Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del laboratorio Dumenil, in particolare Silke Silva per la lettura critica del manoscritto. Il reparto di chirurgia Hôpital européen Georges-Pompidou (HEGP) Dr. David Maladry. Michael Hivelin e il Dr. Patrick Bruneval, Dipartimento di Patologia presso HEGP. L&#39;impianto degli animali a PARCC, guidato da Elizabeth Huc. Questo lavoro è stato supportato dalle seguenti agenzie di sovvenzione Marie Curie IEF comunione no. 273.223 (KM), ATIP-Avenir sovvenzione da INSERM, attrezzature CODDIM concessione (Ile de France Region), FRM (Fondation pour la recherche médicale) concessione attrezzature, il Laboratorio IBEID di eccellenza consorzio, ANR (Agence Nationale pour la Recherche) concessione &quot; Bugs-in-flow &quot;. I finanziatori hanno avuto alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l&#39;analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto.

1. Rischi e autorizzazioni <ol><li> Comitati etici locali devono approvare tutti i protocolli di animali. Questo protocollo è stato condotto in conformità con le linee guida stabilite dalle normative francesi ed europee per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio (Decreti 87-848, 2001-464, 2001-486 e 2001-131 e Direttiva Europea 2010/63/UE) e approvato dal comitato etico locale Comité d&#39;Ethique en matière d&#39;Expérimentation Animale, Université Paris Descartes, Parigi, Francia. No: CEEA34.GD.002.11. </li><li> Per la pelle umana, scritta il consenso del paziente informato è stato ottenuto e sono state eseguite tutte le procedure secondo le linee guida nazionali francesi e approvato dal comitato etico locale, Comité d&#39;Evaluation Ethique de l&#39;INSERM IRB 00003888 00005881 FWA, Parigi, Francia Opinione: 11-048 . </li><li> N. meningitidis è un agente patogeno umano potenzialmente dannosi e tutte le necessarie precauzioni devono essere prese quando si maneggia l&#39;orgasmo. Queste precauzioni includono vaccinazione e di lavoro sotto il livello di biosicurezza 2 condizioni. </li></ol> 2. Skin Graft <ol><li> Raccogliere pelle umana più vicino al tempo di innesto possibile. La maggior parte di pelle in questo lavoro ad operazioni di chirurgia plastica che interessano la zona addominale. Altre fonti come il seno, gambe e anche il viso sono stati usati con successo. </li><li> Preparare il campione di pelle umana pulendo la superficie della pelle con il 70% EtOH, che giace in piano su una superficie di ben puliti, preferibilmente sotto una cappa a flusso. </li><li> Tagliare 200-400 micron fette dalla parte superiore della pelle utilizzando un dermatome con spessore prestabilito. </li><li> Controllare le fette di pelle per l&#39;integrità e tagliatele in 2 cm x 2 centimetri quadrati, quindi collocare in PBS (senza cationi bivalenti) se l&#39;innesto immediatamente oppure a 4 ° C in DMEM con siero del 10% per la conservazione a breve termine (3-12 h ). </li><li> Anestetizzare 6-8 settimane di età topi SCID.bg (circa 20 g) con ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) injeCTED ip </li><li> Una volta che i topi vengono anestetizzati, verificare la risposta al dolore eseguendo un pizzico punta, un metodo standard per stabilire il dolore riflesso. Applicare il gel per gli occhi contro l&#39;essiccamento della cornea e radere lato sinistro dell&#39;animale dietro la spalla, dove verrà posizionato l&#39;innesto. Tenere il caldo mouse su un tappetino di calore durante tutta la procedura. </li><li> Dopo preparando il mouse per la chirurgia, pulire la zona rasata con il 70% EtOH. </li><li> Applicare anestetico locale topicamente al sito dell&#39;innesto (Tronothane) e preparare il sito dell&#39;innesto rimuovendo accuratamente lo strato superficiale della pelle di topo con un paio di forbici curve. Fare attenzione a non disturbare il sistema vascolare sottostante. </li><li> Rimuovere la pelle in una zona un po &#39;più piccola dell&#39;area della fetta pelle umana. </li><li> Rimuovere fetta pelle dalla PBS (o DMEM) e posizionare sul banco innesto, assicurando il lato epidermico è rivolto verso l&#39;alto. Passi 2,8-2,10 deve essere eseguita il più rapidamente possibile, assicurando il letto innesto non si asciughi. </li><li> Allineare un angoloo il bordo e fissare con la colla del tessuto. Montare accuratamente il resto della fetta pelle al letto innesto, ponendo piccole quantità di colla tessuto intorno ai bordi. Tagliare sempre la pelle umana per dimensioni, piuttosto che fare il letto più grande innesto. </li><li> Non tirare la pelle troppo stretto sopra il letto innesto come la pelle del mouse è molto flessibile. </li><li> Assicurarsi che l&#39;innesto è fissato con colla tessuto in ogni angolo. </li><li> Pulire l&#39;area con una soluzione di iodio. </li><li> Applicare un cerotto con l&#39;area cuscino sopra l&#39;innesto. Assicurarsi che il Band-Aid è ferma, ma non stretto e che la respirazione dell&#39;animale non è interessato. </li><li> Fissare il Band-Aid con nastro spogliatoio. </li><li> Lasciare che l&#39;animale di recuperare su una superficie calda. </li><li> Una volta sveglio, rispedire l&#39;animale verso la sua gabbia. Gli animali sono alloggiati 2-3 per gabbia. </li><li> Controllare i topi regolarmente durante il recupero per i segni di dolore o disagio. 