Ringraziamo il Prof. Kazuki Saito in RIKEN PSC e il dottor Bjoern Usadel in MPIMP utili per le discussioni. TT è supportato da una borsa di studio della Alexander von Humboldt Foundation.

1. Preparazione del campione <ol><li> Materiali vegetali vengono raccolte e immediatamente congelati. </li><li> Materiali vegetali sono congelati in polvere da mulino miscelatore (o malta) e conservati in provetta Falcon o tubo Eppendorf a -80 ° C. </li></ol> 2. Estrazione per Profiling Metabolite <ol><li> Aliquotare congelati materiale vegetale in una provetta Eppendorf da 2 ml. </li><li> Aggiungere 5 microlitri di tampone di estrazione per milligrammo di peso fresco di materiale vegetale congelato. </li><li> Aggiungi un metallo (o gilconia) palla e omogeneizzare di polvere congelata con il vibromulino per 2 min a 25 ls -1. </li><li> Centrifugare 10 min a 12.000 rpm. </li><li> Trasferire il supernatante in NANOSEP filtro centrifugo. </li><li> Centrifugare 2 min a 4.000 giri. </li><li> Trasferire il surnatante nuovo tubo Eppendorf, e conservare a -20 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol> 3. Profiling metabolita della LC-MS <ol><li> Impostare HPLC e controllare la temperatura del forno a colonna e vassoio campione. </li><li> Impostare condizioni di MS e verificare lo stato di vuoto e riscaldamento capillare. </li><li> Eseguire m / z calibrazione del rivelatore MS. </li><li> Trasferire di 50 microlitri di estratti di fiala di vetro per LC-MS. </li><li> Iniettare 5 pl di estratti di LC-MS. </li></ol> 4. Analisi dei dati <ol><li> Configurare Xcalibur o Metalign 4 e selezionare l&#39;analisi dei dati da elaborare. </li><li> Elaborare una tabella di picchi rilevati di tuo interesse in accordo con la classe composto in tabella I. </li><li> Identificare i picchi di co-eluizione dei composti standard. </li><li> Annotate rilevato picchi che utilizzano MS 2 analisi, studio della letteratura, ricerca del database metabolita (Figura 2, 12,13). </li></ol> 5. Previsione della via metabolica <ol><li> Costruire un percorso possibile con i composti rilevati. Previsione di percorso usando le annotazioni di punta dovrebbe essere basato sulla struttura chimica del composto rilevatos prevedendo il collegamento funzioni enzimatiche sulla via metabolica 13. Passaggi biosintetici Strutturare dovrebbe essere condotta con annotazione di picco preciso. Ma la determinazione della struttura chimica dettagliata, ad esempio zucchero parte, non è indispensabile in questa fase, perché la previsione di residuo di zucchero e posizione addotto è molto difficile identificare mediante analisi MS. Determinazione del tipo di zucchero come hexoside e pentoside saranno identificati mediante saggio enzimatico donatore di zucchero al ultima fase di progetto. Per lo più la costruzione di previsione del percorso deve essere eseguita come piccola molecola è intermedia di un più ampio molecola salvo nei taluni casi, come reazione di disidratazione. Elenco di peso atomico molecolare, per esempio 16 m / z per differenza tra-H e-OH frazione (ossidazione), 14 m / z (atomo di carbonio) per la differenza tra-OH e-OMe (metilazione) e 162 m / z ( MW-H 2 O) per esosi (glicosilazione), è utile per la previsione. Determinazionetipo di modifica con l&#39;analisi di correlazione delle specificità dei tessuti aiuta previsione di via metabolica. Database del percorso metabolico generale come ad esempio database KEGG ( <a href="http://www.genome.jp/kegg/" target="_blank">http://www.genome.jp/kegg/</a> ) e PlantCyc ( <a href="http://plantcyc.org/" target="_blank">http://plantcyc.org/~~V</a> ), è molto efficace per la previsione della via metabolica di tuo interesse. </li></ol> 6. Preparazione della lista con Gene ID Gene Arabidopsis ortologhe <ol><li> Download ID elenco gene dal database genomico. </li><li> Aggiungi ID Arabidopsis gene del gene ortologhe, in caso di vostro impianto di destinazione non è Arabidopsis. </li><li> Preparare una lista di geni nel pathway di interessi. Annotazione dei dati pathway di Arabidopsis e dati famiglia genica sono disponibili nel sito TAIR ( <a href="http://www.arabidopsis.org/" target="_blank">http://www.arabidopsis.org/~~V</a> ). Se avete preparato un elenco di Arabidopsis geni ortologhi, è possibile successivamente combiNE loro. </li></ol> 7. Co-ha espresso l&#39;analisi del gene <ol><li> Prova utilizzando l&#39;elenco preparato ID gene per cercare miglior database per il vostro percorso controllando la correlazione con coppie di geni ben noti nel percorso d&#39;interesse (tabella II). Se la co-espressione database o l&#39;espressione del gene del database non sono disponibili nello stabilimento di vostro interesse, Arabidopsis co-espressione del database deve essere utilizzato con una lista di geni ortologhi di Arabidopsis. In caso di orzo, riso, pioppo, frumento, Medicago e soia, co-espressione analisi di specie di piante possono essere utilizzati (Tabella II). </li><li> Costruire il quadro di riferimento per il vostro obiettivo co-espressione di rete basata sulle connessioni dei ben noti geni nel pathway di interessi. </li><li> Aggiungi geni candidati correlati (r &lt;0,4 ~ 0,90, nel valore approssimativo del valore del coefficiente fra le connessioni dei ben noti geni nel pathway d&#39;interesse) e verificare la loro annotazione gene nella tua prfamiglie edicted ai collegamenti di questa rete per la ricerca di geni i migliori candidati (Figura 3). Soglia di valore del coefficiente dovrebbe essere coordinata in funzione della struttura della rete e la densità di geni correlati. </li><li> Fanno la lista di geni che si è in grado di restringere come specializzato per il percorso di destinazione. </li><li> Controllare l&#39;espressione genica delle specificità d&#39;organo e