Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health (U54CA143906 a KGP, OJTM e R01HL101972 a OJTM) e una Fondazione per la Ricerca Medica dell&#39;Oregon anticipata Clinical Investigator Award (KGP). OJTM è un investigatore Fondata American Heart Association (13EIA12630000). Ringraziamo il Dott. Eric Anderson Cancer Institute Cavaliere per la preparazione di campioni di cellule utilizzate in questo lavoro.

1. Microscopio Specifiche Per eseguire l&#39;imaging nel modo corretto, il microscopio dovrebbe avere le seguenti specifiche: <ol><li> Possedere entrambi contrasto di interferenza differenziale (DIC) e campo chiaro (BF) contrasto. </li><li> Avere movimento asse z controllato da computer. </li><li> Avere un diaframma regolabile per variare l&#39;apertura numerica della lente condensatore. Un&#39;apertura con una regola graduata o lettura elettronica è tenuto a conoscere il valore della apertura numerica. L&#39;apertura numerica deve variare da 0,1 per NIQPM fino a 0.9 (o superiore) per HTDIC. </li><li> Il microscopio dovrebbe avere un filtro di colore a banda stretta per essere utilizzato per l&#39;imaging campo chiaro. Questo filtro è tenuta a fissare l&#39;incremento di rifrazione, una fabbricazione lunghezza d&#39;onda dipendente utilizzato per convertire fase della densità di massa per NIQP. </li></ol> 2. Interferenza differenziale contrasto (DIC) Acquisizione Z-stack <ol><li> Aprire il software SlideBook unnd creare una nuova diapositiva per raccolta di immagini. </li><li> Quindi, aprire la finestra di Focus. Nella sezione Filter Set selezionare DIC. Nella scheda Ambito, nella sezione condensatore, regolare la barra di scorrimento Aperture per la più giusta posizione (aperto tutto il senso). Questo fornisce alta numerico illuminazione dell&#39;apertura e migliora sezionamento ottico del campione. </li><li> Focus sul campione utilizzando un obiettivo DIC. Regolare l&#39;intensità della lampada alogena finché il campione è facilmente visibile. Per assicurare che la fotocamera non viene saturato, selezionare la scheda della fotocamera nella finestra di messa a fuoco e verificare che l&#39;istogramma di intensità dei pixel è all&#39;interno del range dinamico della telecamera. </li><li> Aprire la finestra Acquisizione Immagine. Nella sezione Tipo di ripresa, selezionare la casella 3D. Nella sezione Capture 3D, selezionare l&#39;intervallo intorno al centro e torna alla posizione attuale </strong&gt; caselle e specificare l&#39;intervallo direzione Z, numero di aerei, e passo. La gamma Z-direzione dovrebbe includere l&#39;intero campione. </li><li> Nella sezione Filtro Set della finestra Acquisizione Immagine, selezionare la casella DIC e specificare il tempo di esposizione. Nella sezione Informazioni dell&#39;immagine, il nome dell&#39;immagine (opzionale), e selezionare Start per avviare il imaging. </li></ol> 3. Campo chiaro (BF) Acquisizione Z-stack <ol><li> Una volta che il microscopio ha finito di raccogliere il DIC Z-stack del campione, aprire la finestra Focus e selezionare Apri nella sezione Filter Set. Regolare la barra di scorrimento Aperture per la posizione più a sinistra (chiuso tutto il senso) per fornire l&#39;illuminazione bassa NA. </li><li> Cambiare il filtro di luce-path microscopio a verde. Regolare l&#39;intensità della lampada alogena finché il campione è visibile. Assicurarsi che non vi è saturazione della fotocamera selezionando la <strong&gt; scheda telecamera nella finestra di messa a fuoco e verificando che l&#39;istogramma di intensità dei pixel è entro l&#39;intervallo specificato. </li><li> Aprire la finestra Acquisizione Immagine. Verranno visualizzate le impostazioni di acquisizione 3D DIC acquisizione Z-stack. </li><li> Nella sezione Filtro Set della finestra Acquisizione Immagine, selezionare la casella OPEN e specificare il tempo di esposizione. Nella sezione Informazioni dell&#39;immagine, il nome dell&#39;immagine (opzionale), e selezionare Start per avviare Z-stack