Gli autori riconoscono WJ Looney attenzione per la revisione del manoscritto.

Standard 2 delle norme internazionali per la tubercolosi afferma che cura tutti i pazienti con sospetto di TBC polmonare dovrebbe presentare almeno due campioni di espettorato per l&#39;esame batteriologico. Quando è possibile, almeno una al mattino presto campione deve essere ottenuto, come espettorato raccolto in questo momento ha il più alto rendimento. Il 11 Xpert MTB / RIF dosaggio può essere applicato a campioni di espettorato o sedimenti espettorato concentrati ottenuti da espettorato indotto o sputi che sono . o bacilli acido-resistenti (AFB) striscio positivo o negativo 6, 12, 13 Il test è stato progettato per l&#39;uso con campioni provenienti da pazienti per i quali vi è il sospetto clinico di tubercolosi polmonare che hanno: 1) non hanno ricevuto terapia anti-tubercolosi, 2 ) aveva meno di 7 giorni di terapia, o 3) non hanno ricevuto la terapia negli ultimi 60 giorni. Do atto che non dovrebbe essere utilizzato per monitorare gli effetti della terapia farmacologica 7 perché il DNA batterico potrebbe persistere anche dopo terapia antibiotica. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Treat campioni clinici, comprese le cartucce usate, come se in grado di trasmettere agenti infettivi. Usare le dovute precauzioni, come ad esempio indossando guanti monouso, camici da laboratorio e occhiali di protezione, e seguire le procedure di sicurezza del vostro istituto e linee guida. 1. Esempi di espettorato Nota: Il processo solo come molti esemplari in una sola volta, in quanto vi sono GeneXpert sistema DX moduli a disposizione per eseguire il test! <ol><li> Etichettare ogni MTB / RIF Xpert cartuccia con l&#39;ID del campione corrispondente. </li><li> Transfer 1,0 ml espettorato sputum una conica, con tappo a vite tubo con una pipetta sterile trasferimento. In alternativa, l&#39;intero campione può essere trattato in originale tenuta stagna espettorato contenitore di raccolta. </li><li> Aggiungere 2,0 ml Xpert MTB / RIF Reagente Sample (2:1, v / v) al espettorato usando una pipetta sterile trasferimento. </li><li> Sostituire il coperchio, e agitare il tubo energicamente 10-20 Volte. In alternativa, la miscela può essere agitati (30 sec). </li><li> Lasciare il tubo in posizione verticale per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Agitare vigorosamente il tubo di 10-20 volte. In alternativa, utilizzare un vortice (30 sec). </li><li> Lasciare il tubo in posizione verticale per altri 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Controllare i campioni: i campioni devono essere liquefatto senza grumi visibili di espettorato. </li></ol> 2. Sedimenti concentrati Nota: Il processo solo come molti esemplari in una sola volta come ci sono GeneXpert sistema DX moduli disponibili per eseguire i test! <ol><li> Etichettare ogni MTB / RIF Xpert cartuccia con l&#39;ID del campione corrispondente. </li><li> Trasferire 1,5 ml Xpert MTB / RIF Reagente di esempio per uno conico, con tappo a vite tubo con una pipetta sterile trasferimento. </li><li> Aggiungere almeno 0,5 ml sedimento concentrato al tubo reagente Campione contenente usando una pipetta sterile trasferimento. </li><li> Sostituire il coperchio e agitare il tubo vigorously 10-20 volte. In alternativa, utilizzare un vortice (30 sec). </li><li> Lasciare il tubo in posizione verticale per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Agitare vigorosamente il tubo di 10-20 volte. In alternativa, utilizzare un vortice (30 sec). </li><li> Lasciare il tubo in posizione verticale per altri 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Controllare