le risposte allo stress dei vostri geni candidati. </li></ol> 8. L&#39;integrazione di tutte le informazioni per predire Nuovi percorsi <ol><li> Aggiungere geni ben caratterizzati che sono state usate per l&#39;interrogazione di co-espressione di analisi previsto via metabolica. </li><li> Controllare le parti non caratterizzate in questo percorso, ad esempio, non caratterizzato reazioni enzimatiche, le proteine ​​di trasporto e fattori di trascrizione. </li><li> Prevedere annotazione gene più adatto per questi passaggi mancanti non caratterizzate. </li><li> Combinare i risultati di profiling e di metabolita di geni candidati in silico geNE espressione basato sul percorso previsto. </li><li> Disporre i geni candidati sul sentiero previsto in base alla funzione del gene, per esempio, acetiltransferasi per metabolita acetilato, glicosiltransferasi per glicoside, P450 per i composti ossidati. Albero analisi filogenetica di sequenze amminoacidiche è utile per una famiglia genica ampio come P450 e glicosiltrasferasi. </li><li> Verificare la coerenza delle specificità dei tessuti o delle risposte di stress tra l&#39;accumulo di metaboliti e livello di espressione genica di geni candidati. </li><li> Controllare i collegamenti al metabolismo altro per fornire i geni del substrato e lo stress reattivi. </li></ol> 9. Esperimenti per l&#39;identificazione del gene mediante Bio-risorse <ol><li> Verificare la disponibilità di risorse biologiche per la facilitazione della sperimentazione per l&#39;identificazione del gene candidato. </li><li> Eseguire un esperimento per l&#39;identificazione della funzione del gene utilizzando risorse biologiche, quali biblioteca KO mutante e full-length cDNA library. Tsperimenta funzionale per l&#39;identificazione di geni con la preparazione di piante sovraespressione e mutanti knockout, analisi enzimatica e analisi promotore vincolanti, devono essere eseguiti per i geni migliori candidati nel vostro pronostico. Proteina ricombinante saggio per la caratterizzazione delle proprietà della proteina e la preparazione di piante sovraespressione meglio essere effettuata dopo la conferma del profilo dei metaboliti utilizzando KO mutante poiché richiede molto più per preparare proteina ricombinante e la clonazione del gene per la trasformazione. </li></ol> 10. Risultati rappresentativi La procedura di analisi integrato descritto in questo protocollo ha molte possibilità a seconda della specifica finalità sperimentali e la scelta di combinazioni biologiche ed analitiche. Scelta delle procedure e il disegno sperimentale deve essere effettuata correttamente, sulla base del percorso di destinazione, i composti e specie vegetali. La strategia di integrazione descritto in questo protocollo è foc<html> utilizzato su annotazione della funzione dell&#39;impianto gene e la scoperta di nuove funzioni dei geni, con un uso efficiente di diversi bio-dati e delle risorse. Risultato atteso è promesso di fornire l&#39;unico caso della previsione definitiva. Questo fatto indica che, se prove sufficienti non può essere dato da profili di combinazione, l&#39;esperimento non deve essere iniziato. Per questo motivo, in ogni caso, ulteriori esperimenti preliminari quali profili di espressione genica mirata di RT-PCR, possono supportare la previsione della funzione del gene. La precisione e la correttezza della predizione correla superiore in funzione della differenza qualitativa e il numero di variazione della combinazione. Inoltre, i candidati risultati buoni e validi può venire solo dalla previsione accurata dei percorsi. Annotazione di picco dovrebbe essere condotta con la combinazione di diversi approcci, per il rilevamento ad esempio la letteratura, estratto della pianta di riferimento, MS n, la specificità d&#39;organo e l&#39;analisi mutante 13. 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Panoramica del flusso sperimentale di annotazione genica tramite approccio combinato. In alcuni casi, i progetti iniziano con la scoperta di un picco romanzo che viene rilevato in condizioni particolari o tessuti, e il desiderio di capire il suo ruolo all&#39;interno del suo metabolismo. In altri casi lo scopo del progetto è l&#39;identificazione del gene o la scoperta dei principali fattori di regolazione, quali fattori di trascrizione. Progettazione di esperimento dovrebbe essere piallato con una serie di dati che mostra chiare differenze dei livelli di metabolita nel vostro percorso di destinazione, utilizzando una vasta gamma di campioni di tessuto da organi diversi, e per le piante coltivate in modo differenziale o piante esposte a condizioni di stress, e sottoponendo il materiale a profiling metabolita. Le piante mutanti e transgeniche, nonché QTL materiale di riproduzione ospitare anche rappresentare adatto materiale genetico per questi studi. Previsione del percorso romanzo deve essere effettuata accuratamente con accurateannotazione di picco e l&#39;approccio combinazione con diversi tipi di metabolotype come i titoli di organi e risposte allo stress secondo i dati di espressione genica del vostro percorso d&#39;interesse. Nell&#39;ultimo passaggio, profiling metabolita e trascrizione deve essere effettuata che alla fine, quando combinato con analisi in silico di web-risorse e caratterizzazione in vitro di espressione genica mediante espressione eterologa, portano alla conferma del gene candidato e la spiegazione della sua funzione e posizione all&#39;interno di una via metabolica. Abbreviazioni: QTL, i loci di caratteri quantitativi. