Ringraziamo il dottor T. Helleday e Dott. E. Petermann per aiutare con la tecnica della fibra così come i membri del laboratorio di discussione utile. WN è supportata da un Senior Fellowship Research International presso l&#39;Associazione per la Ricerca sul Cancro Internazionale e dal Comitato di Stato polacco per la ricerca scientifica di sovvenzione (N301 165935).

Il metodo qui descritto è stato utilizzato nel seguente pubblicazione: Schwab et al, EMBO J., 29 (4) :806-18 5.. 1. DT40 coltura cellulare Materiali: siero fetale bovino (FBS), pollo siero, penicillina / streptomicina, 2-mercaptoetanolo, RPMI <ol><li> Preparare terreno di coltura cellulare: aggiungere 7% FBS, 3% di siero di pollo, 1 penicillina / streptomicina e 10 mM 2-mercaptoetanolo e medie RPMI. </li><li> DT40 cellule sono coltivate in contenitori sterili colture cellulari a 38 ° C e 5% di CO 2 in un incubatore umidificato. Dividere le celle ogni giorno per una densità di 5 x 10 5 cellule / ml 6. </li></ol> 2. Nella etichettatura vivo Materiali: Idu, CldU <ol><li> Preparare soluzioni di analoghi nucleotidici: sciogliere Idu a 5 mm e CldU a 2,5 mm in mezzo. Calore entrambe le soluzioni brevemente a 60 ° C e fino a quando il vortice analogico nucleotideUES sono sciolti completamente. </li><li> Aggiungi IDU ad una concentrazione finale di 25 mM di crescita esponenziale DT40 cellule e mescolare bene la sospensione cellulare. Incubare le cellule per 20 minuti a 38 ° C e 5% di CO 2. </li><li> Dopo l&#39;incubazione con la prima etichetta, aggiungere CldU ad una concentrazione finale di 250 micron e curare le cellule, come descritto nel passaggio precedente. </li><li> Lavare le cellule con PBS freddo ghiaccio e risospendere loro ad una concentrazione di 7,5 x 10 5 cellule / ml in PBS freddo. Mantenere le cellule etichettate sul ghiaccio. </li></ol> La procedura di etichettatura descritto è solo un suggerimento e può essere modificato per rispondere alle domande specifiche. Si prega di fare riferimento alla sezione di discussione per ulteriori informazioni sul design sperimentale. 3. Lisi delle cellule e del DNA diffusione Materiali: lastre di vetro, fibra di soluzione di lisi <ol><li> Preparare la soluzione in fibra di lisi: 50 mM EDTA e 0,5% SDS in 200 mM Tris-HCl, pH 7,5 </li><li&gt; Spot 2 l di sospensione cellulare ad una estremità del vetrino. Far asciugare per 5 minuti o fino a quando il volume della goccia è notevolmente ridotta, ma non secco. </li><li> Pipettare 7 soluzione di lisi microlitri in cima alla sospensione cellulare e mescolare delicatamente con la punta della pipetta per miscelare le soluzioni. Incubare per 2 minuti per lisi cellulare per procedere. </li><li> Inclinazione diapositive a 15 ° per permettere di diffondere le fibre lungo lo scivolo. </li><li> Una volta che la soluzione in fibra ha raggiunto la parte inferiore della diapositiva, è posto orizzontalmente per asciugare all&#39;aria. Dopo l&#39;essiccazione, una linea sottile, opaco dovrebbe essere visibile lungo la diapositiva. A questo punto, l&#39;inizio delle fibre tese deve essere contrassegnato con una matita come dopo colorazione la linea non sarà più visibile. Questo marchio sarà poi aiutare a individuare le fibre al microscopio. </li></ol> 4. Immunofluorescenza Materiali: metanolo, acido acetico, acido cloridrico, 5% BSA in PBS, vaschetta di colorazione, anti-BrdU (topo) di anticorpi,anti-BrdU (ratto) di anticorpi, di pecora anti-topo Cy3 anticorpi di capra anti-topo Alexa Fluor 488 anticorpi, media Vectashield montaggio, coprioggetto, smalto per le unghie <ol><li> Immergere i vetrini in metanolo / acido acetico (3:1) in una vaschetta di colorazione e incubare per 10 minuti. </li><li> Lavare i vetrini in acqua distillata H 2 O, quindi immergere in 2,5 M HCl per 80 minuti. </li><li> Lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti. </li><li> Rimuovere diapositive dalla vaschetta di colorazione e raccogliere PBS in eccesso con un tovagliolo di carta. Porre i vetrini in senso orizzontale e BSA pipetta 5% su ogni diapositiva. Coprire le diapositive delicatamente con un coprioggetto per diffondere la BSA uniformemente sulla slitta e incubare per 20 minuti. </li><li> Diluire gli anticorpi primari nel 5% BSA alle concentrazioni seguenti: 1:25 anti-BrdU (topo) e 1:400 anti-BrdU (ratto). </li><li> Spostare il vetrino dolcemente il vetrino per rimuoverlo. Non forzare se la polizza di copertura bastoni alla diapositiva. La presentazione può essere reidratato in PBS fino a quando il vetrino si allenta unod possono essere rimossi con facilità. Raccogliere BSA in eccesso con un tovagliolo di carta e porre le slide orizzontale. Pipettare 50 ml di soluzione di anticorpo primario su ogni diapositiva. Coprire di nuovo con un coprioggetto per diffondere la soluzione di anticorpi uniformemente sul vetrino e incubare in una camera umidificata per 2 ore. </li><li> Dopo aver rimosso il coprioggetto, lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti </li><li> Diluire gli anticorpi secondari nel 5% BSA alle seguenti concentrazioni: 1:500 pecora anti-topo Cy3 e 1:400 capra anti-topo Alexa Fluor 488. </li><li> Applicare il 50 microlitri della soluzione di anticorpo secondario come descritto