XHP은 노화에 국립 연구소 (NIHK01AG024496)와 아동 건강 및 인간 발달의 유니스 케네디 Shriver 국립 연구소 (NIHR21HD056530)에서 건강 (NIH) 보조금의 국립 연구소에 의해 지원되었습니다.

1. 솔루션 및 미디어 준비 <ol><li> 젤라틴 코팅 솔루션 : 4 0.1 % (W / V) ddH 2 O, autoclaved에 젤라틴 및 저장 ° C. </li><li> Matrigel 코팅 솔루션을 제공합니다. 증권 솔루션 : ° C 야간 10 ML 얼음처럼 차가운 DMEM이나 DMEM/F12를 추가, 잘 섞어 나누어지는 1 ML / 소독 조직 문화 후드 아래 튜브, -20에 저장 ° C. 4 느린 해동 Matrigel (10 ML) 작업 솔루션 : 천천히 녹여 4 일 ML Matrigel의 나누어지는 ° C DMEM이나 DMEM/F12를 차게 14 ML에 1-2위한 시간, 전송 및 코팅하기 전에 즉시 소독 조직 문화 후드 아래에 잘 섞는다. </li><li> 인간 laminin 코팅 솔루션 : 희석 한 ML 인간 laminin 솔루션 얼음처럼 차가운 DMEM 또는 DMEM/F12 함께 (트리스의 0.5 MG / ML -80에서 저장, NaCl을 버퍼 ° C, 1-2 시간 동안 4 ° C에서 느린 해동) 12.5 ML 작업 솔루션 (40 μg / ML) 소독 조직 문화 후드 아래에 바로 코팅하기 전에. </li><li> 성장 인자의 재고 솔루션 (500 1000X)는 10 μg의 성장 요인을 풀다멸균 버퍼 / ML (0.5 % BSA, 1.0 MM DTT, 10 % 글리세롤, 1XPBS)와 -80에서 50-100 μl / 튜브 aliquots로 저장 ° C. </li><li> 모든 트랜스 - retinoic 산은 용액 (1000X) 작동 : -80에서 DMSO, aliquots에 저장에서 10 밀리미터를 ° C. </li><li> HESC 미디어 : DMEM/F12 또는 KO - DMEM (80 %), KO 혈청 교체 (20 %), L - alanyl - L - gln 또는 L - gln (2 ㎜), 가상 불필요한 아미노산 (MNAA, 1X) 및 β - 메르 캅 토 에탄올 (100 μm의), 필터링 및 4 저장 ° 사용하기 전에 20 NG / ML bFGF와 함께 보충 C,. 또는 정의된 구성 요소 &quot;(KO) 혈청 교체를 내라&quot;대체 : DMEM/F12 또는 KO - DMEM (100 %), L - alanyl - L - gln 또는 L - gln (2 ㎜), MNAA (1X), 가상 필수 아미노산 (MEAA, 1X) 및 β - 메르 캅 토 에탄올 (100 μm의)는, 필터링 및 4 저장 ° bFGF (20 NG / ML), 인간 인슐린 (20 μg / ML), 아스코르비 산 (50 μg /로 보충 C, ML), 인간의 activin (50 NG / ML), 인간 / 알부민 Albumax (10 MG / ML), 그리고 인간의 트랜스페린 (8 μg / ML)을 사용하기 전에. </li><li> NSC 미디어 : DMEM/F12 (100 %), N - 2 supplemeNT (1X), 헤파린 (8 μg / ML). </li></ol> 2. 플레이트 코팅 <ol><li> 와 코트 판 젤라틴 : 시간을 추가하십시오 ML / 물론 6 자 접시에 젤라틴 용액의 2.5 37 ° C 배양기에서 하룻밤 humidified 품어. </li><li> 코트 laminin과 접시 : 냉기 젤라틴 - 코팅 접시와 젤라틴 제거는, 2.5 ML 추가 / 미리 냉장에 잘 Matrigel 또는 인간의 laminin 코팅 작업 솔루션은 4 ° C 하루에 6 접시와 잘 부화를 gelatinized. </li></ol> 3. 정의된 조건 하에서 Undifferentiated hESCs를 Passaging 및 심는 <ol><li> hESC의 식민지가 5~7일 나이로 성장할 수 있도록하고, 해부 현미경 (사전 따뜻한 37 단계를 해부 ° C) 소독 후드를 해부 아래에 hESC 문화 플레이트 가져가라. </li><li> hESC의 식민지가 분할을 선택합니다. Morphologically,이 식민지는 정의된 가장자리 유엔과 함께 일반적으로 약간 불투명한&gt; 75% undifferentiated hESCs (작은 소형 세포), (하지 하얀 쌓여 업 세포가 아닌 명백한 차별화된 세포)가 있어야해부 현미경 derneath. 