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig2.jpg" /> Figura 2. Il flusso di lavoro di approccio combinatorio per l&#39;annotazione di picco. Una procedura per l&#39;identificazione di picco e annotazione dal composto standard, confronto tra wild type e mutanti knock out, multi-dimensionale spettrometria di massa del picco target di riferimento agli spettri di massa di pura comlibra dai database 12. Abbreviazioni: DB, database; KO, knock-out, 1-D, uno-dimensionali; 2-D, bidimensionali, NMR, risonanza magnetica nucleare, IR, infrarossi; MS n, di massa di massa spectrometries. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3487/3487fig3.jpg" /> Figura 3. Esempio coregolamentazione analisi rete del percorso antocianine. Coespressione analisi sono state eseguite utilizzando il PRIME ( <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> ) sulla base dei dati impostati di versione ATTEDII 3 8,2 con l&#39; Pajek programma ( <a href="http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/" target="_blank">http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/</a> ). Correlazioni positive (r &lt;0,5) sono utilizzati per stabilire connessioni di rete. Red nodo: dodici geni enzimatici (antociani At5g13930, CHS e TT4, calcone sintasi, At3g55120, CHI, TT5, calcone isomerise; At3g51240, F3H, TT6, flavanone 3-idrossilasi; At5g07990, F3&#39;H, TT7, flavonoide 3&#39;-idrossilasi; At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, flavonoide 3 - O-glucosiltransferasi; At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, DFR, TT3, diidroflavonolo reduttasi, At4g22880, ANS / LDOX, TT18, Antocianidina Synthese; At4g14090, A5GT, antociani 5 - O-glucosiltransferasi; At5g54060, A3G2 &quot;XT, putativo antociani 3 - O-glucoside 2&quot; - O - xylosyltransferase; At3g29590, A5GMaT, antociani 5 - O-glucoside 6&#39;&#39; &#39;- O-malonyltransferase; At1g03940, A3GCouT, antociani 3 - O-glucoside 6 &quot;- O - P-coumaroyltransferase) e due fattori di trascrizione per la produzione di antocianine (At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2) è stato utilizzato per la ricerca di geni candidati geni candidati sono stati trovati da un &quot;intersezione di insiemi&quot; ricerca con un valore di soglia con un coefficiente di r &lt;./ Em &gt;&gt; 0,50 interrogato dalla intersezione di scene di tutti i geni interrogato (quattordici geni biosintetici antociani). A co-espressione della rete, compresi i geni candidati correlati (68 geni) e di geni interrogati (14 geni), è stato ricostruito da un &quot;interconnessione di insiemi&quot; di ricerca con r&gt; 0.50 utilizzando il database PRIME. I file di output che sono stati formattati con un file &#39;. Net&#39; dal database PRIME e delle reti sono stati elaborati utilizzando il software Pajek. Nodo blu indica geni candidati, che con i geni correlati antociani. <table border="1"><tbody><tr><td> specie </td><td> Maggiore secondaria metabolita </td></tr><tr><td> Arabidopsis thaliana </td><td> Glucosinolati, flavonoli, antociani, derivato sinapoyl </td></tr><tr><td> Populus trichocarpa </td><td> Flavonoli, antociani, derivato salicilato </td></tr><tr><td> Vitis vinifera </td><td> Flavonoli, antociani, tannini, stilbene </td></tr><tr><td> Solanum lycopersicum </td><td> Flavonoli, antociani, glycoalkaloid, chrologenate correlato, </td></tr><tr><td> Nicotiana tabacum </td><td> Flavonoli, antociani, nicotianamide, chrologenate correlato, acylsugar </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td> Glycoflavone, antociani, steroli derivati </td></tr><tr><td> Zea maggio </td><td> Glycoflavone, antociani, benzoxazinone, derivati ​​degli steroli </td></tr><tr><td> Medicago truncatula </td><td> Isoflavoni, antociani, saponina, </td></tr><tr><td> Japonica Lotus </td><td> Isoflavone, flavonoli, antociani, saponina, </td></tr></tbody></table> Tabella I. principali metaboliti secondari in specie vegetali modello. <table border="1"><tbody><tr><td> Co-espressione di database </td><td> Indirizzo </td></tr><tr><td> Pianta a croce specIES </td><td></td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V</a> </td></tr><tr><td> PlaNet </td><td> <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> Specie vegetali </td><td></td></tr><tr><td> ATEED-II </td><td> <a href="http://atted.jp/" target="_blank">http://atted.jp/</a> </td></tr><tr><td> BAR </td><td> <a href="http://142.150.214.117/welcome.htm" target="_blank">http://142.150.214.117/welcome.htm</a> </td></tr><tr><td> COP </td><td> <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop</a> </td></tr><tr><td> GeneCAT </td><td> <a href="http://genecat.mpg.de/" target="_blank">http://genecat.mpg.de/</a> </td></tr><tr><td> Arabidopsis </td><td></td></tr><tr><td> ACT </td><td> <a href="http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser" target="_blank">http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser</a> </td></tr><tr><td> AthCoR@CSB.DB </td><td> <a href="http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html" target="_blank">http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html</a> </td></tr><tr><td> CressExpress </td><td> <a href="http://cressexpress.org/" target="_blank">http://cressexpress.org/~~V</a> </td></tr><tr><td> PRIME </td><td> <a href="http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index" target="_blank">http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index</a> </td></tr><tr><td> Oryza sativa </td><td></td></tr><tr><td> RiceArrayNet </td><td> <a href="http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/" target="_blank">http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V</a> </td></tr><tr><td> Rice Array Database </td><td> <a href="http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml" target="_blank">http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml</a> </td></tr></tbody></table> Tabella II. Disponibile banca dati di espressione genica in silico per la co-analisi di espressione.