i campioni: i campioni devono essere liquefatto senza grumi visibili di espettorato. </li></ol> 3. Caricamento della MTB / RIF Xpert Cartuccia Nota: Iniziare il test entro 30 minuti dall&#39;aggiunta del campione alla cartuccia! <ol><li> Controllare le etichette sul Xpert MTB / RIF cartuccia e l&#39;ID campione. </li><li> Aprire il coperchio della cartuccia. </li><li> Utilizzando la pipetta sterile trasferimento previsto, aspirare il campione liquefatto nella pipetta di trasferimento del menisco fino a superare il minimo e trasferire il campione nella porta aperta del MTB / RIF Xpert cartuccia. </li></ol> Note:Versare lentamente per minimizzare il rischio di formazione di aerosol! <ol start="4"><li> Chiudere il coperchio della cartuccia. </li></ol> 4. Avvio del test Nota: Prima di iniziare il test, assicurarsi che il sistema GeneXpert Dx è equipaggiato con il software GX2.1, e la MTB / RIF Xpert test viene importato nel software 9! <ol><li> Accendere il computer, e poi accendere lo strumento GeneXpert Dx. </li><li> Sul desktop di Windows, fare doppio clic sul collegamento GeneXpert Dx icona. </li><li> Accedere al software GeneXpert sistema DX utilizzando il nome utente e la password. </li><li> Nella finestra GeneXpert sistema DX, fare clic su Crea test. La confezione della cartuccia di scansione di codici a barre di dialogo. </li><li> Nella casella ID campione, eseguire la scansione o digitare l&#39;ID campione. </li><li> Eseguire la scansione del codice a barre sulla MTB / RIF Xpert cartuccia. La finestra Test Crea appare. </li><li> Fare clic su Start test </strong&gt;, e inserire la password nella finestra di dialogo che appare. </li><li> Aprire lo sportello del modulo strumento con la luce verde lampeggiante, e caricare la cartuccia. </li><li> Chiudere lo sportello. La prova inizia e la luce smette di lampeggiare e rimane sempre verde. Quando il test è finito, la luce si spegne. </li><li> Attendere il sistema rilascia il blocco porta alla fine della corsa, quindi aprire lo sportello e rimuovere la cartuccia. </li><li> Smaltire cartucce usate nelle opportuni contenitori dei rifiuti secondo le procedure standard del vostro istituto. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Ogni MTB / RIF Xpert cartuccia include reagenti per la rilevazione di MTB complessa e resistenza RIF nonché un controllo di elaborazione di campione (SPC) per controllare per l&#39;elaborazione adeguata dei batteri bersaglio e per monitorare la presenza di inibitore (s) nella reazione PCR . Il Check Control Probe (PCC) verifica reidratazione reagente, tubo PCR compilandola cartuccia, stabilità integrità sonda, e colorante. 9 Gli inneschi della MTB / RIF dosaggio Xpert amplificare una porzione del gene rpoB contenente il 81 paia di basi regione &quot;core&quot;. Cinque colore diverso fluorogenici sonde di ibridazione di acidi nucleici, detti segnali molecolari, interrogare l&#39;intero nucleo 81-bp. 14 Ogni segnale molecolare è stato progettato per essere in modo specifico che non si lega al suo bersaglio se la sequenza bersaglio differisce dal tipo selvatico rpoB sequenza da un minimo di una singola sostituzione nucleotidica. Poiché molecolare fluorescenza fari solo quando essi sono legati per i loro obiettivi, cioè sequenza wild-type rpoB, l&#39;assenza di uno dei cinque colori nel saggio differenziare tra la conservata sequenza wild-type e mutazioni nella regione di core che sono associati RIF resistenza 6. Il SPC dovrebbe essere positiva in un campione negativo e può essere positivo o negativo in un campione positivo. Il testrisultato sarà &quot;valido&quot; se il SPC non viene