acquisizione delle immagini. </li></ol> 4. Esportazione di Z-stack Immagini <ol><li> Aprire una cattura Z-stack. Modificare la visualizzazione al 100%. Regolare l&#39;istogramma dei valori di pixel da visualizzare tra 0 e il valore massimo del pixel della telecamera (4.095 per telecamere 12 bit, 65.535 per 16 bit.). </li><li> Selezionare Visualizza&gt; Esporta&gt; TIFF Series. Ciò esportare la Z-stack come una serie di immagini TIFF(Uno per ogni piano Z). Salvare la serie TIFF in una cartella separata con un nome che ha un carattere di sottolineatura alla fine (ad esempio &quot;DIC Stack 1_&quot;). Ripetere questa operazione con ogni DIC o BF Z-stack. </li></ol> 5. Misure Volume <ol><li> Aprire il programma HTDIC MATLAB intitolato &quot;JoVE_HTDIC_v1.m&quot;. </li><li> Sotto la sezione 0 del programma HTDIC, aggiornare la variabile directory dipendenze. Copia e incolla il directory contenente il hilbert_transform_dic.m e file sobel_edge_detect.m da Explorer (PC) tra le virgolette singole seguente &quot;dependencies_directory =&quot;. ExecuteSection 0 del programma JoVE_HTDIC_v1.m. </li><li> Nella sezione 1, aggiornare l&#39;&quot;images_directory&quot;. Ancora una volta, copiare e incollare la cartella contenente le immagini in-focus in. Forma tif tra le virgolette singole. SOLO RUN SEZIONE 1 VOLTA. </li><li> Allineamento e rotazione delle immagini per Hilbert trasformano Run sezione 2 del codice. Apparirà una finestra di dialogo intitolata &quot;Definisci HTDIC Parametri&quot;. Cinque numbers sono richiesti dall&#39;utente: il numero di piano focale dove l&#39;immagine DIC del campione è a fuoco, risoluzione laterale (micron / pixel nell&#39;immagine), la risoluzione assiale (questo è il 0,1 per l&#39;acquisizione di immagini a 0.1 micron fasi assiali), l&#39;angolo di rotazione dell&#39;immagine DIC necessario per eseguire la trasformata di Hilbert, valori tipici sono 45 e -135. Infine, inserire la regione di interesse dimensioni, questo parametro definisce la lunghezza di un lato di una scatola che appaiono successivamente - valore tipico è 400. Fare clic su OK. </li><li> Un&#39;immagine del piano focale DIC specificato dal numero di piano focale apparirà con una scatola blu. Posizionare la scatola sopra la caratteristica di interesse, ad esempio una cella. La scatola non deve essere quadrata. Una volta che il box è stato posizionato sopra la regione desiderata, fare doppio clic all&#39;interno della casella. </li><li> Un&#39;altra figura appare ora: questa figura contiene un&#39;immagine ritagliata e ruotata della regione di interesse selezionato nel passaggio precedente. Il contrasto dell&#39;immagine deve essere talecaratteristiche che scure sulla sinistra, mentre le caratteristiche luminose appaiono sulla destra. Trascinare la casella blu sopra la regione di interesse, rimodellare, se necessario. </li><li> Sezione 3 genera una maschera per il cubo z-stack. Ci sono due tipi di maschere disponibili: una maschera rettangolare per creare un rettangolo intorno alla cella e uno strumento a mano libera per delineare la cella di interesse a mano. </li><li> Per generare una maschera rettangolare, decommentare la linea 167 e commentare la linea 170 (commentare una linea fuori con un &quot;%&quot; all&#39;inizio della riga). Eseguire sezione 3 del programma. Fare clic nell&#39;immagine e trascinare il mouse per iniziare a definire la maschera rettangolare. Fare doppio clic sulla casella di accettarla. </li><li> Per generare una maschera disegnata a mano, commentare linea 167 e decommentare la linea 170 ed eseguire Sezione 3. Fare clic e disegnare la maschera desiderato con il mouse. Fare doppio clic sulla maschera di accettarla. </li><li> Sezione Eseguire 4to costruire la trasformata di Hilbert DIC pila di immagini e la corrispondente DIC pila immagine dell&#39;area di interesse.La maschera costruito nella Sezione 3 verrà applicato alla trasformata di Hilbert pila DIC e lo stack regolare DIC quando &quot;maskON&quot; è