10-14 giorni dopo il trapianto, rimuovere il cerotto, facendo attenzione a non disturbare l&#39;innesto. Nella nostra esperienza il dolore postoperatorio è minimal. Tuttavia gli animali devono essere monitorati ogni giorno, in particolare nei giorni seguenti operazioni. Criteri per il dolore o disagio sono i seguenti. <ul><li> Perdita di peso oltre il 10% </li><li> Aspetto fisico, la pelliccia, la posizione gobbo, occhi </li><li> L&#39;aumento dei tassi di respirazione o di cuore </li><li> Diminuzione dei movimenti o inusuali. </li><li> Aumento della temperatura corporea </li><li> Paracetamole In caso vengono rilevati segni di dolore viene somministrato per via orale (300 mg / kg, ogni 4 ore). Punti finali umanitari sono rigorosamente rispettati se il dolore persiste. </li></ul></li><li> Se l&#39;innesto sembra asciutto applicare l&#39;olio di bambino ogni 2-3 giorni per mantenere la pelle elastica. </li><li> L&#39;innesto è pronto per la sperimentazione 21 giorni dopo trapianto. </li></ol> 3. Infezione <ol><li> Il giorno prima dell&#39;infezione, preparare ceppo batterico strisciando su piastre di agar GCB con antibiotici appropriati. Crescere notte a 37 ° C in 5% di CO 2. </li><li> Preparazione Batteri <ol&gt; <li> Batteri Reinoculate in 5 ml di SFM supporti endotelio umano con il 10% di siero di un OD 600 0.05. </li><li> Incubare sotto agitazione per 2 ore in incubatore (37 ° C in 5% CO 2) con coperchio allentato, finché una densità batterica di circa 0,1 OD 600. </li><li> Centrifugare i batteri per 3 min 15.000 rpm. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere in PBS, centrifugare di nuovo. </li><li> Ripetere la fase di lavaggio (2.2.4-2.2.5) due volte. </li><li> Risospendere pellet batterico in PBS. </li><li> Misurare OD 600. </li><li> Effettuare una cultura di una OD 600 0,1 (10 8 UFC / ml), o OD 600 1,0 (10 9 CFU / ml). Da questa concentrazione nota, diluire a 10 7 UFC / ml. Provate a preparare i batteri più vicino al tempo di iniezione possibile. </li></ol></li><li> Mice <ol><li> Pesare topi. </li><li> Anestetizzare topi con ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) iniettato ip </li><li> Una volta addormentato, cdiamine che la risposta al dolore è assente da un dito del piede-pinch, tenere i topi caldo con un pad termico e mettere unguento occhio su per evitare l&#39;essiccazione. </li><li> Dare ogni mouse 8 mg di transferrina umana, risospese in soluzione fisiologica o PBS, iniettato ip </li><li> Prendete una piccola goccia di sangue dalla coda e diffondere su una piastra di agar per controllare il sangue è sterile prima dell&#39;infezione. </li><li> Iniettare 100 ml 10 7 UFC / ml coltura batterica (10 6 CFU totali) per via endovenosa attraverso la vena retro-orbitale o la coda. Le misurazioni di CFU prese 5 minuti dopo l&#39;iniezione sono coerenti indipendentemente dalla sede di iniezione. </li><li> Dopo pochi minuti, tagliare la coda e diffondere campione di sangue su piastre di agar con antibiotici appropriati con una diluizione di 10 volte per stabilire CFU sangue subito dopo l&#39;infezione. </li><li> Sigillare la coda con la colla del tessuto. </li><li> Dopo l&#39;iniezione, diluire l&#39;inoculo batterico e la diffusione su piastre di agar con antibiotici appropriati per stabilire CFU. </li><li> Lasciare il mouseper recuperare su un tappetino di calore fino a quando sono e in movimento </li><li> Al 6 ore dopo l&#39;infezione disegnare una piccola quantità di sangue dalla coda, diluire e la piastra di stabilire CFU alle 6 ore. </li><li> Incubare tutte le piastre di agar a 37 ° C in 5% di CO 2 durante la notte. </li></ol></li></ol> 4. Sacrificio <ol><li> Al tempo scelto di infezione, anestetizzare topi con ketamina (100 mg / kg) e xilazina (10 mg / kg) iniettato ip </li><li> Una volta addormentato, mantenere caldo il mouse con un pad termico. </li><li> Quando il riflesso del dolore è andato (toe-pinch), snip fine della coda e disegnare il sangue. </li><li> Stendere sangue su piastre di agar con antibiotici appropriati; 1:10 5 microlitri diretta e 10 microlitri per stabilire CFU. </li><li> Sacrifica il mouse per dislocazione cervicale. </li><li> Dopo aver sacrificato il mouse secondo tutte le linee guida istituzionali e principi etici applicabili, confermare la morte per mancanza di battito cardiaco. Effettuare una incisione mediana, tagliare gabbia toracica, e fare un&#39;incisione nel sentiret. </li><li> Raccogliere quanto più sangue possibile dal cuore / cavità toracica e posto in una provetta sterile. </li><li> Rimuovere organi (ad esempio il fegato, la