N. meningitidis adhere exclusively to the human vessels, resulting in extensive vascular damage, inflammation and in some cases the development of purpuric rash. This protocol describes the grafting, infection and evaluation steps of this model in the context of N. meningitidis infection. The technique may be applied to numerous human specific pathogens that infect the blood stream.

Neisseria meningitidis is a human specific pathogen that infects blood vessels. In this protocol human microvessels are introduced into a mouse by grafting human skin onto immunocompromised mice. Bacteria adhere extensively to the human vessels, leading to vascular damage and development of the purpuric rash typically observed in human cases.

Umanizzato mouse modello per studiare le infezioni batteriche Targeting il microcircolo

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

Un flusso di Adesione saggio per studiare Leucocyte reclutamento a epatici umani sinusoidali Endotelio in condizioni di stress Shear

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Saggio di adesione Sotto Shear stress per lo studio di linfociti T-Adhesion Molecule Interazioni

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Assays for Studying the Role of Vitronectin in Bacterial Adhesion and Serum Resistance

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin acquisition at the bacterial cell surface plays in resistance to the host immune system. Flow cytometry experiments identified human plasma vitronectin as a ligand for the bacterial receptor outer membrane protein H of Haemophilus influenzae type f. An enzyme-linked immunosorbent assay was employed to characterize the protein-protein interactions between purified recombinant protein H and vitronectin, and binding affinity was assessed using bio-layer interferometry. The biological importance of the binding of vitronectin to protein H at the bacterial cell surface in evasion of the host immune response was confirmed using a serum resistance assay with normal and vitronectin-depleted human serum. The importance of vitronectin in bacterial adherence was analyzed using glass slides with and without vitronectin coating, followed by Gram staining. Finally, bacterial adhesion to human alveolar epithelial cell monolayers was investigated. The protocols described here can be easily adapted to the study of any bacterial species of interest.

This report describes protocols for characterizing interactions between bacterial outer membrane proteins and the human complement regulator vitronectin. The protocols can be used to study the binding reactions and biological function of vitronectin in any bacterial species.

Saggi per studiare il ruolo di Vitronectin nell'adesione batterica e sulla resistenza del siero

Bacteria utilize complement regulators as a means of evading the host immune response. Here, we describe protocols for evaluating the role vitronectin ...