per gli anticorpi primari. Proteggere le diapositive dalla luce e incubare per 1 ora. </li><li> Dopo aver rimosso il coprioggetto, lavare i vetrini tre volte in PBS per 5 minuti. </li><li> Aggiungere una goccia di medium Vectashield montaggio su ogni diapositiva e applicare un vetrino coprioggetti. Premere delicatamente il coprioggetto e rimuovere il liquido in eccesso attorno ad esso con un tovagliolo di carta. Coprioggetto sigillo trasparente con unghie polish e lasciarle asciugare. Conservare i campioni a -20 ° C. </li></ol> 5. Acquisizione di immagini Materiali: microscopio a fluorescenza, fotocamera Mettere una goccia di olio di immersione in una diapositiva accanto al simbolo di matita e di localizzare l&#39;origine delle fibre. Di solito, c&#39;è un fascio di fibre principale, ma queste fibre sono troppo invischiati e non possono essere analizzati successivamente. Allontanarsi dal fascio principale per individuare le aree dove le fibre sono chiaramente separate le une dalle altre (Fig. 2). Vorremmo selezionare solo le immagini utilizzando un canale di colore in modo da evitare distorsioni. Poi, ci sarebbe di circa 10 foto di ogni linea del tempo punto di concentrazione o di cellule. Tuttavia, il numero di immagini dipende da quante fibre può contare su ogni foto. Muovetevi lungo lo scivolo per le riprese fotografiche differenti, come una zona di una diapositiva non possono fornire lunghezze fibra di rappresentanza o strutture di replica. 6. Analisi dei dati Materiale: analisi del programma Picture, ad esempio ImageJ ( <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) Importare immagini in un programma di analisi dell&#39;immagine. Misura la lunghezza dei tratti di fibre e / o contare le strutture di replica diversi (Fig. 3). Contano solo le fibre che sono chiaramente visibili e che non si estendono oltre il bordo della foto. Noi di solito misurare la lunghezza di circa 100 fibre e contano 150-200 strutture replica e vorremmo ripetere gli esperimenti individuali almeno tre volte. 7. Rappresentante dei risultati: DNA appena replicato possono essere visualizzati come linee di anticorpi marcati con analoghi nucleotidici. Nei nostri esperimenti una forcella in corso è rappresentato come adiacente segnali rosso e verde (Fig. 3). Il protocollo di doppia marcatura ci permette anche di definire quattro classi principali di strutture replica: 1) eventi nuova iniziazione può essere Divid<html> ed in origini che hanno sparato mentre le cellule sono state incubate con la prima etichetta e le origini che hanno sparato durante l&#39;incubazione con la seconda etichetta. I primi consistono in vicine verde-rosso-verde i segnali e il secondo di una linea verde solo. 2) cessazione eventi si manifestano come adiacente rosso-verde-rosso segnali. 3) intervallati origini sono siti nel genoma di origine ravvicinati. Tali siti sono costituiti di origini consecutivi e segnali di terminazione. 4) a seconda del disegno sperimentale, in fase di stallo / forche crollato può essere definito come un segnale rosso solo 7 o una linea rossa seguita da un breve tratto verde 8,9. Utilizzando le condizioni qui descritte, le cellule di tipo selvatico DT40 hanno una velocità media forchetta di 0,4 micron / min. Siamo in grado di rilevare circa il 63% forchette in corso, il 10% origini, il 16% forchette in fase di stallo (rosso tratti solo), l&#39;8% e il 3% terminazioni delle fibre intervallati. <html> URE 1 &quot;/&gt; . Figura 1 (A) La parte sinistra del cartone animato rappresenta il primo passo della procedura di etichettatura del DNA: l&#39;aggiunta di Idu a crescita esponenziale DT40 cellule porta l&#39;analogo nucleotidico ad essere facilmente incorporati nella guida di nuova sintesi e in ritardo di sviluppo filamenti di DNA. Questo può essere visualizzato utilizzando un anticorpo specifico, e apparirà come una linea rossa se visto sotto il microscopio. Successivamente, la stessa procedura si ripete con CldU come mostrato sul lato destro della figura. Dopo l&#39;incubazione con l&#39;analogo secondo nucleotide, una forcella attivo sarà visibile come un adiacente tratto rosso-verde. La lunghezza media delle fibre è proporzionale al tempo di incubazione degli analoghi nucleotidici. (B) del DNA da cellule lisate DT40 è teso dalla forza di gravità su un vetrino da microscopio e gli analoghi nucleotidici incorporato vengono visualizzati mediante l&#39;uso di anticorpi specifici e microscopia a fluorescenza. IGURA 2 &quot;/&gt; Figura 2. Un&#39;immagine rappresentativa fluorescenza mostra fibre di tipo selvaggio DT40 cellule in seguito etichettati con IDU e CldU per 20 minuti ciascuno. La maggior parte delle fibre sono ben separati gli uni dagli altri e può quindi essere facilmente analizzati. La barra bianca rappresenta 10 micron. <img src="/files/ftp_upload/3255/3255fig3.jpg" alt="Figura 3" /> . Figura 3 La doppia etichettatura in fibra tecnica permette di distinguere tra le strutture di replica diversi; 1 - forche attivamente replicando, 2 - nuovi siti di replicazione del DNA (lancio di nuove origini), 3 - cessazioni fork (due forchette convergenti), 4 - fibre intervallati (siti di origini ravvicinati) e 5 - forcelle in stallo (solo segnale rosso).