신중하게 선택한 식민지 개요 및 P2 멸균 피펫 팁의 가장자리와 식민지이나 유리 모세관 뽑아 (있을 경우)은 식민지를 둘러싼 차별 fibroblast 계층과 모든 차별화된 부분을 제거합니다. (참고, pluripotent의 hESCs는 해부 현미경으로 백퍼센트 undifferentiated 아르 선호하지만, 그건 확인할 논문 전지하는 것도 어려운 일이지만, 심지어는 최적의 조건 하에서 자발적인 차별을 받다, 과도 단계에 있으며,&gt; 75 % undifferentiated가 일반적으로 통과 지점으로 간주됩니다. 차별화된 세포는 일반적으로 종자되지 않으며 passaging 과정에서 제거 성장 계속) </li><li> aspirating로 부동 분리된 차별화된 세포를 포함하는 기존의 미디어를 제거합니다. 한번 hESC 미디어 (bFGF없이)로 씻으십시오. 3 ML 추가 / 20 NG / ML bFGF를 포함하는 잘 신선한 hESC 미디어. </li><li> 작은 조각으로 undifferentiated hESC의 식민지 잘라하고, 멸균 피펫 팁 또는 모세관 뽑아 유리 분리합니다.</li><li> 50 ML 원뿔 튜브에서 함께 분리 식민지 조각을 포함하는 미디어 풀. 1 ML / 함께 20 NG / ML bFGF와 수영장을 포함하는 잘 hESC 미디어와 함께 한 접시를 씻으십시오. </li><li> 코팅 신선한 접시에서 Matrigel 또는 인간의 laminin 솔루션을 기음. 6 잘 판에 식민지 조각을 포함하는 나누어지는 4 ML / 잘 hESC 미디어. 부드럽게 떨지 않고 배양기에 플레이트를 전송하고 5 % CO 2 분위기 humidified 37 ° C 배양기에서 방해없이 식민지 조각의 씨앗이 하룻밤 수 있습니다. </li></ol> 4. Retinoic 산성과 정의 문화 체제에서 hESCs의 신경 유도 <ol><li> 시딩 후 3 일에, 접시 각 우물에서 이전 미디어의 대부분을 제거하고 hESC의 식민지 (hESCs가 건조 절대로 용납할) 빠져들 수 있도록 충분한 미디어를 두십시오. 20 NG / ML bFGF와 10 μm의 retinoic 산성을 포함하는 4 ML / 물론 신선한 hESC 미디어로 바꿉니다. </li><li> 20 NG / ML bFGF와를 포함하는 신선한 hESC 매체와 오래된 미디어를 교체10 μm의 retinoic 산성 매일 다른 하루, 그리고 신경 유도 hESC의 식민지 일 7 또는 8로 성장 수 있습니다. 식민지 내의 모든 세포가 번식에 계속 큰 차별화된 세포 형태 변화를 받아야합니다. 식민지는 하루에 7 또는 8 시까지 번호판을 충당하기 위해 크기가 증가되며, 세포는 식민지의 일부 지역에서 무더기로 쌓이기 시작합니다. </li></ol> 5. 서스펜션 문화의 연결을 계속 차별 <ol><li> 멸균 후드를 해부 아래 현미경 (미리 따뜻한 37 단계를 해부 ° C) 해부에 hESC 문화 플레이트를 가져가라. 조심스럽게 식민지 개요 및 P2 멸균 피펫 팁의 가장자리와 식민지를 둘러싼 fibroblast 층 (차별화된 세포 식민지 밖으로 마이 그 레이션)을 제거하거나 유리 모세관 뽑았. </li><li> aspirating로 부동 분리 fibroblast 세포를 포함하는 기존의 미디어를 제거합니다. 한번 hESC 미디어 (bFGF없이)로 씻으십시오. 3 ML / 물론 신선한 hESC 미디어 (bFGF없이) 추가합니다. </li><li> 잘라내기 신경 - Induced hESC의 작은 조각으로 식민지, 그리고 멸균 피펫 팁과 분리 또는 유리가 모세 뽑았. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에서 함께 분리 식민지 조각을 포함하는 미디어 풀. 함께 한 ML / 잘 hESC 미디어 (bFGF 제외) 수영장과 함께 한 접시를 씻으십시오. </li><li> 나누어지는 4 ML / 음 37 6 잘 ultralow 첨부 플레이트와 부화 식민지 조각을 포함하는 혈청이없는 hESC 미디어 ° C humidified 인큐베이터가 떠있는 세포 클러스터 (neuroblasts)가 4-5일에 대한 양식 수 있습니다. </li></ol> 6. 접착제 문화의 연결 표현형의 성숙 <ol><li> 50 ML 원뿔 튜브에 함께 떠 neuroblasts를 포함하는 미디어 풀. 5 분 1,400 rpm으로 원심 분리기. 당신이 할 수만큼 기존의 미디어를 대기음하고 VEGF (20 NG / ML), NT - 3 (10 NG / ML) 및 BDNF (10 NG / ML)이있는 신선한 NSC 미디어의 동일한 금액을 추가합니다. </li><li> 4 ML / 잘 6 잘 접시에 부동 neuroblasts과 나누어지는를 섞어 아래 피펫합니다. neuroblasts 또한 SE 수 있습니다laminin / 콜라겐 (Matrigel) 또는 인간의 laminin polymerized VEGF (20 NG / ML), NT - 3 (10 NG / ML) 및 BDNF (10 NG / ML)가 포함된 혈청 무료 NSC 미디어에서 3 차원 매트릭스에 eded . 