Gli autori riconoscono WJ Looney attenzione per la revisione del manoscritto.

Standard 2 delle norme internazionali per la tubercolosi afferma che cura tutti i pazienti con sospetto di TBC polmonare dovrebbe presentare almeno due campioni di espettorato per l&#39;esame batteriologico. Quando è possibile, almeno una al mattino presto campione deve essere ottenuto, come espettorato raccolto in questo momento ha il più alto rendimento. Il 11 Xpert MTB / RIF dosaggio può essere applicato a campioni di espettorato o sedimenti espettorato concentrati ottenuti da espettorato indotto o sputi che sono . o bacilli acido-resistenti (AFB) striscio positivo o negativo 6, 12, 13 Il test è stato progettato per l&#39;uso con campioni provenienti da pazienti per i quali vi è il sospetto clinico di tubercolosi polmonare che hanno: 1) non hanno ricevuto terapia anti-tubercolosi, 2 ) aveva meno di 7 giorni di terapia, o 3) non hanno ricevuto la terapia negli ultimi 60 giorni. Do atto che non dovrebbe essere utilizzato per monitorare gli effetti della terapia farmacologica 7 perché il DNA batterico potrebbe persistere anche dopo terapia antibiotica. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Treat campioni clinici, comprese le cartucce usate, come se in grado di trasmettere agenti infettivi. Usare le dovute precauzioni, come ad esempio indossando guanti monouso, camici da laboratorio e occhiali di protezione, e seguire le procedure di sicurezza del vostro istituto e linee guida. 1. Esempi di espettorato Nota: Il processo solo come molti esemplari in una sola volta, in quanto vi sono GeneXpert sistema DX moduli a disposizione per eseguire il test! <ol><li> Etichettare ogni MTB / RIF Xpert cartuccia con l&#39;ID del campione corrispondente. </li><li> Transfer 1,0 ml espettorato sputum una conica, con tappo a vite tubo con una pipetta sterile trasferimento. In alternativa, l&#39;intero campione può essere trattato in originale tenuta stagna espettorato contenitore di raccolta. </li><li> Aggiungere 2,0 ml Xpert MTB / RIF Reagente Sample (2:1, v / v) al espettorato usando una pipetta sterile trasferimento. </li><li> Sostituire il coperchio, e agitare il tubo energicamente 10-20 Volte. In alternativa, la miscela può essere agitati (30 sec). </li><li> Lasciare il tubo in posizione verticale per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Agitare vigorosamente il tubo di 10-20 volte. In alternativa, utilizzare un vortice (30 sec). </li><li> Lasciare il tubo in posizione verticale per altri 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Controllare i campioni: i campioni devono essere liquefatto senza grumi visibili di espettorato. </li></ol> 2. Sedimenti concentrati Nota: Il processo solo come molti esemplari in una sola volta come ci sono GeneXpert sistema DX moduli disponibili per eseguire i test! <ol><li> Etichettare ogni MTB / RIF Xpert cartuccia con l&#39;ID del campione corrispondente. </li><li> Trasferire 1,5 ml Xpert MTB / RIF Reagente di esempio per uno conico, con tappo a vite tubo con una pipetta sterile trasferimento. </li><li> Aggiungere almeno 0,5 ml sedimento concentrato al tubo reagente Campione contenente usando una pipetta sterile trasferimento. </li><li> Sostituire il coperchio e agitare il tubo vigorously 10-20 volte. In alternativa, utilizzare un vortice (30 sec). </li><li> Lasciare il tubo in posizione verticale per 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Agitare vigorosamente il tubo di 10-20 volte. In alternativa, utilizzare un vortice (30 sec). </li><li> Lasciare il tubo in posizione verticale per altri 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Controllare i campioni: i campioni devono essere liquefatto senza grumi visibili di espettorato. </li></ol> 3. Caricamento della MTB / RIF Xpert Cartuccia Nota: Iniziare il test entro 30 minuti dall&#39;aggiunta del campione alla cartuccia! <ol><li> Controllare le etichette sul Xpert MTB / RIF cartuccia e l&#39;ID campione. </li><li> Aprire il coperchio della cartuccia. </li><li> Utilizzando la pipetta sterile trasferimento previsto, aspirare il campione liquefatto nella pipetta di trasferimento del menisco fino a superare il minimo e trasferire il campione nella porta aperta del MTB / RIF Xpert cartuccia. </li></ol> Note:Versare lentamente per minimizzare il rischio di formazione di aerosol! <ol start="4"><li> Chiudere il coperchio della cartuccia. </li></ol> 4. Avvio del test Nota: Prima di iniziare il test, assicurarsi che il sistema GeneXpert Dx è equipaggiato con il software GX2.1, e la MTB / RIF Xpert test viene importato nel software 9! <ol><li> Accendere il computer, e poi accendere lo strumento GeneXpert Dx. </li><li> Sul desktop di Windows, fare doppio clic sul collegamento GeneXpert Dx icona. </li><li> Accedere al software GeneXpert sistema DX utilizzando il nome utente e la password. </li><li> Nella finestra GeneXpert sistema DX, fare clic su Crea test. La confezione della cartuccia di scansione di codici a barre di dialogo. </li><li> Nella casella ID campione, eseguire la scansione o digitare l&#39;ID campione. </li><li> Eseguire la scansione del codice a barre sulla MTB / RIF Xpert cartuccia. La finestra Test Crea appare. </li><li> Fare clic su Start test </strong&gt;, e inserire la password nella finestra di dialogo che appare. </li><li> Aprire lo sportello del modulo strumento con la luce verde lampeggiante, e caricare la cartuccia. </li><li> Chiudere lo sportello. La prova inizia e la luce smette di lampeggiare e rimane sempre verde. Quando il test è finito, la luce si spegne. </li><li> Attendere il sistema rilascia il blocco porta alla fine della corsa, quindi aprire lo sportello e rimuovere la cartuccia. </li><li> Smaltire cartucce usate nelle opportuni contenitori dei rifiuti secondo le procedure standard del vostro istituto. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Ogni MTB / RIF Xpert cartuccia include reagenti per la rilevazione di MTB complessa e resistenza RIF nonché un controllo di elaborazione di campione (SPC) per controllare per l&#39;elaborazione adeguata dei batteri bersaglio e per monitorare la presenza di inibitore (s) nella reazione PCR . Il Check Control Probe (PCC) verifica reidratazione reagente, tubo PCR compilandola cartuccia, stabilità integrità sonda, e colorante. 9 Gli inneschi della MTB / RIF dosaggio Xpert amplificare una porzione del gene rpoB contenente il 81 paia di basi regione &quot;core&quot;. Cinque colore diverso fluorogenici sonde di ibridazione di acidi nucleici, detti segnali molecolari, interrogare l&#39;intero nucleo 81-bp. 14 Ogni segnale molecolare è stato progettato per essere in modo specifico che non si lega al suo bersaglio se la sequenza bersaglio differisce dal tipo selvatico rpoB sequenza da un minimo di una singola sostituzione nucleotidica. Poiché molecolare fluorescenza fari solo quando essi sono legati per i loro obiettivi, cioè sequenza wild-type rpoB, l&#39;assenza di uno dei cinque colori nel saggio differenziare tra la conservata sequenza wild-type e mutazioni nella regione di core che sono associati RIF resistenza 6. Il SPC dovrebbe essere positiva in un campione negativo e può essere positivo o negativo in un campione positivo. Il testrisultato sarà &quot;valido&quot; se il SPC non viene rilevato in un test negativo. Prima dell&#39;inizio della