impostato a 1 alla riga 179. Impostazione &quot;maskON&quot; per 0 costruirà stack di immagini senza applicare la maschera. </li><li> Eseguire sezione 5 per ottimizzare la segmentazione dell&#39;immagine dei xz trasversali immagini sezionali della regione di interesse. Figura 500, prodotta dal programma, appare a visualizzare tre diversi tipi di contrasto. Il successo dell&#39;algoritmo per trovare i bordi della cella fa affidamento su una combinazione della maschera utilizzata e il valore di &quot;soglia&quot; alla riga 229 del programma. Iniziare con un valore di 0,5. Regolare il valore di soglia e rieseguire questa sezione del programma fino alla corretta delineazione è raggiunto in una delle colonne. </li><li> Se la delineazione era meglio nella colonna 1, utilizzare la sezione 6 per determinare il volume utilizzando DIC immagine segmentazione. Se colonna 2 ha dato risultati ottimali, sezione 7 per determinare il volume delle cellule da Hilbert-trasformata immagini DIC correre. Se colonna 3 gavE i risultati ottimali, eseguire la Sezione 8 per determinare il volume utilizzando Fourier filtrata Hilbert-trasformata immagini DIC. </li><li> Il volume di campione, riportato in micron cubico (fl) è presentato nel titolo della figura 600, 700, o 800 prodotto dal programma a seconda di quale viene scelto misura del volume. </li></ol> 6. Misure di massa <ol><li> Aprire il programma NIQPM MATLAB intitolato &quot;JoVE_NIQPM_v1.m&quot;. </li><li> Sotto la sezione 0 del programma NIQPM, aggiornare la posizione di tre directory necessarie per eseguire il programma. Questi sono i &quot;dependencies_directory&quot;, il &quot;brightfield_directory,&quot; e il &quot;dic_directory&quot;. </li><li> Avanti, sezione 1 eseguire. Questa sezione di codice genera un campo luminoso cubo del campo pieno di tutta la serie di immagini. SOLO RUN SEZIONE 1 VOLTA. </li><li> Avanti, Sezione 2 eseguire. Apparirà una finestra di dialogo intitolata &quot;Definisci NIQPM Parametri&quot;. Quattro numeri sono richiesti dall&#39;utente: il numero piano focale dove l&#39;immagine luminosa campo dellacampione è a fuoco, risoluzione laterale (micron / pixel nell&#39;immagine), la risoluzione assiale (questo è 0,1 per acquisizione immagini a 0,1 micron di passaggi assiali), e la regione di interesse dimensioni, questo parametro definisce la lunghezza di un lato di un dialogo che appaiono successivamente - un valore tipico è 200. Fare clic su OK. </li><li> Un&#39;immagine del piano focale campo luminoso specificato dal numero di piano focale apparirà con una scatola blu. <ol><li> Se l&#39;immagine non è a fuoco, fare doppio clic nella casella blu ed eseguire nuovamente sezione 2, assicurarsi di regolare il numero di piano focale nella finestra di dialogo. </li><li> Se l&#39;immagine è a fuoco, trascinare la casella blu intorno all&#39;immagine e ridimensionarlo selezionando i nodi della scatola e trascinandole come necessario. Posizionare la casella intorno la caratteristica di interesse, ad esempio un cellulare. La scatola non deve essere quadrata. Fare doppio clic all&#39;interno della casella di accettarla. </li></ol></li><li> Successivamente, eseguire Sezione 3 per costruire una pila di immagini in campo chiaro ritagliata nella regione di interesse. </li><li> Per generare la mappa di fase, pseudo immagine DIC e confronti con le immagini in campo chiaro e l&#39;immagine vera DIC, sezione 4 correre. </li><li> Con la pseudo DIC e DIC vere immagini il più possibile simili alla mappa di densità di massa, massa totale, e istogramma della densità cellulare possono essere determinati eseguendo Sezione 5a o 5b. Sezione 5 bis effettua il rilevamento automatico confine del campo - optimize &quot;soglia&quot; alla riga 300 - i valori tipici variano tra 0.1-1. Eseguire nuovamente questa sezione come necessario per ottimizzare il valore di soglia. Sezione 5b effettua la determinazione della massa, ecc dopo che l&#39;utente delinea la cella di interesse. </li></ol>