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	<li>Aharoni, A., Keizer, L. C. P., Bouwmeester, H. J., Sun, Z. K., Alvarez-Huerta, M., Verhoeven, H. A., Blaas, J., van Houwelingen, A., De Vos, R. C. H., van der Voet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SAAT+gene+involved+in+strawberry+flavor+biogenesis+by+use+of+DNA+microarrays.">SAAT gene involved in strawberry flavor biogenesis by use of DNA microarrays.</a> Plant Cell. 12, 647-661 (2000).</li><li>Akiyama, K., Chikayama, E., Yuasa, H., Shimada, Y., Tohge, T., Shinozaki, K., Hirai, M. Y., Sakurai, T., Kikuchi, J., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PRIMe:+a+Web+site+that+assembles+tools+for+metabolomics+and+transcriptomics.">PRIMe: a Web site that assembles tools for metabolomics and transcriptomics.</a> In Silico Biol. 8, 339-345 (2008).</li><li>Araujo, W. 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R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+storage+metabolome:+profiling+the+barley+vacuole.">Towards the storage metabolome: profiling the barley vacuole.</a> Plant Physiol. , (2011).</li><li>Yonekura-Sakakibara, K., Tohge, T., Matsuda, F., Nakabayashi, R., Takayama, H., Niida, R., Watanabe-Takahashi, A., Inoue, E., Saito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+flavonol+profiling+and+transcriptome+coexpression+analysis+leading+to+decoding+gene-metabolite+correlations+in+Arabidopsis.">Comprehensive flavonol profiling and transcriptome coexpression analysis leading to decoding gene-metabolite correlations in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20, 2160-2176 (2008).</li></ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Dato che trascrittomica metabolomica e le tecnologie sono state utilizzate per diversi anni, il processo di integrazione dei dati per la metabolomica assistiti annotazione gene inizia generalmente con l&#39;identificazione di un picco romanzo rappresenta un metabolita sconosciuto. Questo fatto porta alla fase successiva, che è quello di valutare la varianza quantitativa picchi metabolita o dei nuovi geni candidati ritenuti responsabili per il loro biosintesi. La strategia descritta in questo protocollo, tuttavia, ha tre problemi principali i) difficoltà di annotazione picco, ii) complessità di predizione percorso, iii) la risoluzione delle informazioni gene e la qualità dei dati di espressione genica. Per contrastare il primo problema, l&#39;annotazione di picco deve essere eseguita con il co-eluizione di composti standard o le informazioni approccio combinatorio che utilizza da MS n analisi, estratto di riferimento, l&#39;analisi mutante, ricerca su database metabolita e rassegna della letteratura (Figura 2, 12). Per il seconda problema, la previsione di percorso può essere ottenuto soltanto con annotazione di picco corretto. Tuttavia, profilatura metabolita della specificità del tessuto può anche essere picco annotazione supporto, perché accumulo metabolita deve essere correlata con le espressioni di geni correlati. Pertanto profili combinazione di diversi tessuti e condizioni di crescita può essere utile per questo secondo problema. Il terzo problema riguardante la risoluzione di informazioni gene dipende dai progressi dei dati di sequenza. Nel caso dell&#39;impianto modello senza completamento della sequenza del genoma, co-espressione analisi utilizzando geni ortologhi in altre piante modello è utile. Il confronto e l&#39;allineamento dettagliata analisi dell&#39;albero filogenetico della sequenza di amminoacidi in grado di supportare la connessione organismi modello ad altre specie. Questo protocollo è adatto a tutti metabolismi. È più efficiente nell&#39;analisi di metabolismi intermedi e secondarie che sono ben caratterizzati ad essere soggetti a forti c trascrizionaleONTROLLO 1,5,11,16. In alcuni esempi, co-espressione di analisi riuscita essere eseguita in assimilazione zolfo, geni per la β-ossidazione, a catena ramificata degradazione aminoacidica, ripartizione clorofilla, e il catabolismo lisina 3, il metabolismo cellulare parete 10,7 e segnalazione luminosa cascata 14. Annotazione della funzione del gene via genomica combinati, la metabolomica e l&#39;informatica non è solo per il gene di biosintesi e regolatore diretto del fattore di trascrizione, ma anche per capire processo fisiologico e la risposta (si veda ad esempio la figura 3. 14). Per sviluppare questo approccio da piante modello a specie vegetali, il confronto metabolica tra le specie di piante è l&#39;approccio efficace in alcuni metabolismo generale. Per esempio, se stesso composto viene rilevato in diverse specie vegetali, e alcuni geni ortologhi sono presenti in queste specie di piante, cross specie co-espressione analisi utilizzando ortologhi geni può fornire strong supporto per il vostro pronostico. Questo approccio può essere eseguita in Arabidopsis, pioppo, Medicago, oltre importanti colture quali orzo, riso, frumento e soia, da co-espressione analisi di specie vegetali (6, PlaNet: <a href="http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/" target="_blank">http://aranet.mpimp-golm.mpg . de /</a> ,, 9, COP: <a href="http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/" target="_blank">http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/</a> ; vedere un esempio, 15).