rilevato in un test negativo. Prima dell&#39;inizio della reazione PCR, il sistema GeneXpert Dx misura il segnale di fluorescenza delle sonde per monitorare reidratazione tallone, reazione tubo di riempimento, l&#39;integrità e la stabilità dei coloranti sonda. Il PCC passa se il segnale di fluorescenza dalle sonde soddisfa i criteri di accettazione assegnati. I risultati vengono interpretati dal sistema GeneXpert Dx dal misurati segnali di fluorescenza e gli algoritmi di calcolo embedded e vengono visualizzati nella finestra View Results 9, come di seguito indicato: Riconosciuto MTB: MTB DNA bersaglio viene rilevato, entrambi i controlli, SPC e PCC, soddisfano i criteri di accettazione assegnati. Valori inferiori Ct rappresentano una maggiore concentrazione iniziale dello stampo di DNA; elevati valori di Ct rappresentano una concentrazione inferiore di stampo di DNA. Nei risultati MTB rilevati &quot;Resistance RIF DETECTED&quot; (Figura 1A), &quot;NON RILEVATA RIF Resistance&quot; ( <strong&gt; Figura 1B), o &quot;resistenza RIF INDETERMINATO&quot; verrà visualizzato su una riga separata. MTB Non rilevato: DNA bersaglio MTB non viene rilevata, entrambi i controlli, SPC e PCC, soddisfano i criteri di accettazione assegnati (Figura 2). Non valido: presenza o assenza di MTB non può essere determinato: SPC non soddisfa i criteri di accettazione, ossia il campione non è stata adeguatamente elaborata, o PCR è stata inibita (Figura 3). Nota: ripetere il test con il campione in più! Errore: Uno o più dei risultati PCC falliti (FAIL). Sia MTB e SPC visualizzare alcun risultato. Nota: ripetere il test con il campione in più! Se il PCC passato (PASS), l&#39;errore è causato da un guasto di un componente del sistema. Figura 1: DNA bersaglio MTB viene rilevato, entrambi i controlli, SPC e PCC, soddisfano i criteri di accettazione assegnati. Valori più bassi Ct rappresentano una partenza più altoconcentrazione di DNA templato; elevati valori di Ct rappresentano una concentrazione inferiore di stampo di DNA. Nei risultati MTB RILEVATI &quot;NON RILEVATO RIF Resistance&quot; (Figura 1A), &quot;Resistenza RIF DETECTED&quot; (Figura 1B), o &quot;resistenza RIF INDETERMINATO&quot; verrà visualizzato su una riga separata. <img alt="Figura 1A" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig1A.jpg" /> . Figura 1A MTB rilevato; Resistenza RIF NON RILEVATO, cioè solo il wild-type sequenza di acido nucleico del 81-bp RIF resistenza determinazione regione (RRDR) del gene era presente rpoB 6. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig1A.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 1B" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig1B.jpg" /> . Figura 1B MTB rilevato; Resistenza RILEVATO RIF. Completa abbandonare la Probe B (freccia), che copre le posizioni 513-517 della R<html> RDR del gene rpoB. 6 Nella esempio, la sequenza parziale ha rivelato che il gene rpoB mutazione D516V è stato rilevato. 8 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig1Blarge.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig2.jpg" /> Figura 2 DNA bersaglio MTB non è stata rilevata;.. Entrambi i controlli, SPC e PCC, soddisfano i criteri di accettazione assegnati <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig3.jpg" /> . Risultato del test Figura 3 valide, ossia presenza o assenza di MTB non può essere determinato: SPC non soddisfa i criteri di accettazione, perché il campione non è stata adeguatamente elaborata, o perché PCR è stato inibito.3547fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per ingrandire la figura.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

