Il sequenziamento dell'intero genoma, l'estrazione del genoma e la messa in rete molecolare costituiscono la base per la guida alla spettrometria di massa che il protocollo di estrazione del genoma che descriviamo qui. E sono l'approccio più contemporaneo nella scoperta di prodotti naturali. L'estrazione del genoma e la messa in rete molecolare corrispondono in cluster, in annotazioni codificate nel sequenziamento dell'intero genoma con firme di ristrutturazione chimica da estratti grezzi che offrono enormi prospettive per scoprire l'ombelico da parte di molecole attive.
In linea di principio, l'estrazione del genoma prende di mira un singolo o un piccolo gruppo di molecole per esperimento. Ciò si traduce in un tasso di individuazione lento. In questo senso, l'utilizzo dell'estrazione del genoma insieme alla rete molecolare rappresenta un importante progresso per la ricerca sui prodotti naturali.
L'estrazione della guida-genoma della spettrometria di massa è un metodo versatile in grado di strutturare contemporaneamente le informazioni di diversi chemiotipi contenuti nella grande quantità di dati provenienti da un estratto grezzo. Oggi è una metodologia di alta gamma in grado di esplorare la sequenza batterica, fungina o delle piante fornendo. Chemiotipo a genotipo e genotipo a chemiotipo bioinformatica collegamenti tra cluster biosintetici e sono piccoli prodotti di molecole.
L'udito del protocollo è dimostrato per caratterizzare le profondità del ciclo ombelico Prodotti peptidici osservati in estratti metabolici di specie di streptomizi. Ma è applicabile anche alla sequenza e agli estratti fungini e vegetali. È molto importante avere un set di dati del genoma ben curato e al giorno d'oggi sequenze di bozze frammentate sono sempre più soppiantate da dati di sequenza quasi finiti.
Inoltre, sono state sviluppate diverse strategie per accedere a nuovi prodotti naturali bioattivi e certamente combinarli con l'approccio MS-Guide. Condurremo a un miglioramento dell'isolamento e della spiegazione della struttura dei prodotti naturali. Come qui stiamo collegando il genotipo all'approccio chemiotipo, i collegamenti bioinformatici tra cluster biosintetici e ci sono piccoli prodotti molecolari sono cruciali.
per stimare la varietà e la classe dei composti e codificare per genoma. Il che significa la replicazione. Successivamente, il raggruppamento basato sulle somiglianze ioniche può essere preformato utilizzando il PNL.
A dimostrare la procedura saranno la Dott.ssa Renata Sigrist e la Professoressa Angolini i miei collaboratori in questo studio. Ottenere in silico informazioni sulle annotazioni dei cluster genetici del metabolismo secondario da un genoma di sequenza completo. Invia il file di sequenza, la banca genica E-M-B-L o un formato più veloce, a una piattaforma anti-smash.
Quindi, come i cluster genetici di interesse dai dati di output basati sull'ammasso conosciuto più simile. Sulla base delle informazioni sulla sequenza del DNA del BGC, progetta primarie tra 20 e 25 nucleotidi che fiancheggiano l'ammasso genico per gli streptomici di ecoli. Screening artificiale della libreria cromosomico.
Dopo aver ottenuto l'organismo eterologo ricombinante secondo il manoscritto, inoculare un 100 ° dei ceppi precultura in adeguati mezzi di fermentazione. Come i supporti ISP2 liquidi. Posizionare la coltura su un incubatore a 30 gradi Celsius e 220 rpm, per sette giorni.
Dopo l'inoculazione, centrifugare le colture a 2200 volte G per 10 minuti. Scartare le cellule e trasferire il supernatante in un imbuto separatore. Aggiungere uno a un volume di acetato di etile e agitare.
Attendere da uno a tre minuti affinché gli strati organici e acconsentito si separino. E raccogliere lo strato organico in un pallone Erlenmeyer. Per acquisire dati MS/MS.
Programmare metodi HPLC e spettrometria di massa adatti utilizzando il software di controllo. Si noterà che la rete MS/MS è la rete molecolare rilevabile nelle condizioni spettrometriche di massa date. Convertire gli spettri di massa in formato mzXML utilizzando la procedura guidata MS Convert from protea.
Regolare i parametri di input per la conversione. Caricare i file LC-MS/MS convertiti nel database GNPS. Sono disponibili due opzioni.