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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+Hilbert+transform+for+3D+visualization+of+differential+interference+contrast+microscope+images.">Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images.</a> J. Microsc. 199, 79-84 (2001).</li><li>Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+label-free+imaging+technique+for+the+quantification+of+thrombus+formation.">Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).</li></ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari nel lavoro presentato.

In generale, NIQPM è una tecnica di diffrazione limitata convalidata su percorso lunghezze ottiche vanno ,25-44,7. Validazione è stata eseguita su n = 1.596 sfere di polistirene variano in diametro 0,11-9,8 micron sospese in Fluoromount G (dati non mostrati). Cellule possiedono percorso lunghezze ottiche che vanno da quasi 0-7. Quando si misura la distribuzione della densità di un esemplare si può scoprire che l&#39;immagine pseudo DIC guarda bene mentre la mappa di densità possiede con...

L&#39;uso della microscopia ottica è ormai onnipresente nelle indagini di organismi cellulari. Grazie al loro basso endogeni di assorbanza e di scattering deboli strutture in spettro ottico visibile, le cellule non influenzano fortemente l&#39;ampiezza delle onde ottiche li attraversano e quindi appaiono semitrasparente quando ripreso con microscopi da campo luminoso standard. Campioni cellulari, tuttavia, rallentano onde ottiche viaggiano attraverso di loro in un modo che è linearmente correlata alla quantità di densità di massa locale in una particolare regione dello spazio attraverso il quale la luce viaggia. Utilizzo di questo sfasamento temporale eterogenea profilo o &quot;fase&quot; di onde ottiche trasmessi attraverso campioni microscopici è stato descritto nel 1935 da Frits Zernike 1 e sperimentale realizzato da Zernikein 1942 2. Zernike ha ricevuto il premio Nobel nel 1953 per questo risultato. Zeiss commercializzato questa modalità nel 1945 3. Nel 1955, Smith e NomarskVorrei presentare il loro lavoro iniziale per l&#39;uso 4 e 5 teoria di contrasto di interferenza differenziale (DIC) microscopio, una modalità che utilizza il gradiente spaziale di fase come un meccanismo di contrasto. DIC è stato commercializzato da Zeiss nel 1965in stretta collaborazione con Nomarski 6. Nel 1981, due laboratori hanno dimostrato il primo registrato cellule vive DIC immagini con l&#39;incorporazione di telecamere nel treno ottica del microscopio DIC 7, 8. L&#39;era di imaging cellulare dal vivo è nato. Da questo momento, l&#39;esecuzione sia contrasto di fase e DIC sui microscopi commerciali è sostanzialmente rimasta invariata. Questi metodi sono principalmente utilizzati dai biologi per produrre immagini di cellule a fini qualitativi: il monitoraggio della morfologia, il monitoraggio delle strutture subcellulari, e ricerche di dinamica della membrana 9. Queste tecniche sono di qualità nella loro configurazione &quot;off-the-shelf&quot; sia come fase e DIImmagini c sono funzioni arbitrarie della intensità della sorgente luminosa, le impostazioni ottica di illuminazione, e guadagno della telecamera CCD, gamma, e le impostazioni di esposizione. Una piccola legione di fisici e ingegneri ottici si è sforzata di rendere le modalità di imaging commerciali quantitativa. Tra i primi sforzi erano due lettere a Nature nel 1952 e nel 1953 in cui il medico-gir-biofisico Robert Barer dimostrato l&#39;uso della microscopia fase per determinare la massa secca cellulare delle cellule stimando sfasamenti attraverso questi tipi di cellule utilizzando un microscopio a fase disponibile in commercio 10, 11. Il campo ha sviluppato una moltitudine di tecniche nel corso degli anni successivi, basata soprattutto tre meccanismi di contrasto di base label-free: microscopia fase di 10,11, DIC microscopia 12-17, e in campo chiaro 18-22 per determinare ottica percorso di lunghezza, fase, massa densità, indice di rifrazione, e volume cellulare. In parallel, una vasta collezione di strumenti ottici personalizzati sono stati sviluppati dal 1950, e hanno fatto di vasta portata misurazioni ottiche che vanno da applicazioni in crescita del parassita 23, a documentare il ciclo cellulare da 24 a indagare le dinamiche della membrana dei globuli rossi 25. In particolare, negli ultimi dieci anni ha visto una ricchezza di microscopia quantitativa label-free in forma di microscopia fase di diffrazione 26, tomografica microscopio fase 27, digitale microscopia olografica 28, sensibile alla fase a coerenza ottica microscopio 29, spaziale microscopio interferenza della luce 30, Hilbert fase microscopia 31, e microscopia fase quantitativa 32. Nonostante i loro successi collettivi, questi strumenti non sono stati diffusi al campo più ampio dei ricercatori biologici a causa, principalmente, alla loro complessa strumentazione e requisiti di calcolo. Qui abbiamo DEscribe l&#39;uso di un microscopio ottico standard effettuare misurazioni quantitative di massa, volume e densità su campioni cellulari attraverso una combinazione di