reazione PCR, il sistema GeneXpert Dx misura il segnale di fluorescenza delle sonde per monitorare reidratazione tallone, reazione tubo di riempimento, l&#39;integrità e la stabilità dei coloranti sonda. Il PCC passa se il segnale di fluorescenza dalle sonde soddisfa i criteri di accettazione assegnati. I risultati vengono interpretati dal sistema GeneXpert Dx dal misurati segnali di fluorescenza e gli algoritmi di calcolo embedded e vengono visualizzati nella finestra View Results 9, come di seguito indicato: Riconosciuto MTB: MTB DNA bersaglio viene rilevato, entrambi i controlli, SPC e PCC, soddisfano i criteri di accettazione assegnati. Valori inferiori Ct rappresentano una maggiore concentrazione iniziale dello stampo di DNA; elevati valori di Ct rappresentano una concentrazione inferiore di stampo di DNA. Nei risultati MTB rilevati &quot;Resistance RIF DETECTED&quot; (Figura 1A), &quot;NON RILEVATA RIF Resistance&quot; ( <strong&gt; Figura 1B), o &quot;resistenza RIF INDETERMINATO&quot; verrà visualizzato su una riga separata. MTB Non rilevato: DNA bersaglio MTB non viene rilevata, entrambi i controlli, SPC e PCC, soddisfano i criteri di accettazione assegnati (Figura 2). Non valido: presenza o assenza di MTB non può essere determinato: SPC non soddisfa i criteri di accettazione, ossia il campione non è stata adeguatamente elaborata, o PCR è stata inibita (Figura 3). Nota: ripetere il test con il campione in più! Errore: Uno o più dei risultati PCC falliti (FAIL). Sia MTB e SPC visualizzare alcun risultato. Nota: ripetere il test con il campione in più! Se il PCC passato (PASS), l&#39;errore è causato da un guasto di un componente del sistema. Figura 1: DNA bersaglio MTB viene rilevato, entrambi i controlli, SPC e PCC, soddisfano i criteri di accettazione assegnati. Valori più bassi Ct rappresentano una partenza più altoconcentrazione di DNA templato; elevati valori di Ct rappresentano una concentrazione inferiore di stampo di DNA. Nei risultati MTB RILEVATI &quot;NON RILEVATO RIF Resistance&quot; (Figura 1A), &quot;Resistenza RIF DETECTED&quot; (Figura 1B), o &quot;resistenza RIF INDETERMINATO&quot; verrà visualizzato su una riga separata. <img alt="Figura 1A" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig1A.jpg" /> . Figura 1A MTB rilevato; Resistenza RIF NON RILEVATO, cioè solo il wild-type sequenza di acido nucleico del 81-bp RIF resistenza determinazione regione (RRDR) del gene era presente rpoB 6. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig1A.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 1B" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig1B.jpg" /> . Figura 1B MTB rilevato; Resistenza RILEVATO RIF. Completa abbandonare la Probe B (freccia), che copre le posizioni 513-517 della R<html> RDR del gene rpoB. 6 Nella esempio, la sequenza parziale ha rivelato che il gene rpoB mutazione D516V è stato rilevato. 8 <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig1Blarge.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig2.jpg" /> Figura 2 DNA bersaglio MTB non è stata rilevata;.. Entrambi i controlli, SPC e PCC, soddisfano i criteri di accettazione assegnati <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3547/3547fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3547/3547fig3.jpg" /> . Risultato del test Figura 3 valide, ossia presenza o assenza di MTB non può essere determinato: SPC non soddisfa i criteri di accettazione, perché il campione non è stata adeguatamente elaborata, o perché PCR è stato inibito.3547fig3large.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per ingrandire la figura.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