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Acqua distillata ULC / MS grad </td><td> BIOSOLVE </td><td> 23214102 </td></tr><tr><td> Acetonitrile (ACN) ULC / MS grado </td><td> BIOSOLVE </td><td> 01204102 </td></tr><tr><td> Metanolo (MeOH) ULC / MS grado </td><td> BIOSOLVE </td><td> 13684102 </td></tr><tr><td> Di acido formico (HCOOH) ULC / MS grado per cromatografia liquida </td><td> BIOSOLVE </td><td> 06914131 </td></tr><tr><td> Composti standard </td><td> EXTRASYNTHESE </td><td></td></tr><tr><td> Linear trappola ionica (IT) ESI-MS Finnigan sistema-LTQ </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> HPLC sistema Surveyor </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr><tr><td> Analytical Luna colonna C18 (2), 2,0 mm, lunghezza 150 mm, 100 pori Ådimensioni e particelle sferiche di 3 mm </td><td> Phenomenex </td><td> 00F-4251-B0 </td></tr><tr><td> Xcalibur software </td><td> Thermo Finnigan </td><td></td></tr></tbody></table>

annotation of plant gene function via combined genomics, metabolomics and informatics

Dato il numero sempre crescente di specie vegetali modello per il quale sequenze genomiche complete sono disponibili e l&#39;abbondanza delle risorse biologiche quali mutanti knockout, le adesioni e le popolazioni selvatiche di riproduzione avanzate, vi è un peso crescente per l&#39;annotazione gene funzionale. In questo protocollo, l&#39;annotazione della funzione dell&#39;impianto gene usando combinato co-analisi di espressione genica, metabolomica e informatica è fornito (Figura 1). Questo approccio si basa sulla teoria di usando geni bersaglio di funzione nota per consentire l&#39;identificazione di geni non annotate probabilità di essere coinvolti in un processo metabolico certa, con l&#39;identificazione di composti bersaglio tramite metabolomica. Le strategie vengono proposti per l&#39;applicazione di queste informazioni sulle popolazioni generati da entrambi gli approcci in avanti e genetica inversa, nonostante nessuno di questi sono senza sforzo. Con corollario questo approccio può anche essere utilizzato come un approccio per caratterizzare picchi sconosciuti rappresentano nuova o specifica sedario metaboliti nei tessuti limitate, specie vegetali o di trattamento dello stress, che è attualmente il processo importante per capire il metabolismo delle piante.

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Annotation of Plant Gene Function via Combined Genomics, Metabolomics and Informatics

Combinazione di co-genomica, analisi di espressione genica e l&#39;identificazione di composti bersaglio per via metabolica dare annotazione funzionale del gene.