campo luminoso e DIC immaginario. Due approcci principali sono presentati: noninterferometric microscopia fase quantitativa (NIQPM), effettuare misurazioni di massa cellulare totale e la distribuzione subcellulare densità e trasformata di Hilbert differenziale microscopio a contrasto di interferenza (HTDIC), per determinare il volume. I vantaggi principali di NIQPM e HTDIC laici nella loro accessibilità tecnologica. Le condizioni di imaging necessaria per la corretta esecuzione rientrano nell&#39;ambito del normale funzionamento della maggior parte dei microscopi disponibili in commercio. Inoltre, gli algoritmi di post-processing sono stabili, veloce e robusto - essendo stato implementato in MATLAB utilizzando trasformata veloce di Fourier algoritmi (FFT) basate quando possibile. NIQPM è un metodo per ricostruire fase e la densità di massa assialmente integrata di celesemplari lular provenienti da campi immagini luminose. Sommatoria di questa densità di massa assialmente integrata sull&#39;area del campione si ottiene il tenore massa secca totale del campione. Il protocollo NIQPM si basa sulle fondamenta sperimentali previste dal Paganin e Nugent 18, 19 - in cui è stato dimostrato che il profilo fase di una cella potrebbe essere ricostruita dal passante focalizzazione campo chiaro immaginario del campione - e il lavoro teorico di Frank , Altmeyer, e Wernicke 20 - sulla soluzione dei modelli di onda retti in modo efficiente basata su FFT. Il collegamento di fase alla densità massa secca si basa sul lavoro da Barer 10, 11 e 33 Popescu. Informazioni volumetrica può essere ottenuta da passante fuoco DIC imagery sotto alte condizioni di illuminazione NA che consentono sezionamento ottico del campione lungo l&#39;asse ottico. Trasformata di Hilbert trattamenti sulle pile di immagini DIC aumenta notevolmentealgoritmi di rilevamento dei bordi per la localizzazione dei bordi del provino in tre dimensioni separando i valori di grigio di intensità campione da quelli dello sfondo. Questo lavoro nasce con Arinson et al. 34 sebbene abbiamo introdotto entrambi i metodi di filtraggio di Fourier per aumentare il contrasto e un metodo di rilevamento del bordo basato Sobel per l&#39;analisi volumetrica automatizzata del campione. Abbiamo anche convalidato HTDIC precedenza su sfere di polistirolo che variano nel formato dal limite di diffrazione fino a 20 micron di diametro 36. Mentre sia NIQPM e HTDIC sono tecnologicamente accessibili a causa del loro sviluppo sui microscopi commerciali, i metodi sono fondamentalmente limitate dalla configurazione hardware dei microscopi stessi. I limiti principali di queste tecniche sono duplici: slow z-stack tempo di acquisizione in ambiti commerciali, grazie alla traduzione di tutta la fase del campione in contrasto con appena la lente obiettivo, Attualmente limita l&#39;indagine dei fenomeni più veloce di circa 1 fotogramma / minuto, e in secondo luogo, gli effetti di diffrazione limitano l&#39;utilità di NIQPM e HTDIC agli oggetti che variano nel formato da 0,2 fino a 10 e 20 micron di diametro, rispettivamente. Quindi, il campione e le sue dinamiche temporali associati di interesse devono soddisfare determinate dimensioni e dei vincoli temporali per consentire l&#39;utilizzo di questi metodi su strumenti tipici &quot;off-the-shelf&quot;. Eccitante, la maggior parte dei campioni cellulari fissi sono prontamente studiate con questi metodi. Una panoramica del NIQPM e protocolli HTDIC sono indicati nella figura 1. Nella figura 2 si illustrano di imaging ottimale e subottimale attraverso fuoco in NA condizioni sia bassa e alta illuminazione sia per campo chiaro e DIC immagini. Figure 3 e 4 dimostrano la dipendenza dei parametri dell&#39;algoritmo NIQPM evidenziando implementazioni di successo e insuccesso. <strong&gt; Figura 5 illustra i passaggi necessari per l&#39;algoritmo di elaborazione delle immagini HTDIC e illustra l&#39;implementazione ottimale dell&#39;algoritmo per determinare il volume cellulare.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="675">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Zeiss Axio Imager 2 microscope</td>
			<td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germany</td>
			<td>Axio Imager D2</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green filter (&#955; = 540 &#177; 25 nm)</td>
			<td>Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont</td>
			<td>D540/25x</td>
			<td>Green filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SlideBook 5.5 software</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado</td>
			<td></td>
			<td>Image acquistion software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polystyrene microspheres</td>
			<td>Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN</td>
			<td>PS06N</td>
			<td>Polystyrene spheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>SouthernBiotech, Birmingham, Alabama</td>
			<td>0100-01</td>
			<td>Mounting media</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative optical microscopy: measurement of cellular biophysical features with a standard optical microscope