37에 접시를 전송 ° C humidified 인큐베이터가 neuroblasts가 밤새 첨부할 수 있습니다. </li><li> NSC 미디어 포함하는 VEGF (20 NG / ML), NT - 3 (10 NG / ML) 및 BDNF (10 NG / ML) 매일 다른 하루를 교체합니다. neurite 베어링의 연결을 세포와 색소 세포의 광범위한 네트워크는 지속적인 재배 및 시간 수의 증가 2 주 이내에 나타나기 시작하며, 3 개월 이상 지속 될 수 있습니다. </li></ol> 7. 대표 결과 : Retinoic 산 (RA)는 전용 neuroectodermal의 표현형 (그림 2A)로 pluripotency에서 전환 정의된 문화 시스템에 유지 hESCs을 유발하기에 충분 렌더링됩니다. RA에 undifferentiated hESCs의 노출시, 식민지 내의 모든 세포는 형태 변화를 받게 될 것이다pluripotency - 관련된 마커를 표현 중지 큰 차별 세포로 월 4로 표시하고, 다양한 neuroectoderm - 관련 등 HNK1 같은 마커, AP2, 그리고 TrkC을 (그림 2B) 표현 시작합니다. 이러한 큰 차별 세포가 증식을 계속하고 식민지는 초기의 연결 마커 β - III - tubulin을 (그림 2B) 표현하기 위해 자발적으로 진행, 크기로 증가합니다. 좀 더 성숙 마커의 연결지도 - 2는 세포 (그림 2B) 쌓여있는 식민지 영역에 표시됩니다. neuroectodermal 세포와 분화의 연결의 모양과 일치하는, 티로신 hydroxylase (TH) 유전자 16 dopaminergic의 연결을 분화 및 활성화에 연루의 연결을 구체적인 transcriptional 요인 Nurr1은, 핵 (그림 2B)로 이동시키다합니다. 분리된 후, RA - 대우 hESCs는 서스펜션 컬트에 떠있 세포 클러스터 (neuroblasts) 형성신경 분화 과정을 계속 ure. bFGF의 제거시와 neuroblasts가 β - III - tubulin과지도 - 2 - 표현, neurite 혈청 무료 정의 매체 laminin / 콜라겐 polymerized 3 차원 매트릭스의 씨앗을 품고 조직 문화 판 또는 첨부 허용 이후 - 베어링 세포와 색소 세포는 같은 기간 동안 치료하지 않고 hESCs의 자발적인 멀티 혈통 분화에 비해 효율성의 급격한 증가로 나타나기 시작하며, 3 개월 이상 (그림 2C)에 대한 지속 될 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig1.jpg" /> 그림 1은 독점적으로 작은 분자의 간단한 규정에 의한 특정 임상 - 관련 혈통에 인간의 pluripotent 줄기 세포의 잘 제어 효율 유도의 개략도. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3273/3273fig2.jpg" /> 그림 2 <stroNG&gt; Retinoic 산은 신경 혈통 사양 및 정의 조건 pluripotency를 직접 진행의 연결을 유도. (A) 도식은 hESCs의 감독의 연결을 분화의 프로토콜 시간 라인 묘사. (B) 정의된 문화 시스템에서 retinoic 산성 (RA)에 undifferentiated hESCs의 노출되면, 대형은 월 4 차별화된 식민지 이내 (적색) 부정적인 세포는 컨트롤과 같은 모의 - 대우 (DMSO) hESCs에 비해 등장하기 시작 . RA - 유발 차별 월 4 부정적인 세포가 표현 HNK - 1 (빨간색), AP2 (적색), TrkC (녹색) 시작 후 초기 neuroectodermal 차별과 β - III - tubulin (적색), 일관성. 이러한 세포는 궁극적으로 일반적으로 세포가 무더기로 쌓이기 시작 부분에있는 마커의 연결지도 - 2 (녹색)를 표현하는 성숙 계속. neuroectodermal 세포와 분화의 연결의 모양과 일치에의 연결을 특정 transcriptional 요인 Nurr1 (녹색), 연루dopaminergic의 연결을 분화와 티로신 hydroxylase (TH) 유전자의 활성화는 핵에 translocated. 모든 세포들은 핵의 DAPI의 얼룩 (파란색)으로 표시됩니다. β - III - tubulin (적색) 및지도 - 2 (3 - dimentional 매트릭스에 표시된 녹색) 표현 neurite - 베어링 세포의 광범위한 네트워크에 의한 평가로 (C) RA 치료는 높은 효율의 연결 혈통으로 차별을 유도. 화살표 CNS 이들의 전형적인 색소 세포를 나타냅니다. 모든 세포는 insets에서 핵의 DAPI의 얼룩 (파란색)으로 표시됩니다. 스케일 바 : 0.1 mm.