La MTB / RIF Xpert test integra la decontaminazione del campione, a mani libere, a bordo di elaborazione del campione e ultra-sensibili emi-nested PCR per il rilevamento simultaneo di MTB e resistenza RIF, sia con l&#39;espettorato o sedimenti concentrati, in un unico , facile da usare. Limite analitico Il dosaggio di rilevamento è risultata essere 131 CFU / ml di espettorato. 6 Il log-lineare rapporto tra valori di Ct e il numero di cellule presenti MTB vale da febbraio 10 - luglio 10 CFU / ml di espettorato. Come concentrazioni MTB clinicamente rilevanti rientrano tutti nel range lineare del test, il test fornisce stime semi-quantitative della carica batterica. 7 Il test richiede infrastrutture di laboratorio solo moderate e di formazione. Il limite di rilevamento è almeno due ordini di grandezza inferiore a quella della microscopia convenzionale. 6 specificità è eccellente. Inoltre, la rilevazione simultanea di RIF-resistent MTB è un vantaggio significativo nella determinazione del point-of-care testing nell&#39;era della TBC resistente ai farmaci. 3 Fino ad oggi disponibili solo dati limitati pubblicati sulle prestazioni del test per la diagnosi di tubercolosi polmonare in situazioni cliniche sono disponibili 12, 13. Sensibilità clinica complessiva La MTB / RIF Xpert test di rilevazione MTB nell&#39;espettorato di pazienti con sospetta tubercolosi polmonare è stata del 97,6% rispetto alla cultura come riferimento. Questi erano i risultati di uno studio prospettico studio multicentrico che ha coinvolto cinque siti di studio (Lima, Perù, Baku, Azerbaijan, Cape Town e Durban, Sud Africa, Mumbai, India) e un totale di 1462 pazienti. Il generale probabilità pre-test di cultura-ha confermato TB nella popolazione di studio era 50,7%. La sensibilità è stata del 99,8% per i casi striscio e cultura-positivi e 90,2% per striscio-negativi, cultura casi positivi. Tra i pazienti HIV positivi con tubercolosi polmonare, la sensibilità del MTB / RIF test era 93,9%, rispetto al 98,4% in. Pazienti HIV-negativi 12 In una cornice di bassa prevalenza di tubercolosi, l&#39;accordo globale per la rilevazione di MTB è stata dell&#39;89% rispetto alla cultura, la sensibilità era del 98% per% striscio-positivi e 72 per striscio-campioni negativi, rispettivamente, e la specificità era eccellente 13. Non c&#39;era alcuna differenza significativa di sensibilità tra test su espettorato non trattati e quelli sui sedimenti concentrati 12. Nello stesso studio, l&#39;MTB / RIF test correttamente rilevato la resistenza RIF in 209 dei 211 pazienti (99,1% di sensibilità) e in tutti i pazienti con sensibilità 506 RIF (100% di specificità), quando i risultati di sequenziamento sono stati presi in considerazione 12. Gli autori hanno scoperto che le prestazioni sia per il rilevamento dei casi, e la discriminazione di resistenza RIF, è risultata simile tra siti diversi, suggerendo che i risultati sono probabilmente essere ampiamente applicabile. 12 Inoltre, sedimenti concentrate di campioni respiratori diversi espettorato, come ad esempio il lavaggio bronco-alveolare e bronchisecrezioni l, sono stati testati con sensibilità e specificità comparabili. 13 Dati sulle performance del test, quando prova extra-polmonare TB sta emergendo 15. Controllo della TBC globale ha urgente bisogno di strumenti efficaci che permettono una diagnosi rapida di nuovi casi di tubercolosi e l&#39;individuazione di RIF resistente in MTB universale access point-of-care le impostazioni. 3 correnti di amplificazione degli acidi nucleici metodi utilizzati per la rilevazione MTB sono complesse, alta intensità di lavoro, e tecnicamente impegnativo. La MTB / RIF Xpert saggio ha il potenziale per portare standardizzata, sensibile e molto specifico test diagnostico sia per la tubercolosi e la resistenza ai farmaci a queste impostazioni, a condizione che essi saranno in grado di permetterselo. Al fine di agevolare l&#39;accesso, la Fondazione per la Innovative New Diagnostics (FIND) ha negoziato riduzioni di prezzo significative per la MTB / RIF prova Xpert. Prezzi correnti TROVA-negoziati, insieme con l&#39;elenco dei paesi ammissibili per gli sconti, sono disponibili sul web 10. </sup&gt;