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	<li>Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+function+analysis+using+the+chicken+B-cell+line+DT40.">Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40.</a> Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).</li><li>Petes, T. D., Williamson, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+autoradiography+of+replicating+yeast+DNA.">Fiber autoradiography of replicating yeast DNA.</a> Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).</li><li>Takeuchi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+frequency+of+initiation+sites+of+DNA+replication+in+Werner's+syndrome+cells.">Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells.</a> Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).</li><li>Jackson, D. A., Pombo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replicon+clusters+are+stable+units+of+chromosome+structure:+evidence+that+nuclear+organization+contributes+to+the+efficient+activation+and+propagation+of+S+phase+in+human+cells.">Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells.</a> J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).</li><li>Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATR+activation+and+replication+fork+restart+are+defective+in+FANCM-deficient+cells.">ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells.</a> EMBO. J. 29, 806-818 (2010).</li><li>Saribasak, H., Arakawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+cell+culture+conditions.">Basic cell culture conditions.</a> Subcell. Biochem. 40, 345-346 (2006).</li><li>Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mammalian+DNA+replication+elongation+checkpoint:+implication+of+Chk1+and+relationship+with+origin+firing+as+determined+by+single+DNA+molecule+and+single+cell+analyses.">The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses.</a> Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).</li><li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+RAD51-mediated+pathways+for+restart+and+repair.">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).</li><li>Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCNA+ubiquitination+and+REV1+define+temporally+distinct+mechanisms+for+controlling+translesion+synthesis+in+the+avian+cell+line+DT40.">PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40.</a> Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Descriviamo un metodo che permette di analisi quantitativa di parametri che influenzano la sintesi del DNA durante la fase S a livello di singola molecola. Negli ultimi dieci anni, diverse versioni della tecnica del DNA Fluorografia fibra sono stati sviluppati per visualizzare il movimento delle forche replica singoli all&#39;interno delle cellule viventi. Il parametro fondamentale in tutte queste tecniche è la procedura utilizzata per ottenere la migliore possibile allungamento del DNA sulle superfici di vetro che fornisce ben separate le fibre del DNA. Un passo fondamentale per raggiungere questo obiettivo è il tempo di incubazione della sospensione cellulare sul vetrino da microscopio così come il tempo lisi. Questi parametri dipendono dalla temperatura e flusso d&#39;aria in un laboratorio di particolare e dovrebbe essere empiricamente determinato. La parte pratica di un esperimento in fibra di DNA in genere viene eseguita entro un giorno. Tuttavia, l&#39;acquisizione dell&#39;immagine e successive analisi è più tempo e richiede pratica. Il protocollo di etichettatura può essere annuncioApted per rispondere a vari problemi scientifici: con un agente che interferisce con la replica durante l&#39;etichettatura secondo impulso monitor allungamento forcella / stallo in risposta allo stress replicativo. In questo scenario, la prima etichetta non ha bisogno di essere lavati come il nucleotide è aggiunto il secondo in eccesso. In alternativa, i farmaci che impediscono la replicazione può essere usato in combinazione o appena dopo l&#39;aggiunta della prima etichetta. Ciò richiede la prima etichetta e il farmaco deve essere rimosso prima l&#39;analogo secondo nucleotide è applicata. Questa procedura permette di determinare l&#39;importanza di diversi fattori di riparazione del DNA sulla stabilità replicativa forcella / recupero in condizioni di stress replicativo (forcella cioè stallo e / o collasso). Degno di nota, un&#39;analisi più dettagliata dei particolari del programma di replicazione del DNA potesse essere eseguita con l&#39;uso di un approccio alternativo che combina DNA e la pettinatura ibridazione in situ fluorescente. Questo però, è tecnicamente più impegnativo e richiede speseattrezzature SIVE. La capacità di analizzare qualitativamente e quantitativamente le indicazioni della replicazione del DNA offre uno strumento essenziale per studiare i difetti nella replicazione del DNA stesso, come pure i percorsi che sopprimono l&#39;instabilità genomica associata con forche di replica. Indubbiamente, questo saggio sarà ulteriormente aiutare a far luce sui meccanismi di replicazione mediata riparazione del DNA che permettono alle cellule normali di rispondere / adattarsi ai cambiamenti ambientali e come le cellule tumorali utilizzano questi meccanismi per resistere alla tossicità dei farmaci destinati forche replica.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Oro siero fetale bovino (FBS) </td><td> PAA </td><td> A15-151 </td><td></td></tr><tr><td> Pollo siero </td><td> Sigma </td><td> C5405 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Gibco </td><td> 21875 </td><td></td></tr><tr><td> 5-Iodo-2&#39;-deossiuridina (IDU) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I7125 </td><td></td></tr><tr><td> 5-cloro-2&#39;-deossi-uridina (CldU) </td><td> Sigma </td><td> C6891 </td><td></td></tr><tr><td> Microscopio diapositive SuperFrost </td><td> VWR </td><td> 631-0910 </td><td></td></tr><tr><td> Coprioggetto No1 </td><td> Laboratorio scientifico suppplies </td><td> MIC3234 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield montaggio medio </td><td> H-1000 Vector laboratorio </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi anti-BrdU (mouse) </td><td> BD Biosciences </td><td> 347580 </td><td></td></tr><tr><td> Anticorpi anti-BrdU (ratto) </td><td> Abcam </td><td> ab6326 </td><td></td></tr><tr><td> di pecora anti-topo Cy3 </td><td> Sigma </td><td> C2181 </td><td></td></tr><tr><td> capra anti-topo Alexa Fluor 488 anticorpi </td><td> Invitrogen </td><td> A110060 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualization of dna replication in the vertebrate model system dt40 using the dna fiber technique