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Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+of+human+somatic+cells+to+pluripotency+with+defined+factors.">Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors.</a> Nature. 451, 141-146 (2008).</li></ol>

저자는 경쟁 이익을 선언합니다. XHP는 Xcelthera의 창시자이다. XHP 및 EYS는 hESCs에 관련된 지적 재산권을 가지고.

발달 연구와 임상 번역 모두의 주요 과제 중 하나는 효율적이고 예측할 원하는 표현형에 pluripotent 인간 줄기 세포의 광범위한 차별 잠재력을 채널로하는 방법되었습니다. 이러한 세포가 여러 혈통 골재 단계를 통해 이동하여 모든 세균 레이어의 세포로 체외에서 자발적으로 구별 수 있지만, 세포의 작은 파편만이 주어진 계보 (Lineage) 1,4을 추구. 그 hESC - 파생 집계에서 삼배 배아 레이어에있는 수 광범위하게 분기하는 원치 않는 세포 유형의 상당한 금액의 동시 모습은 종종 비효율뿐만 아니라 원하는 phenotypes의 출현을 만드는,하지만 통제하고 신뢰할 수뿐만 아니라. 심장과 신경 lineages는 이전 보고서에서 파생되어 있지만, 그러나, pluripotent 세포의 세균 레이어 유도 및 tumorigenicity의 높은 위험을 통해 전문적인 세포를 생성하는 비효율이 transplantatio에 따라n은 추가 임상 번역을 방해했습니다. hESC 라인은 초기 성장 체포 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs) 4 파생된 및 공동 문화 유지했다. 여러 인간 피더, 피더 - 무료 및 화학적 - 조제 문화 시스템 hESCs 11-13을 위해 개발되었습니다지만 필요하고 인간 pluripotent 세포의 자기 갱신을 유지에 충분한 요소가 미해결 상태로 유지됩니다. 이러한 외인성 피더 세포 및 생물 학적 시약은 마스크 반면에 발달 신호에 응답하는 pluripotent 세포의 능력을 undifferentiated hESCs의 장기적인 안정 성장을 유지할 수 있도록 도와주십시오. 성실 확장 및 관리할 수있는 직접적인 차별을 허용하는 정의 biologics 무료 문화 시스템에 undifferentiated hESCs을 유지하는 것은 자신의 치료 유틸리티와 가능성의 열쇠 중 하나입니다. RA는 이전에 보고된 condit 이하 유지 undifferentiated hESCs의의 연결을 분화를 유도하기 위해 충분한 아니었외인성 피더 세포를 포함하는 이온. 신경 lineages는 RA와 hESC - 차별화된 멀티 혈통 집계를 (embryoid 기관) 치료, hESC의 차별화에 상대적으로 초기 단계에 나타납니다 있지만 약간 뉴런 1, 14, 15의 낮은 수확량을 증가했습니다. 특정 혈통에 인간의 pluripotent 줄기 세포의 일정한 변환을 달성하기 위해, 우리는 임상 - 관련 혈통 특정에 독점적으로 pluripotent의 hESCs의 잘 제어 효율 유도 조건을 식별하는 undifferentiated hESCs의 확산을 할려고 수있는 정의된 문화 시스템을 채용 작은 분자의 단순한 제공 (그림 1, 그림. 2). 미래 연구는 재생 요법에 대한 임상 - 관련 lineages를 파생하면 hESC의 pluripotent 운명의 작은 분자 중재 직접 제어 및 모듈 레이션을위한 방법을 포장 수있는, 대안으로 인간 CNS 개발 유전 및 epigenetic 조절 분자를 보여줄 것입니다. RA 치료, 1-5없이%의 hESCs는 뉴런 1, 14, 15으로 자발적인 차별을 받아야합니다. RA 치료와 함께, 우리는 인간의 배아 발달 14 에뮬레이트 수도 과정에서 정의하는 문화에 따라 유지 hESCs에서&gt; 95% 배아의 연결 progenitors과 뉴런을 생성할 수있게되었습니다. 최근 유전자를 결정 알려진 신경 운명은 0.5-8 % 17, 18까지 낮은 효율 성인 신경 progenitors과 뉴런에 마우스 섬유아 세포를 transdifferentiate하는 데 사용되었습니다. 그러나, 다시 프로그램 체세포 역사적으로 비정상적인 유전자 발현 및 장애 치료 유틸리티를 19-21로 가속 노화와 관련된되었습니다. 마지막으로, 우리가 여기 설립 프로토콜, 내부 세포 덩어리 (ICM) 또는 인간 blastocyst 4 epiblast에서 파생된 pluripotent hESCs로 제한됩니다는 morula 이전에서 파생 동물 - 기원 ESCs, ESCs (8 등 다른 pluripotent 세포에 적용되지 않을 수도 있습니다 세포) 단계 배아 22, 그리고 인형도 만들고icially 다시 프로그램 세포 23.