Annotazione della funzione impianto Gene via Genomics combinati, la metabolomica e Informatica

Given the ever expanding number of model plant species for which complete genome sequences are available and the abundance of bio-resources such as ...

annotation-plant-gene-function-via-combined-genomics-metabolomics

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K Views.  Max-Planck-Institut. Combinazione di co-genomica, analisi di espressione genica e l'identificazione di composti bersaglio per via metabolica dare annotazione funzionale del gene.

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Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA regulators: microRNAs, which are produced from non-protein coding genes and short interfering RNAs (siRNAs). Plants use RNAi to control transposons and to exert tight control over developmental processes such as flower organ formation and leaf development2,3,4. Plants also use RNAi to defend themselves against infection by viruses. Consequently, many viruses have evolved suppressors of gene silencing to allow their successful colonization of their host5.
Virus-induced gene silencing (VIGS) is a method that takes advantage of the plant RNAi-mediated antiviral defense mechanism. In plants infected with unmodified viruses the mechanism is specifically targeted against the viral genome. However, with virus vectors carrying sequences derived from host genes, the process can be additionally targeted against the corresponding host mRNAs. VIGS has been adapted for high-throughput functional genomics in plants by using the plant pathogen Agrobacterium tumefaciens to deliver, via its Ti plasmid, a recombinant virus carrying the entire or part of the gene sequence targeted for silencing. Systemic virus spread and the endogenous plant RNAi machinery take care of the rest. dsRNAs corresponding to the target gene are produced and then cleaved by the ribonuclease Dicer into siRNAs of 21 to 24 nucleotides in length. These siRNAs ultimately guide the RNA-induced silencing complex (RISC) to degrade the target transcript2.
Different vectors have been employed in VIGS and one of the most frequently used is based on tobacco rattle virus (TRV). TRV is a bipartite virus and, as such, two different A. tumefaciens strains are used for VIGS. One carries pTRV1, which encodes the replication and movement viral functions while the other, pTRV2, harbors the coat protein and the sequence used for VIGS6,7. Inoculation of Nicotiana benthamiana and tomato seedlings with a mixture of both strains results in gene silencing. Silencing of the endogenous phytoene desaturase (PDS) gene, which causes photobleaching, is used as a control for VIGS efficiency. It should be noted, however, that silencing in tomato is usually less efficient than in N. benthamiana. RNA transcript abundance of the gene of interest should always be measured to ensure that the target gene has efficiently been down-regulated. Nevertheless, heterologous gene sequences from N. benthamiana can be used to silence their respective orthologs in tomato and vice versa8.

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

Description of a virus-induced gene silencing (VIGS) method for knock-down of gene expression in Nicotiana benthamiana and tomato.

Virale silenziamento genico (VIGS) in Nicotiana benthamiana E Pomodoro

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Ricerca

Biologia

Fluorescence Activated Cell Sorting of Plant Protoplasts

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental stimuli in any multicellular organism. In situ hybridization and reporter gene visualization can to a limited extent be used to this end but for high resolution quantitative RT-PCR or high-throughput transcriptome-wide analysis the isolation of RNA from particular cell types is requisite. Cellular dissociation of tissue expressing a fluorescent protein marker in a specific cell type and subsequent Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) makes it possible to collect sufficient amounts of material for RNA extraction, cDNA synthesis/amplification and microarray analysis.
An extensive set of cell type-specific fluorescent reporter lines is available to the plant research community. In this case, two marker lines of the Arabidopsis thaliana root are used: PSCR::GFP (endodermis and quiescent center) and PWOX5::GFP (quiescent center). Large numbers (thousands) of seedlings are grown hydroponically or on agar plates and harvested to obtain enough root material for further analysis. Cellular dissociation of plant material is achieved by enzymatic digestion of the cell wall. This procedure makes use of high osmolarity-induced plasmolysis and commercially available cellulases, pectinases and hemicellulases to release protoplasts into solution.
FACS of GFP-positive cells makes use of the visualization of the green versus the red emission spectra of protoplasts excited by a 488 nm laser. GFP-positive protoplasts can be distinguished by their increased ratio of green to red emission. Protoplasts are typically sorted directly into RNA extraction buffer and stored for further processing at a later time.
This technique is revealed to be straightforward and practicable. Furthermore, it is shown that it can be used without difficulty to isolate sufficient numbers of cells for transcriptome analysis, even for very scarce cell types (e.g. quiescent center cells). Lastly, a growth setup for Arabidopsis seedlings is demonstrated that enables uncomplicated treatment of the plants prior to cell sorting (e.g. for the cell type-specific analysis of biotic or abiotic stress responses). Potential supplementary uses for FACS of plant protoplasts are discussed.

A method for isolating specific cell types from plant material is demonstrated. This technique employs transgenic marker lines expressing fluorescent proteins in particular cell types, cellular dissociation and Fluorescence Activated Cell Sorting. Additionally, a growth setup is established here that facilitates treatment of Arabidopsis thaliana seedlings prior to cell sorting.

Fluorescenza separazione delle cellule attivate delle protoplasti impianto

High-resolution, cell type-specific analysis of gene expression greatly enhances understanding of developmental regulation and responses to environmental ...