Descriviamo l&#39;uso di un microscopio ottico standard effettuare misurazioni quantitative di massa, volume e densità su campioni cellulari attraverso una combinazione di campo luminoso e interferenze immaginario contrasto differenziale. Due approcci principali sono presentati: noninterferometric microscopia fase quantitativa (NIQPM), effettuare misurazioni di massa cellulare totale e la distribuzione subcellulare densità e trasformata di Hilbert differenziale microscopio a contrasto di interferenza (HTDIC) per determinare il volume. NIQPM si basa su un modello semplificato di propagazione delle onde, chiamata approssimazione parassiale, con tre ipotesi di base: bassa apertura numerica (NA), illuminazione, diffusione deboli e debole assorbimento della luce da parte del campione. Fortunatamente, i campioni cellulari non colorati soddisfano questi presupposti e bassa illuminazione NA è facilmente raggiunti nei microscopi commerciali. HTDIC viene utilizzato per ottenere informazioni volumetrico da tramite a fuoco DIC immagini ad alta illumin NAcondizioni di cooperazione. Illuminazione elevata NA agevola la massima sezionamento del campione lungo l&#39;asse ottico. Trasformata di Hilbert di elaborazione dell&#39;immagine DIC su pile migliora notevolmente algoritmi di rilevamento del bordo per la localizzazione dei bordi del provino in tre dimensioni separando i valori di grigio di intensità campione da quelli dello sfondo. I vantaggi principali di NIQPM e HTDIC laici nella loro accessibilità tecnologica con microscopi &quot;off-the-shelf&quot;. Ci sono due limiti fondamentali di questi metodi: slow z-stack tempo di acquisizione in ambiti commerciali attualmente abroga l&#39;indagine dei fenomeni più veloce di 1 fotogramma / minuto, e in secondo luogo, gli effetti di diffrazione limitano l&#39;utilità di NIQPM e HTDIC agli oggetti da 0.2 fino a 10 (NIQPM) e 20 (HTDIC) micron di diametro, rispettivamente. Quindi, la dinamica dei campioni e la sua associata di interesse devono soddisfare certa dimensione e vincoli temporali per consentire l&#39;uso di questi metodi. Eccitante, cellula più fissoI campioni r sono prontamente studiate con questi metodi.

Corretta illuminazione campione durante passante fuoco acquisizione delle immagini è fondamentale per la corretta attuazione del NIQPM un algoritmi HTDIC nd. Nella figura 2 si illustrano alta e bassa illuminazione NA sia sotto DIC e contrasto campo chiaro di una sfera di polistirolo e la linea cellulare di adenocarcinoma del colon umano SW620. Figure 2A, 2C, 2I, e 2K dimostrano di imaging ottimale per NIQPM. Figure 2F, 2H, 2N e 2P dimo...

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Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

Quantitative Microscopia ottica: Misura di Biofisica Cellulare caratteristiche con un microscopio ottico standard

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

quantitative-optical-microscopy-measurement-cellular-biophysical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.4K Views.  Oregon Health & Science University, School of Medicine. We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of cellular mass, volume, and density through a combination of bright field and differential interference contrast imagery.

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Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