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 댓글 (옵션) </th></tr><tr><td> 젤라틴 </td><td> 시그마 </td><td> G1890 </td><td></td></tr><tr><td> Matrigel </td><td> bioscience BD </td><td> 356,231 </td><td> 성장 요인은 감소 </td></tr><tr><td> 인간 laminin </td><td> 시그마 </td><td> L6274 </td><td></td></tr><tr><td> 모든 트랜스 - Retinoic 산 </td><td> 시그마 </td><td> R2625 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 10565018 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 31053036 </td><td></td></tr><tr><td> DMEM - KO </td><td> Invitrogen </td><td> 10829018 </td><td></td></tr><tr><td> 노크 아웃 혈청 대체 </td><td> Invitrogen </td><td> 10828028 </td><td></td></tr><tr><td> 가상 불필요한 아미노산 솔루션 (MNAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11140050 </td><td></td></tr><tr><td> 가상미노 산 솔루션 (MEAA, 100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 11130050 </td><td></td></tr><tr><td> β - 메르 캅 토 에탄올 </td><td> Invitrogen </td><td> 21985023 </td><td></td></tr><tr><td> Albumax </td><td> Invitrogen </td><td> 11020021 </td><td></td></tr><tr><td> 아스코르비 산 </td><td> 시그마 </td><td> A4403 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 트랜스페린 </td><td> 시그마 </td><td> T8158 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 bFGF </td><td> PeproTech </td><td> AF - 100 - 18B </td><td></td></tr><tr><td> 인간 인슐린 </td><td> Invitrogen </td><td> 12585014 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 activin </td><td> PeproTech </td><td> 120 14E </td><td></td></tr><tr><td> 인간 BDNF </td><td> PeproTech </td><td> AF - 450-02 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 VEGF </td><td> PeproTech </td><td> AF - 100-20 </td><td></td></tr><tr><td> 인간 NT - 3 </td><td> PeproTech </td><td> 450-03 </td><td></td></tr><tr><td> 헤파린 </tD&gt; <td> 시그마 </td><td> H5284 </td><td></td></tr><tr><td> N - 2 보충제 (100X) </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td><td></td></tr><tr><td> 6 잘 ultralow 첨부 플레이트 </td><td> 코닝 </td><td> 3471 </td><td></td></tr><tr><td> 6 - 잘 플레이트 </td><td> 코닝 </td><td> 3516 </td><td></td></tr></tbody></table>

efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction

수리 또는 손상된 중추 신경계의 재생 (CNS) 구조와 오늘날의 의료 산업에서 회로에 대한 임상 - 적합한 인간의 연결을 세포 소스에 대한 큰 이루어지지 않은 필요가있다. 세포 기반 요법은 CNS 장애에 대한 손실 신경 조직과 기능을 복원하는 큰 약속을 잡아. 그러나, CNS - 파생 신경 줄기 세포에 따라 세포 요법은 공급 제한 및 인한 광범위한 passaging 1-3 이후 문화와 실패 소성에서 제한된 확장 능력에 임상 설정에 사용하는 데 어려움이 발생했습니다. 일부 이익 결과에도 불구하고, CNS - 파생된 인간의 신경 줄기 세포 (hNSCs)는 내생 세포가 1-3 구조로 생산 영양과 neuroprotective 분자를 통해 주로 자신 이외의 연결을 progenies함으로써 치료 효과를 발휘하기 위해 나타납니다. supplyin에 의해 신경 질환의 광범위한 양자 택일로, pluripotent 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 proffer의 치료g 중생 1,4-7에 대한 개발 CNS 인간의 연결을 세포 유형의 다양성. 그러나, 원하는 표현형에 효율적이고 예측할 수 pluripotent hESCs의 다양한 차별의 가능성을 채널하는 방법을 개발 연구와 임상 번역 모두에 큰 도전을했습니다. 종래의 접근 방식은 종종 phenotypic 이질과 불안정, 따라서, tumorigenicity 7-10 높은 위험을 따라 비효율적과 지나치게 혈통 - 노력의 결과로, 자연 배아 계층 분화를 통해 pluripotent 세포의 멀티 혈통 기울기에 의존하고 있습니다. 또한, 정의되지 않은 외국인 / 동물 생물 학적 보조 및 / 또는 일반적으로 격리, 확장, 그리고 hESCs의 분화에 사용되었습니다 모이통는 11-13 문제 환자에서 이러한 세포 이식 전문 직접 사용할 수 있습니다. 이러한 장애물을 극복하기 위해, 우리는 필요한 s에 대한 충분한 정의된 문화 시스템의 요소를 해결임상 - 적절한 hESCs의 드 노보 유도를위한 플랫폼으로 제공, hESCs의 epiblast의 pluripotence을 ustaining하고 효과적으로 작은 분자 14 (그림 설계도를 참조하시기 바랍니다. 1)에 의해 임상 - 관련 lineages으로 균일하게 같은 hESCs을 지휘. Retinoic 산 (RA)는 모이통 1, 14 일 유지 undifferentiated hESCs의 분화를 유도의 연결하지 않습니다. 그리고 마우스 ESCs와는 달리, hESC - 차별화 embryoid기구 (EBS)을 치료 것은 약간 뉴런 1, 14, 15의 낮은 수확량을 증가시킵니다. 그러나, 작은 분자 및 성장 요인의 다양한 상영 후, 우리는 이러한 정의 조건이 더 이상 인간의 연결을 progenitors과에서 뉴런을 생성 neuroblasts로 진행 pluripotent hESCs에서 직접 neuroectoderm의 사양을 유발하는 retinoic 산성 (RA)가 충분한 렌더링 발견 고효율 발전 CNS (그림 2). 우리는 신경의 유도에 대한 조건을 정의세포 기반 치료제에 대한 개발 단계의 스펙트럼에 걸쳐 인간의 연결을 세포의 대형 공급 잘 제어 효율적인 파생을 가능하게 개입 멀티 혈통 embryoid 바디 단계없이 pluripotent hESCs에서 직접 폭발.

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Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

efficient-derivation-human-neuronal-progenitors-neurons-from

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.3K 조회수.  San Diego Regenerative Medicine Institute. 우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

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DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

로던트에서 뉴런과 비 인간 메이트 뇌 조각의 DiOLISTIC 라벨링

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

연구

신경과학

The Specification of Telencephalic Glutamatergic Neurons from Human Pluripotent Stem Cells

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The differentiation process is initiated by breaking the human PSCs into clumps which round up to form aggregates when the cells are placed in a suspension culture. The aggregates are then grown in hESC medium from days 1-4 to allow for spontaneous differentiation. During this time, the cells have the capacity to become any of the three germ layers. From days 5-8, the cells are placed in a neural induction medium to push them into the neural lineage. Around day 8, the cells are allowed to attach onto 6 well plates and differentiate during which time the neuroepithelial cells form. These neuroepithelial cells can be isolated at day 17. The cells can then be kept as neurospheres until they are ready to be plated onto coverslips. Using a basic medium without any caudalizing factors, neuroepithelial cells are specified into telencephalic precursors, which can then be further differentiated into dorsal telencephalic progenitors and glutamatergic neurons efficiently. Overall, our system provides a tool to generate human glutamatergic neurons for researchers to study the development of these neurons and the diseases which affect them.