milza, cervello) in una piastra sterile. </li><li> Rimuovere l&#39;innesto di pelle e una sezione di pelle di topo nella piastra sterile. </li><li> Smaltire il corpo del mouse. </li><li> Dopo che il sangue raccolto è stato permesso di coagulare per 15 minuti, centrifugare è 15 min a 3.000 giri. </li><li> Rimuovere il plasma dal sangue e conservare a -80 ° C per analisi successive, ad esempio per il rilevamento di citochine con metodi ELISA o FACS base. </li></ol> 5. Conti Organ CFU <ol><li> Pesare omogeneizzazione provette contenenti 500 ml di PBS prima di ogni prelievo di campioni bioptici. </li><li> Prendere 4 millimetri campioni bioptici di ogni tessuto utilizzando un biopsia sterile. </li><li> Luogo biopsie in provette omogeneizzazione pre-pesate contenenti 500 microlitri di PBS. Omogeneizzare campioni di pelle con 2 mm perle, perline di utilizzare più piccole per altri organi. </li><li> Posizionare il restante tproblemi in 4% paraformaldeide (PFA) e conservare a 4 ° C per microscopia (vedi sotto). </li><li> Pesare omogeneizzazione provette contenenti le biopsie per stabilire il peso biopsia (per rivederlo calcolo dei CFU / tessuto mg). </li><li> Omogeneizzare campioni. <ol><li> Omogeneizzare fegato, milza e cervello, a 6.000 rpm per 30 sec. </li><li> Omogeneizzare campioni di pelle a 6.000 rpm per 30 secondi e ripetere se necessario. </li></ol></li><li> Stendere diluizioni da ciascuna provetta omogeneizzazione su piastre di agar e far crescere la notte a 37 ° C in 5% di CO 2 per stabilire organo conta CFU. </li></ol> 6. Istologia / Immunoistochimica <ol><li> Fissazione <ol><li> Fissare i tessuti in 4% PFA notte a 4 ° C. Il passo di fissaggio può essere più lungo, se l&#39;archiviazione per periodi più lunghi collocare i tessuti a 0,25% PFA. </li><li> Risciacquare i tessuti in PBS e poi posto in una soluzione di saccarosio al 20% e ritorno a 4 ° C durante la notte o fino a quando i tessuti sono affondate nella soluzione. </li><li> Lavare i tessuti in PBS, tagliati a misura e posto in soluzione Ottobre (sia in uno stampo tessuto o aderito a una scheda di base). </li><li> Congelare rapidamente i tessuti su un piatto Petri galleggianti in azoto liquido. </li><li> Dopo il congelamento, mettere i tessuti su ghiaccio secco prima del trasferimento a -80 ° C per una conservazione. </li></ol></li><li> Affettare <ol><li> Rimuovere tessuti da -80 ° C e lasciare equilibrare a -20 ° C in un criostato. </li><li> Tessuti fetta con uno spessore di circa 10-15 micron e mettono su vetrini al microscopio rivestiti. </li><li> Conservare scivola a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Colorazione <ol><li> Lasciare i vetrini a temperatura ambiente. </li><li> Disegnare intorno la fetta sul vetrino con una penna idrofobo. Attendere 5-10 min. </li><li> Reidratare / fetta di lavaggio in PBS per 5 minuti, ripetere due volte. </li><li> Permeabilize fetta in 0,1% Triton in PBS per 10 min. </li><li> Lavare in PBS 2-3x per 5 min. </li><li> Blocco in PBS0.1% Triton 1% BSA per tra 10-60 min a seconda dell&#39;anticorpo o macchia da utilizzare. </li><li> Rimuovere il tampone bloccante ed aggiungere anticorpo primario diluito come richiesto buffer di blocco. Incubare per tempo determinato. (Spesso 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C). </li><li> Lavare in PBS 2-3x per 5 min. </li><li> Applicare anticorpo secondario diluito in modo appropriato nel buffer di bock; DAPI è tipicamente incluso in questa fase. Incubare per il tempo determinato, spesso 1-2 ore a temperatura ambiente, al buio. </li><li> Lavare in PBS 2-3x per 5 min. </li><li> Montare in dissolvenza tutela mezzi di montaggio con un vetro di copertura e sigillare con smalto. </li><li> Immagine vetrini colorati immediatamente o conservare a 4 ° C. </li><li> Eseguire l&#39;imaging con un microscopio confocale a fluorescenza o impostato con filtri / laser appropriate per fluorofori utilizzati. </li></ol></li><li> Istologia <ol><li> Consentire diapositive da utilizzare per istologia raggiunga la temperatura ambiente. </li><li> Diapositive Stain utilizzando comeprotocollo di colorazione tandard ematossilina / eosina. <ol><li> Porre i vetrini in cremagliera diapositiva. </li><li> Trasferire rack con scivoli tra le soluzioni nel seguente ordine: </li><li> 2 sec in acqua corrente. </li><li> 3 min in soluzione ematossilina filtrata. </li><li> 10 sec in acqua corrente. </li><li> 10 sec in acqua distillata. </li><li> 10 sec in etanolo al 100%. </li><li> 2 sec in eosina filtrato. </li><li> 10 sec in acqua corrente. </li><li> 10 sec in etanolo al 100% </li><li> 2 min in xilene x 3 (bagno I, II, III). </li><li> Trasferire immediatamente e aggiungere qualche goccia di colla fissazione su ogni slide, luogo copertura antiscivolo sulla parte superiore, rimuovere le bolle d&#39;aria, lasciare asciugare per qualche ora. </li><li> Immagine scivola sotto un microscopio a luce bianca standard. </li></ol></li></ol></li></ol>