La MTB / RIF Xpert test integra la decontaminazione del campione, a mani libere, a bordo di elaborazione del campione e ultra-sensibili emi-nested PCR per il rilevamento simultaneo di MTB e resistenza RIF, sia con l&#39;espettorato o sedimenti concentrati, in un unico , facile da usare. Limite analitico Il dosaggio di rilevamento è risultata essere 131 CFU / ml di espettorato. 6 Il log-lineare rapporto tra valori di Ct e il numero di cellule presenti MTB vale da febbraio 10 - luglio 10 CFU / ml di espettorato. Come concentrazioni MTB clinicamente rilevanti rientrano tutti nel range lineare del test, il test fornisce stime semi-quantitative della carica batterica. 7 Il test richiede infrastrutture di laboratorio solo moderate e di formazione. Il limite di rilevamento è almeno due ordini di grandezza inferiore a quella della microscopia convenzionale. 6 specificità è eccellente. Inoltre, la rilevazione simultanea di RIF-resistent MTB è un vantaggio significativo nella determinazione del point-of-care testing nell&#39;era della TBC resistente ai farmaci. 3 Fino ad oggi disponibili solo dati limitati pubblicati sulle prestazioni del test per la diagnosi di tubercolosi polmonare in situazioni cliniche sono disponibili 12, 13. Sensibilità clinica complessiva La MTB / RIF Xpert test di rilevazione MTB nell&#39;espettorato di pazienti con sospetta tubercolosi polmonare è stata del 97,6% rispetto alla cultura come riferimento. Questi erano i risultati di uno studio prospettico studio multicentrico che ha coinvolto cinque siti di studio (Lima, Perù, Baku, Azerbaijan, Cape Town e Durban, Sud Africa, Mumbai, India) e un totale di 1462 pazienti. Il generale probabilità pre-test di cultura-ha confermato TB nella popolazione di studio era 50,7%. La sensibilità è stata del 99,8% per i casi striscio e cultura-positivi e 90,2% per striscio-negativi, cultura casi positivi. Tra i pazienti HIV positivi con tubercolosi polmonare, la sensibilità del MTB / RIF test era 93,9%, rispetto al 98,4% in. Pazienti HIV-negativi 12 In una cornice di bassa prevalenza di tubercolosi, l&#39;accordo globale per la rilevazione di MTB è stata dell&#39;89% rispetto alla cultura, la sensibilità era del 98% per% striscio-positivi e 72 per striscio-campioni negativi, rispettivamente, e la specificità era eccellente 13. Non c&#39;era alcuna differenza significativa di sensibilità tra test su espettorato non trattati e quelli sui sedimenti concentrati 12. Nello stesso studio, l&#39;MTB / RIF test correttamente rilevato la resistenza RIF in 209 dei 211 pazienti (99,1% di sensibilità) e in tutti i pazienti con sensibilità 506 RIF (100% di specificità), quando i risultati di sequenziamento sono stati presi in considerazione 12. Gli autori hanno scoperto che le prestazioni sia per il rilevamento dei casi, e la discriminazione di resistenza RIF, è risultata simile tra siti diversi, suggerendo che i risultati sono probabilmente essere ampiamente applicabile. 12 Inoltre, sedimenti concentrate di campioni respiratori diversi espettorato, come ad esempio il lavaggio bronco-alveolare e bronchisecrezioni l, sono stati testati con sensibilità e specificità comparabili. 13 Dati sulle performance del test, quando prova extra-polmonare TB sta emergendo 15. Controllo della TBC globale ha urgente bisogno di strumenti efficaci che permettono una diagnosi rapida di nuovi casi di tubercolosi e l&#39;individuazione di RIF resistente in MTB universale access point-of-care le impostazioni. 3 correnti di amplificazione degli acidi nucleici metodi utilizzati per la rilevazione MTB sono complesse, alta intensità di lavoro, e tecnicamente impegnativo. La MTB / RIF Xpert saggio ha il potenziale per portare standardizzata, sensibile e molto specifico test diagnostico sia per la tubercolosi e la resistenza ai farmaci a queste impostazioni, a condizione che essi saranno in grado di permetterselo. Al fine di agevolare l&#39;accesso, la Fondazione per la Innovative New Diagnostics (FIND) ha negoziato riduzioni di prezzo significative per la MTB / RIF prova Xpert. Prezzi correnti TROVA-negoziati, insieme con l&#39;elenco dei paesi ammissibili per gli sconti, sono disponibili sul web 10. </sup&gt;