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente / Attrezzature </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Xpert MTB / RIF prova </td><td> Cepheid </td><td> GXMTB/RIF-10 </td></tr><tr><td> Pipette di trasferimento </td><td> Sarstedt </td><td> 86.1172.001 </td></tr><tr><td> Tubi conici, 15 ml, 120 x 17 mm, PS </td><td> Sarstedt </td><td> 62.553.542 </td></tr></tbody></table>

diagnosing pulmonary tuberculosis with the xpert mtb/rif test

La tubercolosi (TB) causata da Mycobacterium tuberculosis (MTB) rimane un grave problema di sanità pubblica: l&#39;infezione colpisce fino a un terzo della popolazione mondiale 1, e quasi due milioni di persone vengono uccise ogni anno da 2 TB di accesso universale di alta qualità. , centrata sul paziente di trattamento per tutti i malati di tubercolosi è sottolineata dalla WHO Stop TB Strategy. 3 La rilevazione rapida di MTB in campioni respiratori e la terapia farmacologica a base di risultati affidabili droga test di resistenza sono un prerequisito per l&#39;efficace attuazione di questa strategia. Tuttavia, in molte aree del mondo, la diagnosi si basa ancora sulla TB insensibili, i metodi standardizzati microscopio dell&#39;espettorato poco. TB rilevamento inefficace e la nascita e la trasmissione di ceppi farmaco-resistenti MTB sempre più mettere in pericolo a livello mondiale le attività di controllo TB. 2 Diagnosi efficace della TBC polmonare richiede la disponibilità - su scala globale - di standardized, strumenti diagnostici di facile da usare, e robusti che consentano il rilevamento diretto sia il complesso di MTB e la resistenza agli antibiotici chiave, come la rifampicina (RIF). Quest&#39;ultimo risultato può servire come marker per la MTB multi-resistente (MDR TB) ed è stata riportata in&gt; 95% dei ceppi MDR-TB. 4, 5 La disponibilità rapida dei risultati di test affidabili è probabile che si traducono direttamente in gestione del paziente sana decisioni che, in ultima analisi, curerà il singolo paziente e spezzare la catena di trasmissione TB nella comunità. 2 Cepheid di (Sunnyvale, CA, USA) Xpert MTB / RIF saggio 6, 7 risponde alle esigenze di cui sopra in maniera notevole. Si tratta di un nucleici-acidi test di amplificazione per 1) l&#39;individuazione di MTB DNA complesso in espettorato o sedimenti espettorato concentrati, e 2) l&#39;individuazione di RIF associate a resistenza mutazioni del gene rpoB 8 E &#39;progettato per l&#39;utilizzo con Cefeidi di GeneXpert Dx. Sistema °a integrare ed automatizzare l&#39;elaborazione del campione, l&#39;amplificazione dell&#39;acido nucleico, e il rilevamento delle sequenze bersaglio mediante PCR in tempo reale e transcriptasi inversa PCR. Il sistema è composto da uno strumento, personal computer, scanner di codici a barre e software precaricato per eseguire i test e la visualizzazione dei risultati. 9 Impiega monouso usa e getta Xpert MTB / RIF cartucce che contengono i reagenti PCR e ospitare il processo di PCR. Poiché le cartucce sono self-contained, la contaminazione incrociata tra campioni viene eliminato. 6 attuali metodi di amplificazione degli acidi nucleici utilizzati per la rilevazione MTB sono complessi, impiego di manodopera, e tecnicamente esigente. La MTB / RIF Xpert saggio ha il potenziale per portare standardizzata, sensibile e molto specifico test diagnostico sia per la tubercolosi e la resistenza al farmaco per l&#39;accesso universale-point-of-care le impostazioni 3, a condizione che essi saranno in grado di permetterselo. Al fine di agevolare l&#39;accesso, la Fondazione per la Innovative New Diagnostics (FIND) ha negoziato significativamenteriduzioni di prezzo significative. Prezzi correnti TROVA-negoziati, insieme con l&#39;elenco dei paesi ammissibili per gli sconti, sono disponibili sul web 10.