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Gli autori dichiarano interessi finanziari concorrenti.

I modelli animali sono di fondamentale importanza per la ricerca patogenesi batterica. È impossibile simulare appieno l&#39;ambiente in vivo in coltura cellulare e sta diventando evidente che l&#39;interazione ospite-patogeno è influenzata da molti fattori dinamici. La specificità umana di patogeni clinicamente importanti, come N. meningitidis, HIV, HCV, Plasmodium falciparum, Listeria monocytogenes e Salmonella typhi ha limitato l&#39;uso di modelli in vivo per queste infezioni. Tuttavia, come si comincia a capire quali passi infettive sono coinvolti nella specificità, si stanno sviluppando modelli umanizzati. Il protocollo qui descritto è una dimostrazione di questo con l&#39;introduzione di microvasi umani in topi, consentendo ampio in vivo infezione con N. meningitidis, con conseguente danno vascolare e, occasionalmente, lo sviluppo di eruzioni cutanee purpuriche. Utilizzando questo modello,siamo stati in grado di definire che le proprietà adesive della PTF sono coinvolti nella colonizzazione vascolare in vivo utilizzando mutanti batterici e che il danno vascolare è ridotto in assenza di adesione 18. In precedenza, circolanti prodotti batterici sono stati implicati in questo danno ma i nostri risultati suggeriscono un ruolo decisivo per l&#39;adesione locale e colonizzazione vascolare. Questo apre nuove possibilità per lo sviluppo di obiettivi di trattamento romanzo. Se l&#39;adesione dei batteri patogeni potrebbe essere bloccato farmacologicamente si potrebbe prevenire lo sviluppo di lesioni cutanee e portare a risultati migliori per i sopravvissuti meningococco in termini di necrosi dei tessuti, sbrigliamento e amputazioni. Il lavoro ha anche dimostrato la complessità dell&#39;infezione e il coinvolgimento della risposta immunitaria e cascata coagulativa. Abbiamo identificato segnalazione citochina umana nel siero di topi infettati nonostante la relativamente piccola quantità di endotelio umana contemporanea 18.Ciò ha indicato una significativa risposta citochina, insieme con l&#39;infiltrazione di topo popolazioni di cellule immunitarie nella zona. I modelli animali possono ovviamente mai replicare completamente la malattia umana e di tutti i risultati ottenuto da loro deve essere considerato con questo in mente. Per esempio, in questo modello il sangue e cellule circolanti sono di origine murina e non possiamo sconto che può essere diverso per le cellule umane. Un vantaggio di questo però, come dimostrato nella nostra recente pubblicazione 18, è la capacità di differenziare segnalazione proveniente dalla endotelio umano da quello delle cellule di topo circolanti. Lo sfondo immunocompromessi dei topi utilizzati in questo modello potrebbe anche consentire il trasferimento genico di popolazioni di cellule immunitarie umane, aggiungendo un ulteriore &#39;umanizzazione&#39; aspetto. Lo sfondo dei topi immunocompromessi può tuttavia mascherare un ruolo per le cellule NK, T o B, che sono tutti carenti o difettose in questo modello. La relativamente Short lasso di tempo (24 ore) utilizzato in questo modello riguarda principalmente la risposta innata, ma per le infezioni a lungo termine e lo sviluppo di immunità altre opzioni può avere bisogno di essere esplorato. La pelle è un sito di infezione importante per N. meningitidis ma aventi una quantità relativamente piccola di navi umane significa anche che estrapolando i dati ad una infezione sistemica coinvolge numerosi organi è difficile. Mentre questo modello consente lo studio di sviluppo lesione cutanea, importanti fasi di infezione meningococcica come epiteliale e ematoencefalica attraversamento non sono inclusi. L&#39;ulteriore sviluppo di questi modelli umanizzati è necessaria per affrontare questi altri aspetti di infezione. Tuttavia questo modello offre un grande potenziale per numerosi patogeni specifici umani, in particolare quelli rivolti ai vasi sanguigni.