Mantenimento della stabilità replica forcella è della massima importanza per la divisione delle cellule per preservare la vitalità e prevenire le malattie. I processi coinvolti non solo garantire la duplicazione del genoma fedeli di fronte a danni al DNA endogeno ed esogeno, ma anche prevenire l&#39;instabilità genomica, un fattore riconosciuto causale nello sviluppo del tumore. Qui, descriviamo un microscopio a base semplice e conveniente fluorescenza metodo per visualizzare la replicazione del DNA nelle cellule B aviaria linea DT40. Questa linea cellulare fornisce un potente strumento per studiare la funzione delle proteine ​​in vivo dalla genetica inversa nelle cellule dei vertebrati 1. Fibra Fluorografia DNA in cellule DT40 manca un gene specifico permette di chiarire la funzione di questo prodotto del gene nella replicazione del DNA e la stabilità del genoma. I metodi tradizionali per analizzare le dinamiche forcella di replicazione nelle cellule dei vertebrati si basano sulla misurazione del tasso globale di sintesi del DNA in una popolazione di cellule etichettate impulsi. Si tratta di un approccio quantitativo e non consente per l&#39;analisi qualitativa dei parametri che influenzano la sintesi del DNA. Al contrario, il tasso di circolazione delle forche attivo può essere seguito direttamente quando si utilizza la tecnica del DNA in fibra di 2-4. In questo approccio, il DNA nascente è etichettato in vivo per incorporazione di nucleotidi alogenati (Fig. 1A). Successivamente, le singole fibre sono allungati su un vetrino da microscopio, e con l&#39;etichetta tratti di replicazione del DNA sono colorate con anticorpi specifici e visualizzati al microscopio a fluorescenza (Fig. 1B). Avvio di replica e direzionalità forcella è determinato mediante l&#39;uso consecutivo di due analoghi diversamente modificati. Inoltre, la doppia etichettatura approccio permette di analisi quantitativa di parametri che influenzano la sintesi del DNA durante la fase S, ovvero la replica di strutture quali le forcelle in corso e in fase di stallo, l&#39;origine densità replica così come terminazioni forchetta. Infine, la procedura sperimentale può essere realizzareed in un giorno, e richiede solo attrezzature generali di laboratorio e un microscopio a fluorescenza.