Utilizzando un protocollo di trasferimento file o direttamente in un browser attraverso la piattaforma online. Dopo aver creato un conto in PNL, accedere al conto creato e selezionare crea una rete molecolare. Aggiungere un titolo di lavoro.
Per eseguire le opzioni di base. Selezionare i file mzXML per eseguire la rete molecolare. Organizzarli in un massimo di sei gruppi.
Quindi, come le librerie per la routine di dereplicazione. Selezionate la tolleranza di massa ionia precursore e il frammento Da sulla tolleranza di massa rispettivamente di 0,02 Dalton e 0,05 Dalton. Per eseguire opzioni di rete avanzate, selezionare i parametri che hanno influenzato direttamente le dimensioni e il modulo del cluster di rete.
I parametri avanzati sono nella documentazione del PNL. Scegliere un indirizzo di posta elettronica per ricevere un avviso al termine del lavoro e inviare il processo. Analizzare i risultati del PNL.
Accedere al PNL. Selezionare i processi, il processo pubblicato, fatto per aprire un processo. Si apre una pagina web con tutti i risultati ottenuti dalla rete molecolare visualizzata.
Selezionare Visualizza famiglie spettrali nel visualizzatore di rete del browser per visualizzare tutti i cluster di rete. Viene visualizzato un elenco con tutti i cluster di rete molecolari generati. L'identificazione molecolare provvisoria viene visualizzata in tutti gli ID.
Selezionare Mostra per visualizzarli. Per analizzare il cluster di rete molecolare, selezionare visualizza rete. Nella casella etichette nodo selezionare massa padre.
Nella casella etichette bordo selezionare co-firma o Delta Emz. Per osservare rispettivamente la somiglianza dei nodi o la differenza di massa tra i nodi. Nel caso dell'analisi multigruppo, fare clic su disegna torte nella casella di colorazione dei nodi.
Per osservare la frequenza con cui ogni nodo appare in ogni gruppo. Per visualizzare tutte le raccolte, selezionare visualizza, tutta la raccolta, i riscontri. Aprire gli spettri di frammentazione direttamente nella piattaforma PNL.
O in file grezzi originali per confermare manualmente i composti di dereplicazione e la spiegazione della struttura dei composti correlati. Il protocollo è stato esemplificato con successo utilizzando una combinazione di estrazione del genoma, espressione eterologo e approcci di codice guidati dalla SM. Per accedere a nuove molecole specializzate di Valinomicina e analogiche.
Il flusso di lavoro genoma-molecola per la valinomicina bersaglio è presentato qui. Il cromatogramma ha mostrato che la valinomicina, la montanastatina e cinque analoghi sono stati prodotti dalla valinomicina, espressione degli ammassi genico biosintetici in un ospite eterologo. Ioni di rete molecolare corrispondenti alla valinomicina, un composto già noto con i corrispondenti ammassi genici biosintetici annotati nelle specie di streptomici, CBM AI due zero quattro due genoma.
Sono raggruppati con ioni correlati agli analoghi, descritti in primo luogo per l'ammasso genico biosintetico della valinomicina. Gli spettri MS e le strutture chimiche per la valinomicina e gli analoghi correlati, sono mostrati qui. Eseguire il sequenziamento dell'intero genoma e una corretta cura del set di dati è il primo passo per eleggere un cluster biosintetico per ms-guide l'estrazione del genoma.
L'intera procedura può essere eseguita con l'estratto grezzo di stringhe di tipi selvatici, ma puoi scegliere di selezionare il cluster genico di tuo interesse e promuovere l'espressione eterologo. Diversi metodi sono descritti per catturare l'intero ammasso genico biosintetico da un campione di DNA. Il più forte vantaggio di questo protocollo è la sua capacità di replicare rapidamente i profili metabolici e allevare informazioni genomiche con i dati MS.
Al fine di chiarire questi come di nuove molecole. E l'estrazione della guida di massa-genoma è stata descritta per la prima volta nel campo della genomica peptidica e della glicogenomica da Doris Chime e colleghi. E dopo l'introduzione della metabolomica integrata NPS e dell'approccio di estrazione del genoma sono diventati la strada più versatile per collegare le reti molecolari con le capacità biosintetiche.