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente / Attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Xpert MTB / RIF prova </td><td> Cepheid </td><td> GXMTB/RIF-10 </td></tr><tr><td> Pipette di trasferimento </td><td> Sarstedt </td><td> 86.1172.001 </td></tr><tr><td> Tubi conici, 15 ml, 120 x 17 mm, PS </td><td> Sarstedt </td><td> 62.553.542 </td></tr></tbody></table>

diagnosing pulmonary tuberculosis with the xpert mtb/rif test

La tubercolosi (TB) causata da Mycobacterium tuberculosis (MTB) rimane un grave problema di sanità pubblica: l&#39;infezione colpisce fino a un terzo della popolazione mondiale 1, e quasi due milioni di persone vengono uccise ogni anno da 2 TB di accesso universale di alta qualità. , centrata sul paziente di trattamento per tutti i malati di tubercolosi è sottolineata dalla WHO Stop TB Strategy. 3 La rilevazione rapida di MTB in campioni respiratori e la terapia farmacologica a base di risultati affidabili droga test di resistenza sono un prerequisito per l&#39;efficace attuazione di questa strategia. Tuttavia, in molte aree del mondo, la diagnosi si basa ancora sulla TB insensibili, i metodi standardizzati microscopio dell&#39;espettorato poco. TB rilevamento inefficace e la nascita e la trasmissione di ceppi farmaco-resistenti MTB sempre più mettere in pericolo a livello mondiale le attività di controllo TB. 2 Diagnosi efficace della TBC polmonare richiede la disponibilità - su scala globale - di standardized, strumenti diagnostici di facile da usare, e robusti che consentano il rilevamento diretto sia il complesso di MTB e la resistenza agli antibiotici chiave, come la rifampicina (RIF). Quest&#39;ultimo risultato può servire come marker per la MTB multi-resistente (MDR TB) ed è stata riportata in&gt; 95% dei ceppi MDR-TB. 4, 5 La disponibilità rapida dei risultati di test affidabili è probabile che si traducono direttamente in gestione del paziente sana decisioni che, in ultima analisi, curerà il singolo paziente e spezzare la catena di trasmissione TB nella comunità. 2 Cepheid di (Sunnyvale, CA, USA) Xpert MTB / RIF saggio 6, 7 risponde alle esigenze di cui sopra in maniera notevole. Si tratta di un nucleici-acidi test di amplificazione per 1) l&#39;individuazione di MTB DNA complesso in espettorato o sedimenti espettorato concentrati, e 2) l&#39;individuazione di RIF associate a resistenza mutazioni del gene rpoB 8 E &#39;progettato per l&#39;utilizzo con Cefeidi di GeneXpert Dx. Sistema °a integrare ed automatizzare l&#39;elaborazione del campione, l&#39;amplificazione dell&#39;acido nucleico, e il rilevamento delle sequenze bersaglio mediante PCR in tempo reale e transcriptasi inversa PCR. Il sistema è composto da uno strumento, personal computer, scanner di codici a barre e software precaricato per eseguire i test e la visualizzazione dei risultati. 9 Impiega monouso usa e getta Xpert MTB / RIF cartucce che contengono i reagenti PCR e ospitare il processo di PCR. Poiché le cartucce sono self-contained, la contaminazione incrociata tra campioni viene eliminato. 6 attuali metodi di amplificazione degli acidi nucleici utilizzati per la rilevazione MTB sono complessi, impiego di manodopera, e tecnicamente esigente. La MTB / RIF Xpert saggio ha il potenziale per portare standardizzata, sensibile e molto specifico test diagnostico sia per la tubercolosi e la resistenza al farmaco per l&#39;accesso universale-point-of-care le impostazioni 3, a condizione che essi saranno in grado di permetterselo. Al fine di agevolare l&#39;accesso, la Fondazione per la Innovative New Diagnostics (FIND) ha negoziato significativamenteriduzioni di prezzo significative. Prezzi correnti TROVA-negoziati, insieme con l&#39;elenco dei paesi ammissibili per gli sconti, sono disponibili sul web 10.