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Visualization of DNA Replication in the Vertebrate Model System DT40 using the DNA Fiber Technique

DT40, un sistema modello vertebrato genetico, fornisce un potente strumento per analizzare la funzione delle proteine. Qui si descrive un metodo semplice che permette l&#39;analisi qualitativa dei parametri che influenzano la sintesi del DNA durante la fase S in DT40 cellule a livello di singola molecola.

Visualizzazione della replicazione del DNA nei vertebrati DT40 sistema modello utilizzando la tecnica del DNA Fiber

Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not ...

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Research

JoVE Journal

Biology

39.6K Views.  University of Oxford. DT40, un sistema modello vertebrato genetico, fornisce un potente strumento per analizzare la funzione delle proteine. Qui si descrive un metodo semplice che permette l'analisi qualitativa dei parametri che influenzano la sintesi del DNA durante la fase S in DT40 cellule a livello di singola molecola.

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Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualizzazione singola molecola di DNA replica con microscopia a fluorescenza

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Ricerca

Biologia

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers. Genetic studies in mammalian systems have been limited due to the lack of readily available tools including defined mutant genetic cell lines, regulatory expression systems, and appropriate selectable markers. To circumvent these difficulties, model genetic systems in lower eukaryotes have become an attractive choice for the study of functionally conserved DNA repair proteins and pathways. We have developed a model yeast system to study the poorly defined genetic functions of the Werner syndrome helicase-nuclease (WRN) in nucleic acid metabolism. Cellular phenotypes associated with defined genetic mutant backgrounds can be investigated to clarify the cellular and molecular functions of WRN through its catalytic activities and protein interactions. The human WRN gene and associated variants, cloned into DNA plasmids for expression in yeast, can be placed under the control of a regulatory plasmid element. The expression construct can then be transformed into the appropriate yeast mutant background, and genetic function assayed by a variety of methodologies. Using this approach, we determined that WRN, like its related RecQ family members BLM and Sgs1, operates in a Top3-dependent pathway that is likely to be important for genomic stability. This is described in our recent publication [1] at <a href="http://www.impactaging.com">www.impactaging.com</a>. Detailed methods of specific assays for genetic complementation studies in yeast are provided in this paper.