Tridimensionale con risoluzione ottica Microscopia fotoacustico

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Ricerca

Bioingegneria

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including skeletal muscle, bone and placenta. Contemporary studies demonstrate fusion of cells of the same type confers enhanced function. For example, when the trophoblast cells of the placenta fuse to form the syncytiotrophoblast, the syncytiotrophoblast is better able to transport nutrients and hormones across the maternal-fetal barrier than unfused trophoblasts1-4. More recent studies demonstrate fusion of cells of different types can direct cell fate. The "reversion" or modification of cell fate by fusion was once thought to be limited to cell culture systems. But the advent of stem cell transplantation led to the discovery by us and others that stem cells can fuse with somatic cells in vivo and that fusion facilitates stem cell differentiation5-7. Thus, cell fusion is a regulated process capable of promoting cell survival and differentiation and thus could be of central importance for development, repair of tissues and even the pathogenesis of disease.
Limiting the study of cell fusion, is lack of appropriate technology to 1) accurately identify fusion products and to 2) track fusion products over time. Here we present a novel approach to address both limitations via induction of bioluminescence upon fusion (Figure 1); bioluminescence can be detected with high sensitivity in vivo8-15. We utilize a construct encoding the firefly luciferase (Photinus pyralis) gene placed adjacent to a stop codon flanked by LoxP sequences. When cells expressing this gene fuse with cells expressing the Cre recombinase protein, the LoxP sites are cleaved and the stop signal is excised allowing transcription of luciferase. Because the signal is inducible, the incidence of false-positive signals is very low. Unlike existing methods which utilize the Cre/LoxP system16, 17, we have incorporated a "living" detection signal and thereby afford for the first time the opportunity to track the kinetics of cell fusion in vivo.
To demonstrate the approach, mice ubiquitously expressing Cre recombinase served as recipients of stem cells transfected with a construct to express luciferase downstream of a floxed stop codon. Stem cells were transplanted via intramyocardial injection and after transplantation intravital image analysis was conducted to track the presence of fusion products in the heart and surrounding tissues over time. This approach could be adapted to analyze cell fusion in any tissue type at any stage of development, disease or adult tissue repair.

A Cre-Lox P Recombination Approach for the Detection of Cell Fusion In Vivo

A method to track cell fusion in living organisms over time is described. The approach utilizes Cre-LoxP recombination to induce luciferase expression upon cell fusion. The luminescent signal generated can be detected in living organisms using biophotonic imaging systems with a sensitivity of detection of &tilde;1,000 cells in peripheral tissues.

Un Cre-Lox P approccio ricombinazione per la rilevazione di fusione cellulare In Vivo</em

The ability of two or more cells of the same type to fuse has been utilized in metazoans throughout evolution to form many complex organs, including ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and mechanical strength. These native collagen fibrils have a characteristic banding periodicity of ~67 nm and are formed in vivo through the hierarchical assembly of Type I collagen monomers, which are 300 nm in length and 1.4 nm in diameter. In vitro, by varying the conditions to which the monomer building blocks are exposed, unique structures ranging in length scales up to 50 microns can be constructed, including not only native type fibrils, but also fibrous long spacing and segmental long spacing collagen. Herein, we present procedures for forming the three different collagen structures from a common commercially available collagen monomer. Using the protocols that we and others have published in the past to make these three types typically lead to mixtures of structures. In particular, unbanded fibrils were commonly found when making native collagen, and native fibrils were often present when making fibrous long spacing collagen. These new procedures have the advantage of producing the desired collagen fibril type almost exclusively. The formation of the desired structures is verified by imaging using an atomic force microscope.

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Simple and reproducible procedures are described for making three structurally distinct collagen assemblies from a common commercially available Type I collagen monomer. Native type, fibrous long spacing or segmental long spacing collagen can be constructed by varying the conditions to which the 300 nm long and 1.4 nm diameter monomer building block is exposed.

In sintesi in vitro di Native, Spaziatura fibrosa lungo e segmentale collagene spaziatura lungo

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparazione di Mica supportati doppi strati lipidici per alta risoluzione microscopia ottica Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

Fluorescenza tempra di un vicino infrarosso Fluoroforo incapsulata all&#39;interno di liposomi come strumento per<em&gt; In Vivo</em&gt; Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Multicolor Fluorescence Detection for Droplet Microfluidics Using Optical Fibers

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as multiplex assays, enzyme evolution, and molecular biology enhanced cell sorting require the detection of two or more colors of fluorescence. Standard multicolor detection systems that couple free space lasers to epifluorescence microscopes are bulky, expensive, and difficult to maintain. In this paper, we describe a scheme to perform multicolor detection by exciting discrete regions of a microfluidic channel with lasers coupled to optical fibers. Emitted light is collected by an optical fiber coupled to a single photodetector. Because the excitation occurs at different spatial locations, the identity of emitted light can be encoded as a temporal shift, eliminating the need for more complicated light filtering schemes. The system has been used to detect droplet populations containing four unique combinations of dyes and to detect sub-nanomolar concentrations of fluorescein.

Multicolor fluorescence detection in droplet microfluidics typically involves bulky and complex epifluorescence microscope-based detection systems. Here we describe a compact and modular multicolor detection scheme that utilizes an array of optical fibers to temporally encode multicolor data collected by a single photodetector.