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Diagnosing Pulmonary Tuberculosis with the Xpert MTB/RIF Test

La MTB / RIF Xpert prova integra la decontaminazione del campione, a mani libere, a bordo di elaborazione del campione e ultra-sensibili emi-nested PCR per il rilevamento simultaneo di<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; E rifampicina resistenza, sia con l&#39;espettorato o escreato sedimenti concentrati, in circa due ore. Il test è standardizzato e richiede infrastrutture di laboratorio solo moderate e di formazione.

Diagnosticare la tubercolosi polmonare con la MTB / RIF test Xpert

Tuberculosis (TB) due to Mycobacterium tuberculosis (MTB) remains a major public health issue: the infection affects up to one third of the world ...

diagnosing-pulmonary-tuberculosis-with-the-xpert-mtbrif-test

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

79.8K Views.  University of Bern. La MTB / RIF Xpert prova integra la decontaminazione del campione, a mani libere, a bordo di elaborazione del campione e ultra-sensibili emi-nested PCR per il rilevamento simultaneo di Mycobacterium tuberculosis E rifampicina resistenza, sia con l'espettorato o escreato sedimenti concentrati, in circa due ore. Il test è standardizzato e richiede infrastrutture di laboratorio solo moderate e di formazione.

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Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Crescita Mycobacterium tuberculosis I biofilm

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Right Ventricular Systolic Pressure Measurements in Combination with Harvest of Lung and Immune Tissue Samples in Mice

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is a common modifier of heart and lung function, by elaborating cellular infiltration, production of cytokines and growth factors, and by initiating remodeling processes 1.
Compared to the left ventricle, the right ventricle is a low-pressure pump that operates in a relatively narrow zone of pressure changes. Increased pulmonary artery pressures are associated with increased pressure in the lung vascular bed and pulmonary hypertension 2. Pulmonary hypertension is often associated with inflammatory lung diseases, for example chronic obstructive pulmonary disease, or autoimmune diseases 3. Because pulmonary hypertension confers a bad prognosis for quality of life and life expectancy, much research is directed towards understanding the mechanisms that might be targets for pharmaceutical intervention 4. The main challenge for the development of effective management tools for pulmonary hypertension remains the complexity of the simultaneous understanding of molecular and cellular changes in the right heart, the lungs and the immune system.
Here, we present a procedural workflow for the rapid and precise measurement of pressure changes in the right heart of mice and the simultaneous harvest of samples from heart, lungs and immune tissues. The method is based on the direct catheterization of the right ventricle via the jugular vein in close-chested mice, first developed in the late 1990s as surrogate measure of pressures in the pulmonary artery5-13. The organized team-approach facilitates a very rapid right heart catheterization technique. This makes it possible to perform the measurements in mice that spontaneously breathe room air. The organization of the work-flow in distinct work-areas reduces time delay and opens the possibility to simultaneously perform physiology experiments and harvest immune, heart and lung tissues.
The procedural workflow outlined here can be adapted for a wide variety of laboratory settings and study designs, from small, targeted experiments, to large drug screening assays. The simultaneous acquisition of cardiac physiology data that can be expanded to include echocardiography5,14-17 and harvest of heart, lung and immune tissues reduces the number of animals needed to obtain data that move the scientific knowledge basis forward. The procedural workflow presented here also provides an ideal basis for gaining knowledge of the networks that link immune, lung and heart function. The same principles outlined here can be adapted to study other or additional organs as needed.