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System

Genetic studies in yeast can be employed to investigate the molecular and cellular functions of human genes in cellular DNA metabolism. Methods are described for the genetic characterization of the human WRN gene product defective in the premature aging disorder Werner syndrome in functionally conserved pathways using yeast as a tractable model system.

Studi genetici di proteine ​​umane di riparazione del DNA Utilizzando lievito come sistema modello

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the environment, but also determines body shape and plays a role in motility4-6. Several layers secreted by epidermal cells comprise the cuticle, including an outermost lipid layer7.
Circumferential ridges in the cuticle called annuli pattern the length of the animal and are present during all stages of development8. Alae are longitudinal ridges that are present during specific stages of development, including L1, dauer, and adult stages2,9. Mutations in genes that affect cuticular collagen organization can alter cuticular structure and animal body morphology5,6,10,11. While cuticular imaging using compound microscopy with DIC optics is possible, current methods that highlight cuticular structures include fluorescent transgene expression12, antibody staining13, and electron microscopy1. Labeled wheat germ agglutinin (WGA) has also been used to visualize cuticular glycoproteins, but is limited in resolving finer cuticular structures14. Staining of cuticular surface using fluorescent dye has been observed, but never characterized in detail15. We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. This optimized protocol for DiI staining is a simple, robust method for high resolution fluorescent visualization of annuli, alae, vulva, male tail, and hermaphrodite tail spike in C. elegans.

Visualization of Caenorhabditis elegans Cuticular Structures Using the Lipophilic Vital Dye DiI

We present a method to visualize cuticle in live C. elegans using the red fluorescent lipophilic dye DiI (1,1'-dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), which is commonly used in C. elegans to visualize environmentally exposed neurons. With this optimized protocol, alae and annular cuticular structures are stained by DiI and observed using compound microscopy.

Visualizzazione di Caenorhabditis Elegans Strutture cuticola Utilizzando il Dye lipofili Vital, Dii

The cuticle of C. elegans is a highly resistant structure that surrounds the exterior of the animal1-4. The cuticle not only protects the animal from the ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

Robusto FISH 3D DNA con sonde marcate direttamente

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

In tempo reale Imaging del singolo Engineered RNA trascritti in cellule viventi Utilizzando Ratiometric bimolecolari Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Amplification, Next-generation Sequencing, and Genomic DNA Mapping of Retroviral Integration Sites

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of diverse libraries of retroviral integration sites using ligation-mediated PCR (LM-PCR) amplification and next-generation sequencing (NGS), (2) mapping the genomic location of each virus-host junction using BEDTools, and (3) analyzing the data for statistical relevance. Genomic DNA extracted from infected cells is fragmented by digestion with restriction enzymes or by sonication. After suitable DNA end-repair, double-stranded linkers are ligated onto the DNA ends, and semi-nested PCR is conducted using primers complementary to both the long terminal repeat (LTR) end of the virus and the ligated linker DNA. The PCR primers carry sequences required for DNA clustering during NGS, negating the requirement for separate adapter ligation. Quality control (QC) is conducted to assess DNA fragment size distribution and adapter DNA incorporation prior to NGS. Sequence output files are filtered for LTR-containing reads, and the sequences defining the LTR and the linker are cropped away. Trimmed host cell sequences are mapped to a reference genome using BLAT and are filtered for minimally 97% identity to a unique point in the reference genome. Unique integration sites are scrutinized for adjacent nucleotide (nt) sequence and distribution relative to various genomic features. Using this protocol, integration site libraries of high complexity can be constructed from genomic DNA in three days. The entire protocol that encompasses exogenous viral infection of susceptible tissue culture cells to integration site analysis can therefore be conducted in approximately one to two weeks. Recent applications of this technology pertain to longitudinal analysis of integration sites from HIV-infected patients.

We describe a protocol for amplifying retroviral integration sites from the genomic DNA of infected cells, sequencing the amplified virus-host junctions, and then mapping these sequences to a reference genome. We also describe techniques to quantify the distribution of integration sites relative to various genomic annotations using BEDTools.