Multicolore fluorescenza Detection per Droplet microfluidica tramite fibre ottiche

Fluorescence assays are the most common readouts used in droplet microfluidics due to their bright signals and fast time response. Applications such as ...

Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. Recently, nanoparticles (NPs) have shown significant promise in the development of such delivery systems. Here, a liquid crystal NP (LCNP)-based delivery system has been employed for the controlled delivery of a water-insoluble dye, 3,3&#8242;-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO), from within the NP core to the hydrophobic region of a plasma membrane bilayer. During the synthesis of the NPs, the dye was efficiently incorporated into the hydrophobic LCNP core, as confirmed by multiple spectroscopic analyses. Conjugation of a PEGylated cholesterol derivative to the NP surface (DiO-LCNP-PEG-Chol) enabled the binding of the dye-loaded NPs to the plasma membrane in HEK 293T/17 cells. Time-resolved laser scanning confocal microscopy and F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging confirmed the passive efflux of DiO from the LCNP core and its insertion into the plasma membrane bilayer. Finally, the delivery of DiO as a LCNP-PEG-Chol attenuated the cytotoxicity of DiO; the NP form of DiO exhibited ~30-40% less toxicity compared to DiOfree delivered from bulk solution. This approach demonstrates the utility of the LCNP platform as an efficient modality for the membrane-specific delivery and modulation of hydrophobic molecular cargos.

A liquid crystal nanoparticle (LCNP) nanocarrier is exploited as a vehicle for the controlled delivery of a hydrophobic cargo to the plasma membrane of living cells.

Targeted membrana plasmatica di consegna di un idrofobo Cargo incapsulato in un cristallo nanoparticelle Carrier Liquid

The controlled delivery of drug/imaging agents to cells is critical for the development of therapeutics and for the study of cellular signaling processes. ...

Fabrication and Characterization of Optical Tissue Phantoms Containing Macrostructure

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By replicating the imaging environment, costly animal experiments to validate a technique may be circumvented. Predicting and optimizing the performance of in vivo and ex vivo imaging techniques requires testing on samples that are optically similar to tissues of interest. Tissue-mimicking optical phantoms provide a standard for evaluation, characterization, or calibration of an optical system. Homogenous polymer optical tissue phantoms are widely used to mimic the optical properties of a specific tissue type within a narrow spectral range. Layered tissues, such as the epidermis and dermis, can be mimicked by simply stacking these homogenous slab phantoms. However, many in vivo imaging techniques are applied to more spatially complex tissue where three dimensional structures, such as blood vessels, airways, or tissue defects, can affect the performance of the imaging system. 
This protocol describes the fabrication of a tissue-mimicking phantom that incorporates three-dimensional structural complexity using material with optical properties of tissue. Look-up tables provide India ink and titanium dioxide recipes for optical absorption and scattering targets. Methods to characterize and tune the material optical properties are described. The phantom fabrication detailed in this article has an internal branching mock airway void; however, the technique can be broadly applied to other tissue or organ structures.

Optical tissue phantoms are essential tools for calibration and characterization of optical imaging systems and validation of theoretical models. This article details a method for phantom fabrication that includes replication of tissue optical properties and three-dimensional tissue structure.

Fabbricazione e caratterizzazione dei fantasmi di tessuto ottico contenente macrostruttura

The rapid development of new optical imaging techniques is dependent on the availability of low-cost, customizable, and easily reproducible standards. By ...

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. Traditional light-sheet techniques involve the use of a single illumination beam directed orthogonally at sample tissue. Images of large samples that are produced using a single illumination beam contain stripes or artifacts and suffer from a reduced resolution due to the scattering and absorption of light by the tissue. This study uses a dual-sided illumination beam and a simplified CLARITY optical clearing technique for the murine heart. These techniques allow for deeper imaging by removing lipids from the heart and produce a large field of imaging, greater than 10 x 10 x 10 mm3. As a result, this strategy enables us to quantify the ventricular dimensions, track the cardiac lineage, and localize the spatial distribution of cardiac-specific proteins and ion-channels from the post-natal to adult mouse hearts with sufficient contrast and resolution.

This study uses a dual-sided illumination light-sheet fluorescence microscopy (LSFM) technique combined with optical clearing to study the murine heart.

Microscopia di fluorescenza di luce-foglio per lo studio del cuore murino

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Lo svolgimento di diverse modalità di Imaging con un microscopio a fluorescenza

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...