This procedure yields telencephalic neurons by going through checkpoints which are similar to those observed during human development. The cells are allowed to spontaneously differentiate, are exposed to factors which push them towards the neural lineage, are isolated, and are plated onto coverslips to allow for terminal differentiation and maturation.

인간 만능의 줄기 세포에서 Telencephalic Glutamatergic 뉴런의 사양

Here, a stepwise procedure for efficiently generating telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells (PSCs) has been described. The ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Directed Dopaminergic Neuron Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in Parkinson&#8217;s disease (PD). There is great interest in deriving A9 DA neurons from human pluripotent stem cells (hPSCs) for regenerative cell replacement therapy for PD. During neural development, A9 DA neurons originate from the floor plate (FP) precursors located at the ventral midline of the central nervous system. Here, we optimized the culture conditions for the stepwise differentiation of hPSCs to A9 DA neurons, which mimics embryonic DA neuron development. In our protocol, we first describe the efficient generation of FP precursor cells from hPSCs using a small molecule method, and then convert the FP cells to A9 DA neurons, which could be maintained in vitro for several months. This efficient, repeatable and controllable protocol works well in human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) from normal persons and PD patients, in which one could derive A9 DA neurons to perform in vitro disease modeling and drug screening and in vivo cell transplantation therapy for PD.

We, based on knowledge from developmental biology and published research, developed an optimized protocol to efficiently generate A9 midbrain dopaminergic neurons from both human embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells, which would be useful for disease modeling and cell replacement therapy for Parkinson&#8217;s disease.

인간의 다 능성 줄기 세포에서 도파민 신경 세포의 분화를 감독

Dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra pars compacta  (also known as A9 DA neurons) are the specific cell type that is lost in ...

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

PiggyBac 벡터를 사용 하 여 기능적 척추 및 두개골 모터 뉴런으로의 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)의 전환

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Derivation, Expansion, Cryopreservation and Characterization of Brain Microvascular Endothelial Cells from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models for studying blood-brain barrier (BBB) function. This modified protocol provides detailed steps to derive, expand, and cryopreserve BMECs from human iPSCs using a different donor and reagents than those reported in previous protocols. iPSCs are treated with essential 6 medium for 4 days, followed by 2 days of human endothelial serum-free culture medium supplemented with basic fibroblast growth factor, retinoic acid, and B27 supplement. At day 6, cells are sub-cultured onto a collagen/fibronectin matrix for 2 days. Immunocytochemistry is performed at day 8 for BMEC marker analysis using CLDN5, OCLN, TJP1, PECAM1, and SLC2A1. Western blotting is performed to confirm BMEC marker expression, and absence of SOX17, an endodermal marker. Angiogenic potential is demonstrated with a sprouting assay. Trans-endothelial electrical resistance (TEER) is measured using chopstick electrodes and voltohmmeter starting at day 7. Efflux transporter activity for ATP binding cassette subfamily B member 1 and ATP binding cassette subfamily C member 1 is measured using a multi-plate reader at day 8. Successful derivation of BMECs is confirmed by the presence of relevant cell markers, low levels of SOX17, angiogenic potential, transporter activity, and TEER values ~2000 &#937; x cm2. BMECs are expanded until day 10 before passaging onto freshly coated collagen/fibronectin plates or cryopreserved. This protocol demonstrates that iPSC-derived BMECs can be expanded and passaged at least once. However, lower TEER values and poorer localization of BMEC markers was observed after cryopreservation. BMECs can be utilized in co-culture experiments with other cell types (neurons, glia, pericytes), in three-dimensional brain models (organ-chip and hydrogel), for vascularization of brain organoids, and for studying BBB dysfunction in neuropsychiatric disorders.

This protocol details an adapted method to derive, expand, and cryopreserve brain microvascular endothelial cells obtained by differentiating human induced pluripotent stem cells, and to study blood brain barrier properties in an ex vivo model.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 뇌 미세 혈관 내피 세포의 파생, 확장, 냉동 보존 및 특성화

Brain microvascular endothelial cells (BMECs) can be differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) to develop ex vivo cellular models ...