A specific and rapid protocol to simultaneously investigate right heart function, lung inflammation, and the immune response is described as a learning tool. Video and figures describe physiology and microdissection techniques in an organized team-approach that is adaptable to be used for small to large sized studies.

Ventricolo destro di pressione sistolica Misure in combinazione con raccolta di campioni di tessuto polmonare e immunitaria nei topi

The function of the right heart is to pump blood through the lungs, thus linking right heart physiology and pulmonary vascular physiology. Inflammation is ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Un modello sperimentale per studiare la tubercolosi, la malaria coinfezione sulla trasmissione naturale di Mycobacterium tuberculosis E Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

Isolamento e caratterizzazione di neutrofili con proprietà antitumorali

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading ...

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

L&#39;analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello del Sangue-Cervello umano Barriera

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in the caseous cores of cavities and lesions is especially crucial because they harbor subpopulations of drug-tolerant bacteria also commonly referred to as persisters. Existing methods for the measurement of drug penetration in tuberculosis lesions involve costly and time-consuming in vivo pharmacokinetic studies coupled to bioanalytical or imaging techniques. The in vitro measurement of drug binding to caseum macromolecules was proposed as an alternative to such techniques since this binding hinders the passive diffusion of drug molecules through caseum. Rapid equilibrium dialysis is a fast and reliable system for performing plasma protein and tissue binding studies. In this protocol, we used a rapid equilibrium dialysis (RED) device to measure drug binding to homogenates of caseum that is excised from the lesions and cavities of tuberculosis-infected rabbits. The protocol also describes how to generate a surrogate matrix from lipid loaded THP-1 macrophages to use in place of caseum. This caseum/surrogate binding assay is an important tool in tuberculosis drug discovery and can be adapted to help study drug distribution in lesions or abscesses caused by other diseases.

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Here we describe a rapid equilibrium dialysis (RED) method to measure drug binding to caseum from pulmonary tuberculosis lesions and cavities. The protocol is also used with a foamy macrophage-derived matrix that is an effective surrogate to caseum.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Test di rilascio di Caseum che prevede la penetrazione di farmaci nelle lesioni della tubercolosi

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

Intraperitoneal Glucose Tolerance Test, Measurement of Lung Function, and Fixation of the Lung to Study the Impact of Obesity and Impaired Metabolism on Pulmonary Outcomes

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese individuals worldwide by 2030, thus representing a growing socioeconomic burden. Simultaneously, obesity-related comorbidities, including diabetes as well as heart and chronic lung diseases, are continuously on the rise. Although obesity has been associated with increased risk for asthma exacerbations, worsening of respiratory symptoms, and poor control, the functional role of obesity and perturbed metabolism in the pathogenesis of chronic lung disease is often underestimated, and underlying molecular mechanisms remain elusive. This article aims to present methods to assess the effect of obesity on metabolism, as well as lung structure and function. Here, we describe three techniques for mice studies: (1) assessment of intraperitoneal glucose tolerance (ipGTT) to analyze the effect of obesity on glucose metabolism; (2) measurement of airway resistance (Res) and respiratory system compliance (Cdyn) to analyze the effect of obesity on lung function; and (3) preparation and fixation of the lung for subsequent quantitative histological assessment. Obesity-related lung diseases are probably multifactorial, stemming from systemic inflammatory and metabolic dysregulation that potentially adversely influence lung function and the response to therapy. Therefore, a standardized methodology to study molecular mechanisms and the effect of novel treatments is essential.

The incidence of obesity is rising and increases the risk of chronic lung diseases. To establish the underlying mechanisms and preventive strategies, well-defined animal models are needed. Here, we provide three methods (glucose-tolerance-test, body plethysmography, and lung fixation) to study the effect of obesity on pulmonary outcomes in mice.

Prova di tolleranza di glucosio intraperitoneale, misura della funzione polmonare e la fissazione del polmone per studiare l'impatto dell'obesità e metabolismo alterato sugli esiti polmonare

Obesity and respiratory disorders are major health problems. Obesity is becoming an emerging epidemic with an expected number of over 1 billion obese ...