Sepsi meningococcica è un sangue nasce spesso fatale infezione causata dal batterio patogeno Neisseria meningitidis. Pazienti con sepsi meningococcica, spesso presente con un rash petecchiale o color porpora sulla loro pelle che è stato precedentemente associato a distruzione vascolare causata da batteri circolanti e prodotti batterici 1. Biopsie cutanee di pazienti clinici mostrano batteri associati con microvasi, spesso riempiendo i vasi 2. Oltre alla perdita di batteri, ampio trombosi, coagulazione, congestione e vascolare è visto nelle regioni purpuriche 3-5. Questo danno vascolare può portare alla necrosi estesa della cute e dei tessuti circostanti, con conseguente sbrigliamento e addirittura l&#39;amputazione nei sopravvissuti meningococco. Capire come infezione provoca questo danno vascolare è importante per ottimizzare le strategie di prevenzione e trattamento. La maggior parte delle ricerche sulla sepsi meningococcica è stato effettuato in vitro sulinee cellulari umane dovute alla specificità umana di N. meningitidis. Molti aspetti di infezione sono stati studiati in vitro, tra cui l&#39;adesione batterica, la risposta della cellula ospite, così come la risposta delle citochine 6-9. Pili di tipo IV (PTF) è stato implicato come il principale organello adesione per N. meningitidis su entrambe le cellule epiteliali ed endoteliali 10. Inoltre è stato dimostrato che l&#39;adesione di N. meningitidis per ospitare cellule è shear stress dipende ed è quindi pensato per essere collegato ai tassi di flusso sanguigno nel microcircolo 11. Questo suggerisce che le sollecitazioni dinamiche i batteri devono affrontare in vivo sono fondamentali per patogenesi. È tuttavia molto difficile modellare il microambiente di piccoli vasi in vitro. Il recettore di adesione per Neisseria Tfp è ancora sconosciuto e quindi strategie knock-in per conseguire adesione batterica in un modello animale non può essere concepita in questo momento. CD46 è stato suggerito di essere il recettore TFP e animali transgenici sono state prodotte per fungere da modelli murini. Tuttavia, l&#39;infezione in questi animali non porta ad infezione estesa o di rash cutanei sviluppo 12,13. Altri modelli animali che sono stati descritti per l&#39;aspetto batteriemia dell&#39;infezione Neisseria tengono conto della preferenza batterica di transferrina umana come fonte di ferro 14,15. Sia che completa transferrina umana o esprimendolo da un transgene traduce in una maggiore carica batterica nel flusso sanguigno per un periodo di tempo prolungato, ma questo modello non presenta alcun adesione batterica o sviluppo eruzione 16,17. In questo protocollo, si descrive un modello di topo umanizzato in cui la pelle umana, compreso il microcircolo cutaneo, viene trapiantato su topi immunocompromessi 18,19. Ciò si traduce in vasi umani funzionali, perfusi con la circolazione del mouse. In combinazione con la supplementazione transferrina umana, questo modello rappresenta almeno due degli aspetti specifici umani di N. meningitidis, cioè l&#39;endotelio umano e transferrina umana, in un ambiente in vivo. N. meningitidis introdotto per via endovenosa in questo modello aderisca espressamente allo endotelio umano, producendo una patologia che è simile a quanto riportato in pazienti clinici, compresi i danni vascolari e sviluppo eruzione purpurica 18.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="693">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">DMEM</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">31885-023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">10010-056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Ketamine 500</td>
			<td style="width:161px;">Virbac France&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">LOT N&#176;VAL4243</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Xylazine</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Bayer Healthcare</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">AMM N&#176; FR/8146715 2/1980</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;">LOT N&#176; KPO809S</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">(Rompun 2%)</td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:39px;width:247px;">Optigel&#160;&#160;&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Europhta</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">Medicament autoris&#233; N&#176;3400933521134</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Lacrigel&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Tronothane</td>
			<td style="width:161px;">Lisa Pharma</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="40" rowspan="2" style="height:40px;width:247px;">GC agar Base</td>
			<td rowspan="2" style="width:161px;">Conda</td>
			<td rowspan="2" style="width:119px;">1106</td>
			<td rowspan="2" style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Human endothelium SFM media</td>
			<td style="width:161px;">Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11111</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:161px;">P A A</td>
			<td style="width:119px;">A15-101</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Human transferrin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3309</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">UEA lectin - rhodamine</td>
			<td style="width:161px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">RL-1062</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Hematoxylin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H9627</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Eosin</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">E4009&#160;</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Xylene</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">534056</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;">Humeca BV, Holland</td>
			<td style="width:119px;">4.SB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;"></td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:247px;">Equiptment Name</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalogue Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Sober Hand Dermatome</td>
			<td style="width:161px;">Humeca BV, Holland</td>
			<td style="width:119px;">4.SB01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Animal housing</td>
			<td style="width:161px;">Innovive</td>
			<td style="width:119px;">M-BTM-C8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Biopsy punch (4 mm)</td>
			<td style="width:161px;">Dominic Dutscher</td>
			<td style="width:119px;">30737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Fast-Prep lysing matrix M tubes</td>
			<td style="width:161px;">MP Bio</td>
			<td style="width:119px;">116923050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MagNA Lyzer Green Beads</td>
			<td style="width:161px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3358941001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">MagNA Lyzer</td>
			<td style="width:161px;">Roche</td>
			<td style="width:119px;">3358976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vectashield mounting media</td>
			<td style="width:161px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:119px;">H-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">Vetbond</td>
			<td style="width:161px;">3M</td>
			<td style="width:119px;">1469SB</td>
			<td>Tissue Glue</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:247px;">OCT tissue tek</td>
			<td style="width:161px;">Sakura</td>
			<td style="width:119px;">4583</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

humanized mouse model to study bacterial infections targeting the microvasculature

Neisseria meningitidis causa una grave sepsi spesso fatale quando si entra nel flusso sanguigno umano. Infezione porta ad ingenti danni dei vasi sanguigni con conseguente perdita vascolare, lo sviluppo di eruzioni purpuriche ed eventuale necrosi tissutale. Studiare la patogenesi di questa infezione è stato precedentemente limitata dalla specificità umana dei batteri, il che rende difficile modelli in vivo. In questo protocollo, si descrive un modello umanizzato di questa infezione in cui la pelle umana, contenente microvasi cutanei, si innesta su topi immunocompromessi. Questi vasi anastomizzano con la circolazione del mouse pur mantenendo le loro caratteristiche umane. Una volta introdotto in questo modello, N. meningitidis aderiscono esclusivamente alle navi umane, causando gravi danni vascolari, infiammazione e in alcuni casi, lo sviluppo di rash color porpora. Questo protocollo descrive i passi innesto, infezione e valutazione di questo modello nel context di N. infezione meningitidis. La tecnica può essere applicata a numerosi agenti patogeni specifici umane che infettano il flusso sanguigno.