Amplificazione, sequenziamento di prossima generazione, e DNA genomico mappatura dei siti di integrazione retrovirali

Retroviruses exhibit signature integration preferences on both the local and global scales. Here, we present a detailed protocol for (1) generation of ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating interactions between DNA and its binding proteins. Here, we report a method that uses fluorescent microscopy for visualizing large DNA molecules tethered on the surface. First, glass coverslips are biotinylated and passivated by coating with biotinylated polyethylene glycol, which specifically binds biotinylated DNA via avidin protein linkers and significantly reduces undesirable binding from non-specific interactions of proteins or DNA molecules on the surface. Second, the DNA molecules are biotinylated by two different methods depending on their terminals. The blunt ended DNA is tagged with biotinylated dUTP at its 3' hydroxyl terminus, by terminal transferase, while the sticky ended DNA is hybridized with biotinylated complimentary oligonucleotides by DNA ligase. Finally, a microfluidic shear flow makes single DNA molecules stretch to their full contour lengths after being stained with fluorescent protein-DNA binding peptide (FP-DBP).

We present an approach for visualizing fluorescent protein DNA binding peptide (FP-DBP)-stained large DNA molecules tethered on the polyethylene glycol (PEG) and avidin-coated glass surface and stretched with microfluidic shear flows.

Visualizzazione del Surface-legato Grande DNA molecole con un DNA proteina fluorescente Binding peptide

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad to extract cellular DNA from whole blood in less than 2 min. The blood specimen is treated with detergent, mixed briefly and applied by pipet to the separation membrane. The lysate wicks into the blotting pad due to capillary action, capturing the genomic DNA on the surface of the separation membrane. The extracted DNA is retained on the membrane during a simple wash step wherein PCR inhibitors are wicked into the absorbent blotting pad. The membrane containing the entrapped DNA is then added to the PCR reaction without further purification. This simple method does not require laboratory equipment and can be easily implemented with inexpensive laboratory supplies. Here we describe a protocol for highly sensitive detection and quantitation of HIV-1 proviral DNA from 100 &#181;l whole blood as a model for early infant diagnosis of HIV that could readily be adapted to other genetic targets.

We describe here a simple and rapid paper-based DNA extraction method of HIV proviral DNA from whole blood detected by quantitative PCR. This protocol can be extended for use in detecting other genetic markers or using alternative amplification methods.

L&#39;isolamento di filtrazione di acidi nucleici: DNA metodo di estrazione semplice e veloce

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Visualization of DNA Repair Proteins Interaction by Immunofluorescence

Mammalian cells are constantly exposed to chemicals, radiations, and naturally occurring metabolic by-products, which create specific types of DNA insults. Genotoxic agents can damage the DNA backbone, break it, or modify the chemical nature of individual bases. Following DNA insult, DNA damage response (DDR) pathways are activated and proteins involved in the repair are recruited. A plethora of factors are involved in sensing the type of damage and activating the appropriate repair response. Failure to correctly activate and recruit DDR factors can lead to genomic instability, which underlies many human pathologies including cancer. Studies of DDR proteins can provide insights into genotoxic drug response and cellular mechanisms of drug resistance.
There are two major ways of visualizing&#160;proteins in vivo: direct observation, by tagging the protein of interest with a fluorescent protein and following it by live imaging, or indirect immunofluorescence on fixed samples. While visualization of fluorescently tagged proteins allows precise monitoring over time, direct tagging in N- or C-terminus can interfere with the protein localization or function. Observation of proteins in their unmodified, endogenous version is preferred. When DNA repair proteins are recruited to the DNA insult, their concentration increases locally and they form groups, or &#8220;foci&#8221;, that can be visualized by indirect immunofluorescence using specific antibodies.
Although detection of protein foci does not provide a definitive proof of direct interaction, co-localization of proteins in cells indicates that they regroup to the site of damage and can inform of the sequence of events required for complex formation. Careful analysis of foci spatial overlap in cells expressing wild type or mutant versions of a protein can provide precious clues on functional domains important for DNA repair function. Last, co-localization of proteins indicates possible direct interactions that can be verified by co-immunoprecipitation in cells, or direct pulldown using purified proteins.

Following DNA damage, human cells activate essential repair pathways to restore the integrity of their genome. Here, we describe the method of indirect immunofluorescence as a means to detect DNA repair proteins, analyze their spatial and temporal recruitment, and help interrogate protein-protein interaction at the sites of DNA damage.