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by fluorescence or bioluminescence. We utilize BlaC, an enzyme expressed constitutively by all M. tuberculosis strains. REF allows rapid quantification of bacteria in lungs of infected mice. The same group of mice can be imaged at many time points, greatly reducing costs, enumerating bacteria more quickly, allowing novel observations in host-pathogen interactions, and increasing statistical power, since more animals per group are readily maintained. REF is extremely sensitive due to the catalytic nature of the BlaC enzymatic reporter and specific due to the custom flourescence resonance energy transfer (FRET) or fluorogenic substrates used. REF does not require recombinant strains, ensuring normal host-pathogen interactions. We describe the imaging of M. tuberculosis infection using a FRET substrate with maximal emission at 800 nm. The wavelength of the substrate allows sensitive deep tissue imaging in mammals. We will outline aerosol infection of mice with M. tuberculosis, anesthesia of mice, administration of the REF substrate, and optical imaging. This method has been successfully applied to evaluating host-pathogen interactions and efficacy of antibiotics targeting M. tuberculosis.

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

We describe the optical imaging of mice infected with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) using reporter enzyme fluorescence (REF). This protocol facilitates the sensitive and specific detection of M. tuberculosis in pre-clinical animal models for pathogenesis, therapeutics and vaccine research.

Tubercolosi del micobatterio in topi con fluorescenza enzima Reporter di imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

Co-immunoprecipitation Assay for Studying Functional Interactions Between Receptors and Enzymes

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with cytoplasmic tails of the receptors. The interactions often occur through specific protein domains and result in activation of the enzymes. There are several methods to study interactions between proteins. While co-immunoprecipitation is commonly used to study domains that are required for protein-protein interactions, there are no assays that document the contribution of specific domains to activity of the recruited enzymes at the same time. Accordingly, the method described here combines co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay for simultaneous evaluation of interactions between proteins and associated enzymatic activation. The goal of this protocol is to identify the domains that are critical for physical interactions between a protein and enzyme and the domains that are obligatory for complete activation of the enzyme. The importance of this assay is demonstrated, as certain receptor protein domains contribute to the binding of the enzyme to the cytoplasmic tail of the receptor, while other domains are necessary to regulate the function of the same enzyme.

Here, we present a protocol for co-immunoprecipitation and an on-bead enzymatic activity assay to simultaneously study the contribution of specific protein domains of plasma membrane receptors to both enzyme recruitment and enzyme activity.

Analisi di co-immunoprecipitazione per lo studio delle interazioni funzionali tra recettori e gli enzimi

Receptor-associated enzymes are the major mediators of cellular activation. These enzymes are regulated, at least in part, by physical interactions with ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of massage on skeletal muscles, the molecular mechanisms behind are poorly understood. We have recently developed a simple device to apply local cyclical compression (LCC), which can generate intramuscular pressure waves with varying amplitudes. Using this device, we have demonstrated that LCC modulates inflammatory responses of macrophages in situ and alleviates immobilization-induced muscle atrophy. Here, we describe protocols for the optimization and application of LCC as a massage-like intervention against immobilization-induced inflammation and atrophy of skeletal muscles of mouse hindlimbs. The protocol that we have developed can be useful for investigating the mechanism underlying beneficial effects of physical exercise and massage. Our experimental system provides a prototype of the analytical approach to elucidate the mechanical regulation of muscle homeostasis, although further development needs to be made for more comprehensive studies.

Here we describe the protocols for applying defined mechanical loads to mouse calves and for monitoring the concomitant intramuscular pressure changes. The experimental systems that we have developed can be useful for investigating the mechanism behind the beneficial effects of physical exercise and massage.

Applicazione di perturbazioni costanti simili a massaggi sui vitelli per topi e monitoraggio dei conseguenti cambiamenti di pressione intramuscolare

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...