Subretinal Transplantation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Tissue in a Feline Large Animal Model

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and Leber Congenital Amaurosis (LCA) cause progressive and debilitating vision loss. There is an unmet need for therapies that can restore vision once photoreceptors have been lost. Transplantation of human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue (organoids) into the subretinal space of an eye with advanced RD brings retinal tissue sheets with thousands of healthy mutation-free photoreceptors and has a potential to treat most/all blinding diseases associated with photoreceptor degeneration with one approved protocol. Transplantation of fetal retinal tissue into the subretinal space of animal models and people with advanced RD has been developed successfully but cannot be used as a routine therapy due to ethical concerns and limited tissue supply. Large eye inherited retinal degeneration (IRD) animal models are valuable for developing vision restoration therapies utilizing advanced surgical approaches to transplant retinal cells/tissue into the subretinal space. The similarities in globe size, and photoreceptor distribution (e.g., presence of macula-like region area centralis) and availability of IRD models closely recapitulating human IRD would facilitate rapid translation of a promising therapy to the clinic. Presented here is a surgical technique of transplanting hPSC-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model allowing assessment of this promising approach in animal models.

Presented here is a surgical technique for transplanting human pluripotent stem cell (hPSC)-derived retinal tissue into the subretinal space of a large animal model.

고양이과 거대 동물 모델에서 인간 배아 줄기 세포 유래 망막 조직의 망막하 이식

Retinal degenerative (RD) conditions associated with photoreceptor loss such as age-related macular degeneration (AMD), retinitis pigmentosa (RP) and ...

Generation of Human Neurons and Oligodendrocytes from Pluripotent Stem Cells for Modeling Neuron-Oligodendrocyte Interactions

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it contributes to disease development and progression, particularly in the gray matter of the brain, remains largely unknown. The dysfunction of oligodendrocyte lineage cells is hallmarked by deficiencies in myelination and impaired self-renewal of oligodendrocyte precursor cells (OPCs). These two defects are caused at least in part by the disruption of interactions between neuron and oligodendrocytes along the buildup of pathology. OPCs give rise to myelinating oligodendrocytes during CNS development. In the mature brain cortex, OPCs are the major proliferative cells (comprising ~5% of total brain cells) and control new myelin formation in a neural activity-dependent manner. Such neuron-to-oligodendrocyte communications are significantly understudied, especially in the context of neurodegenerative conditions such as AD, due to the lack of appropriate tools. In recent years, our group and others have made significant progress to improve currently available protocols to generate functional neurons and oligodendrocytes individually from human pluripotent stem cells. In this manuscript, we describe our optimized procedures, including the establishment of a co-culture system to model the neuron-oligodendrocyte connections. Our illustrative results suggest an unexpected contribution from OPCs/oligodendrocytes to the brain amyloidosis and synapse integrity and highlight the utility of this methodology for AD research. This reductionist approach is a powerful tool to dissect the specific hetero-cellular interactions out of the inherent complexity inside the brain. The protocols we describe here are expected to facilitate future studies on oligodendroglial defects in the pathogenesis of neurodegeneration.

The neuron-glial interactions in neurodegeneration are not well understood due to inadequate tools and methods. Here, we describe optimized protocols to obtain induced neurons, oligodendrocyte precursor cells, and oligodendrocytes from human pluripotent stem cells and provide examples of the values of these methods in understanding cell-type-specific contributions in Alzheimer&#8217;s disease.

뉴런-희소돌기아교세포 상호작용 모델링을 위한 만능줄기세포로부터 인간 뉴런 및 희소돌기아교세포 생성

In Alzheimer&#8217;s disease (AD) and other neurodegenerative disorders, oligodendroglial failure is a common early pathological feature, but how it ...

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple neurological diseases. Studying human microglia in health and disease represents a challenge due to the extremely limited supply of human cells. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) derived from human individuals can be used to circumvent this barrier. Here, it is demonstrated how to differentiate human iPSCs into microglia-like cells (iMGs) for in vitro experimentation. These iMGs exhibit the expected and physiological properties of microglia, including microglia-like morphology, expression of proper markers, and active phagocytosis. Additionally, documentation for isolating and labeling synaptosome substrates derived from human iPSC-derived lower motor neurons (i3LMNs) is provided. A live-cell, longitudinal imaging assay is used to monitor engulfment of human synaptosomes labeled with a pH-sensitive dye, allowing for investigations of iMG's phagocytic capacity. The protocols described herein are broadly applicable to different fields that are investigating human microglia biology and the contribution of microglia to disease.

Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes

This protocol describes the differentiation process of human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into microglia-like cells for in vitro experimentation. We also include a detailed procedure for generating human synaptosomes from iPSC-derived lower motor neurons that can be used as a substrate for in vitro phagocytosis assays using live-cell imaging systems.

인간 미세아교세포 유사 세포: 유도만능줄기세포로부터의 분화 및 인간 시냅토좀을 이용한 체외 생세포 식균작용 분석

Microglia are the resident immune cells of myeloid origin that maintain homeostasis in the brain microenvironment and have become a key player in multiple ...