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Diagnosing Pulmonary Tuberculosis with the Xpert MTB/RIF Test

La MTB / RIF Xpert prova integra la decontaminazione del campione, a mani libere, a bordo di elaborazione del campione e ultra-sensibili emi-nested PCR per il rilevamento simultaneo di<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; E rifampicina resistenza, sia con l&#39;espettorato o escreato sedimenti concentrati, in circa due ore. Il test è standardizzato e richiede infrastrutture di laboratorio solo moderate e di formazione.

Diagnosticare la tubercolosi polmonare con la MTB / RIF test Xpert

Tuberculosis (TB) due to Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major public health issue: the infection affects up to one third of the world ...

diagnosing-pulmonary-tuberculosis-with-the-xpert-mtbrif-test

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

80.3K Views.  University of Bern. La MTB / RIF Xpert prova integra la decontaminazione del campione, a mani libere, a bordo di elaborazione del campione e ultra-sensibili emi-nested PCR per il rilevamento simultaneo di Mycobacterium tuberculosis E rifampicina resistenza, sia con l'espettorato o escreato sedimenti concentrati, in circa due ore. Il test è standardizzato e richiede infrastrutture di laboratorio solo moderate e di formazione.

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Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). Antimicrobial susceptibility testing (AST) of Mtb has traditionally been performed by the agar method of proportion or by 
macrobroth testing on an instrument such as the BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) or BacT/ALERT (bioM&eacute;rieux, Hazelwood, MO). The agar proportion method, while considered the &#x201C;gold&#x201D; standard of AST, is labor intensive and requires calculation of resistance by performing colony counts on drug-containing agar as compared to drug-free agar. If there is &ge;1% growth on the drug-containing medium as compared to drug-free medium, the organism is considered resistant to that drug. The macrobroth methods require instrumentation and test break point ("critical") drug concentrations for the first line drugs (isoniazid, ethambutol, rifampin, and pyrazinamide). The method described here is commercially available in a 96 well microtiter plate format [MYCOTB (TREK Diagnostics)] and contains increasing concentrations of 12 antimicrobials used for treatment of tuberculosis including both first (isoniazid, rifampin, ethambutol) and second line drugs (amikacin, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylic acid, rifabutin, and streptomycin). Pyrazinamide, a first line drug, is not included in the microtiter plate due to its need for acidic test conditions. Advantages of the microtiter system include both ease of set up and faster turn around time (14 days) compared with traditional agar proportion (21 days). In addition, the plate can be set up from inoculum prepared using either broth or solid medium. Since the microtiter plate format is new and since Mtb presents unique safety challenges in the laboratory, this protocol will describe how to safely setup, incubate and read the microtiter plate.

Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis is challenging but critical for patient care. This microtiter plate format offers testing of 12 antimycobacterial drugs and provides minimum inhibitory concentration (MIC) values, which will aid in appropriate treatment.

Test di suscettibilità antimicrobica del complesso Mycobacterium tuberculosis delle droghe prima e seconda linea per diluizione brodo in un formato micropiastra

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tuberculosis (Mtb). ...

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Immunologia e infezioni

The MODS method for diagnosis of tuberculosis and multidrug resistant tuberculosis

Patients with active pulmonary tuberculosis (TB) infect 10-15 other persons per year, making diagnosing active TB essential to both curing the patient and preventing new infections.  Furthermore, the emergence of multidrug resistant tuberculosis (MDRTB) means that detection of drug resistance is necessary for stopping the spread of drug-resistant strains.  The microscopic-observation drug-susceptibility (MODS) assay is a low-cost, low-tech tool for high-performance detection of TB and MDRTB.  The MODS assay is based on three principles: 1) mycobacterium tuberculosis (MTB) grows faster in liquid media than on solid media 2) microscopic MTB growth can be detected earlier in liquid media than waiting for the macroscopic appearance of colonies on solid media, and that growth is characteristic of MTB, allowing it to be distinguished from atypical mycobacteria or fungal or bacterial contamination 3) the drugs isoniazid and rifampicin can be incorporated into the MODS assay to allow for simultaneous direct detection of MDRTB, obviating the need for subculture to perform an indirect drug susceptibility test. Competing current diagnostics are hampered by low sensitivity with sputum smear, long delays until diagnosis with solid media culture, prohibitively high cost with existing liquid media culture methods, and the need to do subculture for indirect drug susceptibility testing to detect MDRTB.  In contrast, the non-proprietary MODS method has a high sensitivity for TB and MDRTB, is a relatively rapid culture method, provides simultaneous drug susceptibility testing for MDRTB, and is accessible to resource-limited settings at just under $3 for testing for TB and MDRTB.