Conta CFU Il N. ceppo meningitidis utilizzati in questi risultati rappresentativi è N. meningitidis 8013 clone 12, un sierogruppo C isolato clinico, esprimendo una classe I SB pilin, Opa -, Opc -, PilC1 + / PilC2 + 20. Il ceppo era stato ingegnerizzato per esprimere la proteina fluorescente verde (GFP) da un inserimento cromosomica 18. Batteriche unità formanti colonie conteggi sono stabiliti contando il numero di colonie su piastre di agar e calcolando sia CFU / ml di sangue o CFU / mg di tessuto dai volumi noti placcato. Emocromo mostrato che 5 minuti dopo l&#39;iniezione iv di 10 6 CFU batteri c&#39;è stata una media di 1,5 x 10 5 CFU / ml circolante nel sangue (Figura 1A). Dopo 6 ore la conta in media 4,8 x 10 4 CFU / ml. Entro 24 ore i conteggi medi erano 2,4 x 10 4 UFC / ml, ma in questo gruppo di 10 topi, 5 avevanon rilevabile batteri circolanti, mentre gli altri 5 avevano conteggi relativamente elevati (Figura 1A). Una conta prelevati dai campioni di pelle mostrano la maggior parte dei topi con gravi conteggi nella pelle umana, in media, 2,1 x 10 4 UFC / mg di tessuto a 6 ore e 4,4 x 10 2 UFC / mg di tessuto a 24 ore (Figura 1B) . I campioni controlaterale del mouse cutanee non ha mostrato la conta batterica a 24 ore e solo un numero molto basso a 6 ore, a dimostrazione della forte preferenza per N. meningitidis alle navi umane della pelle innestata (Figura 1B). In generale conte batteriche erano molto basso per non rilevabile negli altri organi del campione, anche se due animali hanno mostrato conteggi che possono essere attribuiti alla contaminazione dal sangue, in quanto correlati con alta circolanti numeri batteriche (Figura 1C). Il modello può anche essere utilizzato per determinare il ruolo dei fattori di virulenza in vivo, ad esempio del tipo IV pili. Ceppi batterici con mutazioni definite nel gene PILD 21, causando un ceppo privo Tfp, così come il gene pilC1 8, privo della proposta Tfp &#39;adesina&#39; sono stati introdotti nel modello. Queste mutazioni hanno provocato nessuna adesione batterica nel trapianto di pelle umana, confermando il ruolo cruciale Tfp sta giocando in adesione in vivo (Figura 1D). Immunoistochimica / Istologia In questi esperimenti abbiamo usato N. ceppi meningitidis che esprimono la proteina fluorescente verde (GFP) per consentire il rilevamento della fluorescenza senza la necessità di colorazione secondaria. Navi umane sono state colorate con un pennarello per endotelio umano, sia CD31 (PECAM-1) o la lectina Ulex europaeus agglutinina (UEA) 18,22. La UEA stato coniugato a rodamina permettendo-fase di colorazione (figure 2A-C). Nuclei delle cellule possono essere coloranoed con DAPI per aiutare a identificare le strutture del tessuto (Figure 2A-B). Istologia è stata effettuata utilizzando una colorazione ematossilina / eosina standard. Il confine epidermico / dermico della pelle era chiaramente identificabile. L&#39;infiammazione, trombosi vascolare e perdite sono concentrate alle navi vicino a questo confine 24 ore dopo l&#39;infezione (Figura 2D). Trombosi era visibile in diversi vasi dermici piccoli, spesso accompagnati da congestione e infiammazione. Fuoriuscita di globuli rossi fuori nei tessuti potrebbe essere visto, indicando un ampio livello di danni ai vasi. L&#39;istopatologia di pelle innestato nei topi non infetto appariva normale senza infiammazione distinguibili 18. In circa il 30% delle infezioni adesione batterica nella pelle porta allo sviluppo di porpora macroscopicamente rilevabili (figure 2E e 2F). <img alt="Figura 1" fo:content-width=<html> &quot;5in&quot; fo: src = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51134/51134fig1.jpg&quot; /&gt; Figura 1. Una conta. (A) batterica CFU conteggi per ml di sangue a 5 min, 6 ore e 24 ore dopo l&#39;infezione. (B) batterica CFU conta da campioni di pelle di confronto pelle umana (HS) e la pelle mouse (MS) sia a 6 ore e 24 ore dopo l&#39;infezione. (C) batterica CFU conta da altri organi prelevati 24 ore dopo l&#39;infezione. (D) Confronto batterici una conta da campioni di pelle umana e di topo prese a infezione 24 ore post da topi infettati con il tipo selvatico N. macchia meningitidis 2C43 (WT), un ceppo con una mutazione nel gene PILD (PILD) o un ceppo con una mutazione nel gene pilC1 (pilC1). Tutti i grafici vengono visualizzati come dati grezzi con mediana. La figura viene modificato da Melican et al 18.&quot;_blank&quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51134/51134fig2.jpg" /> Figura 2. Microscopia. (A) Proiezione di una pila confocale mostra un microvasi umana macchiata con UEA lectina (rosso), vicino al cutanea (d) epidermica (e) di confine. Il vaso è stato infettato con N. meningitidis (verde) 2 ore dopo l&#39;infezione. (B) Una fetta di ottica e una proiezione fetta (C) mostrando N. microcolonie meningitidis (verde) l&#39;infezione di una nave umana (UEA - rosso) all&#39;interno di una infezione della pelle innesto di due ore dopo. (D) Ematossilina / Eosina colorazione di innesto di pelle umana infettate per 24 ore con N. meningitidis. Il epidermica (e), dermica (d) confine è chiaramente trombosi e la congestione di microvess visibile ed estesaEls (frecce) è visto nel derma. Infiammazione e qualche perdita vascolare (freccia) possono essere identificati. (E) trapianto di pelle umana prima dell&#39;infezione. (F) Lo stesso innesto di pelle come ore dopo l&#39;infezione (E) 24 con N. meningitidis mostrando regioni purpuriche (frecce). Figure 2B, 2D, 2E, 2F e vengono modificati da Melican et al. 18 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51134/51134fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> .