A &#946;-glucuronidase (GUS) Based Cell Death Assay

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative positive or negative regulators of cell death. In this system, N. benthamiana leaves are co-infiltrated with a 35S driven expression cassette containing the gene to be analyzed, and the GUS vector pCAMBIA 2301 using Agrobacterium strain LBA4404 as a vehicle. Because live cells are required for GUS expression to occur, loss of GUS activity is expected when this marker gene is co-expressed with positive regulators of cell death. Equally, increased GUS activity is observed when anti-apoptotic genes are used compared to the vector control. As shown below, we have successfully used this system in our lab to analyze both pro- and anti-death players. These include the plant anti-apoptotic Bcl-2 Associated athanoGene (BAG) family, as well as, known mammalian inducers of cell death, such as BAX. Additionally, we have used this system to analyze the death function of specific truncations within proteins, which could provide clues on the possible post-translational modification/activation of these proteins. Here, we present a rapid and sensitive plant based method, as an initial step in investigating the death function of specific genes.

A &amp;#946;-glucuronidase GUS Based Cell Death Assay

Programmed cell death assays commonly used in mammalian systems such as DNA laddering or TUNEL assays, are often difficult to reproduce in plants. In combination with a GUS reporter system, we propose a rapid, plant based transient assay to analyze the potential death properties of specific genes.

Un β-glucuronidasi (GUS) Sulla base di analisi morte cellulare

We have developed a novel transient plant expression system that simultaneously expresses the reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), with putative ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties. The large-scale gene functional analysis in cotton has been lagged behind most of the modern plant species, likely due to its large size of genome, gene duplication and polyploidy, long growth cycle and recalcitrance to genetic transformation1. To facilitate high throughput functional genetic/genomic study in cotton, we attempt to develop rapid and efficient transient assays to assess cotton gene functions.
Virus-Induced Gene Silencing (VIGS) is a powerful technique that was developed based on the host Post-Transcriptional Gene Silencing (PTGS) to repress viral proliferation2,3. Agrobacterium-mediated VIGS has been successfully applied in a wide range of dicots species such as Solanaceae, Arabidopsis and legume species, and monocots species including barley, wheat and maize, for various functional genomic studies3,4. As this rapid and efficient approach avoids plant transformation and overcomes functional redundancy, it is particularly attractive and suitable for functional genomic study in crop species like cotton not amenable for transformation.
In this study, we report the detailed protocol of Agrobacterium-mediated VIGS system in cotton. Among the several viral VIGS vectors, the tobacco rattle virus (TRV) invades a wide range of hosts and is able to spread vigorously throughout the entire plant yet produce mild symptoms on the hosts5. To monitor the silencing efficiency, GrCLA1, a homolog gene of Arabidopsis Cloroplastos alterados 1 gene (AtCLA1) in cotton, has been cloned and inserted into the VIGS binary vector pYL156. CLA1 gene is involved in chloroplast development6, and previous studies have shown that loss-of-function of AtCLA1 resulted in an albino phenotype on true leaves7, providing an excellent visual marker for silencing efficiency. At approximately two weeks post Agrobacterium infiltration, the albino phenotype started to appear on the true leaves, with 100% silencing efficiency in all replicated experiments. The silencing of endogenous gene expression was also confirmed by RT-PCR analysis. Significantly, silencing could potently occur in all the cultivars we tested, including various commercially grown varieties in Texas. This rapid and efficient Agrobacterium-mediated VIGS assay provides a very powerful tool for rapid large-scale analysis of gene functions at genome-wide level in cotton.

We present the detailed protocol for Agrobacterium-mediated virus-induced gene silencing (VIGS) assay in cotton. The tobacco rattle virus (TRV)-derived VIGS vectors were deployed to induce RNA silencing of cotton GrCLA1, Cloroplastos alterados 1 gene. The albino phenotype caused by silencing GrCLA1 was observed at the seedling stage within 2 weeks after inoculation.

Mediata da Agrobacterium Virus-Induced tacere Assay Gene In Cotone

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

Marcatura metabolica di RNA recentemente trascritto per Alta Risoluzione profili di espressione genica di RNA di sintesi, trattamento e Decay in coltura cellulare

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

Visualizzazione Frequenza Stromule con microscopia a fluorescenza

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the plant immune system. During infection cytoplasmic effectors are delivered to the host cytosol via a type III secretion system (T3SS). After delivery into the plant cell, the effector(s) targets the specific compartment(s) to modulate host cell processes for survival and replication of the pathogen. Although there has been some research on the subcellular localization of effector proteins in the host cells to understand their function in pathogenicity by using fluorescent proteins, investigation of the dynamics of effectors directly injected from bacteria has been challenging due to the incompatibility between the T3SS and fluorescent proteins.
Here, we describe our recent method of an optimized split superfolder green fluorescent protein system (sfGFPOPT) to visualize the localization of effectors delivered via the bacterial T3SS in the host cell. The sfGFP11 (11th &#946;-strand of sfGFP)-tagged effector secreted through the T3SS can be assembled with a specific organelle targeted sfGFP1-10OPT (1-10th &#946;-strand of sfGFP) leading to fluorescence emission at the site. This protocol provides a procedure to visualize the reconstituted sfGFP fluorescence signal with an effector protein from Pseudomonas syringae in a particular organelle in the Arabidopsis and Nicotiana benthamiana plants.