The microscopic-observation drug-susceptibility (MODS) assay is a low-cost, low-tech tool for high-performance detection of tuberculosis (TB) and multidrug-resistant tuberculosis (MDRTB). This video describes the MODS liquid media culture method.

Il metodo MODS per la diagnosi di tubercolosi e di tubercolosi multiresistente

Patients with active pulmonary tuberculosis (TB) infect 10-15 other persons per year, making diagnosing active TB essential to both curing the patient and ...

Biologia

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Dimostrazione di un multi-resistente ai farmaci<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplificazione Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Sistema per l&#39;efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Analisi di 18FDG PET/CT Imaging come strumento per studiare l'infezione di tubercolosi del micobatterio e trattamento in primati Non umani

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Tubercolosi del micobatterio in topi con fluorescenza enzima Reporter di imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological substance. For the sake of the workers&#8217; safety, handling of all samples presumed to carry Mtb must be conducted in a containment level (CL) 3 laboratory. The TB molecular bacterial load assay (TB-MBLA) test is a reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) test that quantifies Mtb bacillary load using primers and dual-labelled probes for 16S rRNA. We describe the use of heat inactivation to render TB samples noninfectious while preserving RNA for the TB-MBLA. A 1 mL aliquot of the sputum sample in tightly closed 15 mL centrifuge tubes is boiled for 20 min at either 80 &#176;C, 85 &#176;C, or 95 &#176;C to inactivate Mtb bacilli. Cultivation of the heat inactivated and control (live) samples for 42 days confirmed the death of TB. The inactivated sample is then spiked with 100 &#181;L of the extraction control and RNA is extracted following the standard RNA isolation procedure. No growth was observed in the cultures of heat treated samples. The isolated RNA is subjected to real-time RT-qPCR, which amplifies a specific target in the Mtb 16S rRNA gene, yielding results in the form of quantification cycles (Cq). A standard curve is used to translate Cq into bacterial load, or estimated colony forming units per mL (eCFU/mL). There is an inverse relationship between Cq and the bacterial load of a sample. The limitation is that heat inactivation lyses some cells, exposing the RNA to RNases that cause a loss of &#60;1 log10eCFU/mL (i.e., &#60;10 CFU/mL). Further studies will determine the proportion of very low burden patients that cause false negative results due to heat inactivation.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA

We describe a tuberculosis molecular bacterial load assay test performed after heat inactivation of sputum. Heat inactivation renders sputum samples noninfectious and obviates the need for containment level 3 laboratories for tuberculosis molecular tests.

Un test di tubercolosi a carico batterico molecolare (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was synthesized to enhance imaging sensitivity for extrapulmonary tuberculosis (ETB). An SPIO nanoprobe was synthesized and conjugated with MtbsAb. The purified SPIO-MtbsAb nanoprobe was characterized using TEM and NMR. To determine the targeting ability of the probe, SPIO-MtbsAb nanoprobes were incubated with Mtb for in vitro imaging assays and injected into Mtb-inoculated mice for in vivo investigation with magnetic resonance (MR). The contrast enhancement reduction on magnetic resonance imaging (MRI) of Mtb and THP1 cells showed proportional to the SPIO-MtbsAb nanoprobe concentration. After 30 min of intravenous SPIO-MtbsAb nanoprobe injection into Mtb-infected mice, the signal intensity of the granulomatous site was enhanced by 14-fold in the T2-weighted MR images compared with that in mice receiving PBS injection. The MtbsAb nanoprobes can be used as a novel modality for ETB detection.