Watch this Scientific Journal Video about Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature at JoVE.com

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Neisseria meningitidis è un agente patogeno specifico umano che infetta i vasi sanguigni. In questo protocollo microvasi umani vengono introdotti in un topo da innesto di pelle umana su topi immunocompromessi. I batteri aderiscono ampiamente ai vasi umani, con conseguente danno vascolare e lo sviluppo del rash purpurica tipicamente osservato in casi umani.

Umanizzato mouse modello per studiare le infezioni batteriche Targeting il microcircolo

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

humanized-mouse-model-to-study-bacterial-infections-targeting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.7K Views.  Paris Cardiovascular Research Centre.  Neisseria meningitidis è un agente patogeno specifico umano che infetta i vasi sanguigni. In questo protocollo microvasi umani vengono introdotti in un topo da innesto di pelle umana su topi immunocompromessi. I batteri aderiscono ampiamente ai vasi umani, con conseguente danno vascolare e lo sviluppo del rash purpurica tipicamente osservato in casi umani. 

Video: Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Utilizzando luciferasi di infezioni batteriche immagine in topi

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

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Immunologia e infezioni

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

L&#39;introduzione di shear stress nello studio di adesione batterica

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Using the BLT Humanized Mouse as a Stem Cell based Gene Therapy Tumor Model

Small animal models such as mice have been extensively used to study human disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of information gained from these studies, the unique characteristics of mouse immunity as well as the species specificity of viral diseases such as human immunodeficiency virus (HIV) infection led to the development of humanized mouse models. The earlier models involved the use of C. B 17 scid/scid mice and the transplantation of human fetal thymus and fetal liver termed thy/liv (SCID-hu) 1, 2 or the adoptive transfer of human peripheral blood leukocytes (SCID-huPBL) 3. Both models were mainly utilized for the study of HIV infection.
One of the main limitations of both of these models was the lack of stable reconstitution of human immune cells in the periphery to make them a more physiologically relevant model to study HIV disease. To this end, the BLT humanized mouse model was developed. BLT stands for bone marrow/liver/thymus. In this model, 6 to 8 week old NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) immunocompromised mice receive the thy/liv implant as in the SCID-hu mouse model only to be followed by a second human hematopoietic stem cell transplant 4. The advantage of this system is the full reconstitution of the human immune system in the periphery. This model has been used to study HIV infection and latency 5-8.
We have generated a modified version of this model in which we use genetically modified human hematopoietic stem cells (hHSC) to construct the thy/liv implant followed by injection of transduced autologous hHSC 7, 9. This approach results in the generation of genetically modified lineages. More importantly, we adapted this system to examine the potential of generating functional cytotoxic T cells (CTL) expressing a melanoma specific T cell receptor. Using this model we were able to assess the functionality of our transgenic CTL utilizing live positron emission tomography (PET) imaging to determine tumor regression (9).
The goal of this protocol is to describe the process of generating these transgenic mice and assessing in vivo efficacy using live PET imaging. As a note, since we use human tissues and lentiviral vectors, our facilities conform to CDC NIH guidelines for Biosafety Level 2 (BSL2) with special precautions (BSL2+). In addition, the NSG mice are severely immunocompromised thus, their housing and maintenance must conform to the highest health standards (<a href="http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html" target="_blank">http://jaxmice.jax.org/research/immunology/005557-housing.html</a>).

The generation and characterization of tumor specific T cells using humanized mice is described here. Human thymic tissue and genetically modified human hematopoietic stem cells are transplanted into immunocompromised mice. This results in the reconstitution of an engineered human immune system allowing for in vivo examination of anti-tumor immune responses.

Uso del mouse BLT umanizzato come cellule staminali basata su un Modello Tumore Terapia Genica

Small animal models such as mice have been extensively used to study human  disease and to develop new therapeutic interventions. Despite the wealth of  ...