Fluorescent protein-based approaches to monitor effectors secreted by bacteria into host cells are challenging. This is due to the incompatibility between fluorescent proteins and the type-III secretion system. Here, an optimized split superfolder GFP system is used for visualization of effectors secreted by bacteria into the host plant cell.

Proteina fluorescente verde sistema di visualizzare gli effettori consegnati dai batteri durante l'infezione Split

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

mirMachine: A One-Stop Shop for Plant miRNA Annotation

Of different types of noncoding RNAs, microRNAs (miRNAs) have arguably been in the spotlight over the last decade. As post-transcriptional regulators of gene expression, miRNAs play key roles in various cellular pathways, including both development and response to a/biotic stress, such as drought and diseases. Having high-quality reference genome sequences enabled identification and annotation of miRNAs in several plant species, where miRNA sequences are highly conserved. As computational miRNA identification and annotation processes are mostly error-prone processes, homology-based predictions increase prediction accuracy. We developed and have improved the miRNA annotation pipeline, SUmir, in the last decade, which has been used for several plant genomes since then. 
This study presents a fully automated, new miRNA pipeline, mirMachine (miRNA Machine), by (i) adding an additional filtering step on the secondary structure predictions, (ii) making it fully automated, and (iii) introducing new options to predict either known miRNA based on homology or novel miRNAs based on small RNA sequencing reads using the previous pipeline. The new miRNA pipeline, mirMachine, was tested using The Arabidopsis Information Resource, TAIR10, release of the Arabidopsis genome and the International Wheat Genome Sequencing Consortium (IWGSC) wheat reference genome v2.

Herein, we present a new and fully automated miRNA pipeline, mirMachine that 1) can identify known and novel miRNAs more accurately and 2) is fully automated and freely available. Users can now execute a short submission script to run the fully automated mirMachine pipeline.

mirMachine: uno sportello unico per l'annotazione dei miRNA vegetali

Of different types of noncoding RNAs, microRNAs (miRNAs) have arguably been in the spotlight over the last decade. As post-transcriptional regulators of ...

Determination of Tripartite Interaction between Two Monomers of a MADS-box Transcription Factor and a Calcium Sensor Protein by BiFC-FRET-FLIM Assay

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and amending cellular functions. These interactions are involved in a wide range of phenomena such as signal transduction, pathogen response, cell-cell interactions, metabolic and developmental processes. In the case of transcription factors, these interactions may lead to oligomerization of subunits, sequestering in specific subcellular contexts such as the nucleus, cytoplasm, etc., which, in turn, might have a more profound effect on the expression of the downstream genes. Here, we demonstrate a methodology to visualize in vivo tripartite interaction using Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) based F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) involving Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM). Two of the proteins selected for this demonstration interact as BiFC partners, and their reconstituted fluorescence activity is used to assay FRET-FLIM with the third partner. Four to five-week-old growth-chamber-grown Nicotiana benthamiana plants have been used as the model plant system for this demonstration.

Here we present, a method to visualize ternary complex formation between three protein partners using fluorescent-tagged proteins by BiFC based FRET-FLIM assay. This method is valuable for studying protein-protein interaction complexes in vivo.

Determinazione dell'interazione tripartita tra due monomeri di un fattore di trascrizione MADS-box e una proteina sensore di calcio mediante saggio BiFC-FRET-FLIM

Protein-protein interactions are an integral part of all biological processes in the cells as they play a crucial role in regulating, maintaining, and ...

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

Rice stripe virus (RSV), which causes significant economic loss of agriculture in East Asia, entirely depends on insect vectors for its effective transmission among host rice. Laodelphax striatellus (small brown planthopper, SBPH) is the primary insect vector that horizontally transmits RSV while sucking sap from the phloem. Saliva plays a significant role in insects' feeding behavior. A convenient method that will be useful for research on insects' saliva with piercing-sucking feeding behavior is described here. In this method, insects were allowed to feed on an artificial diet sandwiched between two stretched paraffin film layers. The diet containing the saliva was collected each day, filtered, and concentrated for further analysis. Finally, the quality of collected saliva was examined by protein staining and immunoblotting. This method was exemplified by detecting the presence of RSV and a mucin-like protein in the saliva of SBPH. These artificial feeding and saliva collection method will lay a foundation for further research on factors in insect saliva related to feeding behavior and virus transmission.

Two-layered Membrane Sandwich Method for Laodelphax striatellus Saliva Collection

The present protocol describes a method to collect sufficient saliva from piercing-sucking insects using an artificial medium. This is a convenient method for collecting insect saliva and studying salivary function on insect feeding behavior and vector-borne virus transmission.