To improve serological diagnostic tests for Mycobacterium tuberculosis antigens, we developed superparamagnetic iron oxide nanoprobes to detect extrapulmonary tuberculosis.

Sintesi, caratterizzazione e applicazione di nanosondanti di ossido di ferro superparamagnetico per il rilevamento della tubercolosi extrapolmonare

A molecular imaging probe comprising superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles and Mycobacterium tuberculosis surface antibody (MtbsAb) was ...

Medicina

Accelerazione della determinazione della tubercolosi con il metodo Micro-CFU

Micro-Colony Forming Unit Assay for Efficacy Evaluation of Vaccines Against Tuberculosis

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during the 2019-2021 pandemic. The disease is caused by the bacterium Mycobacterium tuberculosis (M.tb). The Mycobacterium bovis strain Bacillus Calmette-Gu&#233;rin (BCG), the only TB vaccine, is the oldest licensed vaccine in the world, still in use. Currently, there are 12 vaccines in clinical trials and dozens of vaccines under pre-clinical development. The method of choice used to assess the efficacy of TB vaccines in pre-clinical studies is the enumeration of bacterial colonies by the colony-forming units (CFU) assay. This time-consuming assay takes 4 to 6 weeks to conclude, requires substantial laboratory and incubator space, has high reagent costs, and is prone to contamination. Here we describe an optimized method for colony enumeration, the micro-CFU (mCFU), that offers a simple and rapid solution to analyze M.tb vaccine efficacy results. The mCFU assay requires tenfold fewer reagents, reduces the incubation period threefold, taking 1 to 2 weeks to conclude, reduces lab space and reagent cost, and minimizes the health and safety risks associated with working with large numbers of M.tb. Moreover, to evaluate the efficacy of a TB vaccine, samples may be obtained from a variety of sources, including tissues from vaccinated animals infected with Mycobacteria. We also describe an optimized method to produce a unicellular, uniform, and high-quality mycobacterial culture for infection studies. Finally, we propose that these methods should be universally adopted for pre-clinical studies of vaccine efficacy determination, ultimately leading to time reduction in the development of vaccines against TB.

Autore in primo piano: Ottimizzazione della determinazione delle CFU per una valutazione efficiente dell'efficacia del vaccino contro la tubercolosi e dell'analisi della presentazione dell'antigene 

The determination of colony-forming units (CFU) is the gold-standard technique for quantifying bacteria, including Mycobacterium tuberculosis which can take weeks to form visible colonies. Here we describe a micro-CFU for CFU determination with increased time efficiency, reduced lab space and reagent cost, and scalability to medium and high throughput experiments.

Saggio dell'unità formante microcolonie per la valutazione dell'efficacia dei vaccini contro la tubercolosi

Tuberculosis (TB), the leading cause of death worldwide by an infectious agent, killed 1.6 million people in 2022, only being surpassed by COVID-19 during ...

Diagnosticare la tubercolosi polmonare con la MTB / RIF test Xpert

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Test di suscettibilità antimicrobica del complesso Mycobacterium tuberculosis delle droghe prima e seconda linea per diluizione brodo in un formato micropiastra

Il metodo MODS per la diagnosi di tubercolosi e di tubercolosi multiresistente

Dimostrazione di un multi-resistente ai farmaci

Sistema per l'efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi

Analisi di ¹⁸FDG PET/CT Imaging come strumento per studiare l'infezione di tubercolosi del micobatterio e trattamento in primati Non umani

Tubercolosi del micobatterio in topi con fluorescenza enzima Reporter di imaging

Un test di tubercolosi a carico batterico molecolare (TB-MBLA)

Sintesi, caratterizzazione e applicazione di nanosondanti di ossido di ferro superparamagnetico per il rilevamento della tubercolosi extrapolmonare

Saggio dell'unità formante microcolonie per la valutazione dell'efficacia dei vaccini contro la tubercolosi