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of insects as infection models provides a valuable alternative. Compared to other non-vertebrate model hosts such as nematodes, insects have a relatively advanced system of antimicrobial defenses and are thus more likely to produce information relevant to the mammalian infection process. Like mammals, insects possess a complex innate immune system1. Cells in the hemolymph are capable of phagocytosing or encapsulating microbial invaders, and humoral responses include the inducible production of lysozyme and small antibacterial peptides2,3. In addition, analogies are found between the epithelial cells of insect larval midguts and intestinal cells of mammalian digestive systems. Finally, several basic components essential for the bacterial infection process such as cell adhesion, resistance to antimicrobial peptides, tissue degradation and adaptation to oxidative stress are likely to be important in both insects and mammals1. Thus, insects are polyvalent tools for the identification and characterization of microbial virulence factors involved in mammalian infections.
Larvae of the greater wax moth Galleria mellonella have been shown to provide a useful insight into the pathogenesis of a wide range of microbial infections including mammalian fungal (Fusarium oxysporum, Aspergillus fumigatus, Candida albicans) and bacterial pathogens, such as Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Serratia marcescens Pseudomonas aeruginosa, Listeria monocytogenes or Enterococcus faecalis4-7. Regardless of the bacterial species, results obtained with Galleria larvae infected by direct injection through the cuticle consistently correlate with those of similar mammalian studies: bacterial strains that are attenuated in mammalian models demonstrate lower virulence in Galleria, and strains causing severe human infections are also highly virulent in the Galleria model8-11. Oral infection of Galleria is much less used and additional compounds, like specific toxins, are needed to reach mortality.
G. mellonella larvae present several technical advantages: they are relatively large (last instar larvae before pupation are about 2 cm long and weight 250 mg), thus enabling the injection of defined doses of bacteria; they can be reared at various temperatures (20 &deg;C to 30 &deg;C) and infection studies can be conducted between 15 &deg;C to above 37 &deg;C12,13, allowing experiments that mimic a mammalian environment. In addition, insect rearing is easy and relatively cheap. Infection of the larvae allows monitoring bacterial virulence by several means, including calculation of LD5014, measurement of bacterial survival15,16 and examination of the infection process17. Here, we describe the rearing of the insects, covering all life stages of G. mellonella. We provide a detailed protocol of infection by two routes of inoculation: oral and intra haemocoelic. The bacterial model used in this protocol is Bacillus cereus, a Gram positive pathogen implicated in gastrointestinal as well as in other severe local or systemic opportunistic infections18,19.

The Insect Galleria mellonella as a Powerful Infection Model to Investigate Bacterial Pathogenesis

Oral and intra haemocolic infection of larvae of the greater wax moth Galleria mellonella is described. This insect can be used to study virulence factors of entomopathogenic as well as mammalian opportunistic bacteria. Rearing of the insects, methods of infection and examples of in vivo analysis are described.

L&#39;insetto<em&gt; Galleria mellonella</em&gt; Come un modello di infezione potente per Indagare Patogenesi batterica

The study of bacterial virulence often requires a suitable animal model. Mammalian models of infection are costly and may raise ethical issues. The use of ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Un modello sperimentale per studiare la tubercolosi, la malaria coinfezione sulla trasmissione naturale di Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

Generation e Multi-fenotipica Screening-Alto contenuto di<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Mutants transposon

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro e in vivo modello per studiare l&#39;adesione batterica alla parete del serbatoio in condizioni di flusso

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Culture placentare e deciduale organo umano allo Studio infezioni all&#39;interfaccia materno-fetale

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

Metodi per studiare lipidiche Alterazioni nei neutrofili e la formazione successiva di neutrofili extracellulare Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

The WinCF Model - An Inexpensive and Tractable Microcosm of a Mucus Plugged Bronchiole to Study the Microbiology of Lung Infections

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their mucus-plugged bronchioles create a favorable habitat for microbial colonization. Various pathogens thrive in this environment interacting with each other and driving many of the symptoms associated with CF disease. Like any microbial community, the chemical conditions of their habitat have a significant impact on the community structure and dynamics. For example, different microorganisms thrive in differing levels of oxygen or other solute concentrations. This is also true in the CF lung, where oxygen concentrations are believed to drive community physiology and structure. The methods described here are designed to mimic the lung environment and grow pathogens in a manner more similar to that from which they cause disease. Manipulation of the chemical surroundings of these microbes is then used to study how the chemistry of lung infections governs its microbial ecology. The method, called the WinCF system, is based on artificial sputum medium and narrow capillary tubes meant to provide an oxygen gradient similar to that which exists in mucus-plugged bronchioles. Manipulating chemical conditions, such as the media pH of the sputum or antibiotics pressure, allows for visualization of the microbiological differences in those samples using colored indicators, watching for gas or biofilm production, or extracting and sequencing the nucleic acid contents of each sample.

The mucus plugged airways of cystic fibrosis (CF) patients are an ideal environment for microbial pathogens to thrive. The manuscript describes a novel method for studying the CF lung microbiome in an environment that mimics where they cause disease and how alterations of chemical conditions can drive microbial dynamics.

Il WinCF Modello - Un Microcosmo Economico e Tractable di un muco bronchiale Plugged per studiare la Microbiologia del polmone Infezioni

Many chronic airway diseases result in mucus plugging of the airways. Lungs of an individual with cystic fibrosis are an exemplary case where their ...