Name: imaging mycobacterium tuberculosis in mice with reporter enzyme fluorescence
Uploaded: 2018-02-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence at JoVE.com

Gli studi sugli animali sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e regolamenti stabiliti dall'istituzionale Animal Care e uso Comitato della Texas A & M University. Revisione e approvazione da un ufficiale di sicurezza biohazard o comitato presso il vostro Istituto può essere richiesti.
Attenzione: Tutte le procedure richiedono BSL3 contenimento. Il personale sono tenuto a indossare dispositivi di protezione individuale in ogni momento. Tutte le manipolazioni vengono eseguite all'interno il gabinetto di biosicurezza (BSC) e tutti i diesis sono smaltiti in contenitori. Superfici di lavoro e BSC sono puliti con tamponata etanolo fenolo e 70% prima di iniziare il lavoro e dopo il lavoro. Le procedure normalmente sarebbero stato fatto a livello di biosicurezza 3 con il Mycobacterium tuberculosis, ma per l'illustrazione e scopi delle riprese, gli autori dimostrano queste procedure a livello di biosicurezza 2 con batteri meno virulenti.
1. ceppi e condizioni della coltura
Nota: Ceppo di M. tuberculosis CDC1551 è utilizzato in questo studio, ma qualsiasi ceppo di M. tuberculosis può essere utilizzato nello stesso modo.
<ol><li>Crescere i batteri in M-OADC-TW (7h 9 brodo completato con glicerolo 0,5%, destrosio 10% acido oleico complessa senza catalasi e 0.05% Tween-80) media in piedi a 37 ° C per un OD600 di 0,5 (~ 0.2 x 107 CFU).</li>
	<li>Diluire la cultura in M-OADC-TW (serie di 01:10 diluizioni dei batteri). Piastra le diluizioni dei batteri (105, 106, 107, 108) in triplice copia sul selettivo 11 piastre 7 H per consentire la determinazione di CFU.</li>
	<li>Incubare le piastre per quattro settimane a 37 ° C o fino a quando non possono essere accuratamente contate le colonie.</li>
	<li>Centrifugare l'inoculo batterico a 8.534 x g per 5 min ottenere una pallina. Lavare la pallina una volta con 10 mL di soluzione fisiologica (0,9% NaCl) e risospendere il pellet in 15 mL di soluzione fisiologica (0,9% NaCl).</li>
</ol>2. l'infezione aerosol dei topi utilizzando una camera di Madison
<ol><li>Consentire topi raggiunga il nuovo ambiente per una settimana.</li>
	<li>Pesare i topi prima di caricarli nella camera.</li>
	<li>Inserire tre cavi nella ciabatta: il potere della camera principale, la pompa del vuoto e il compressore d'aria, in quell'ordine.</li>
	<li>Svitare con cura il barattolo di vetro. Portare il vaso di vetro per la biosicurezza e aggiungere l'inoculo di sfida sospesa in 15 mL di soluzione fisiologica (0,9% NaCl) per raggiungere ~ 104 - 106 CFU di batteri nei polmoni.</li>
	<li>Chiudere il coperchio del vaso di vetro nella cappa di biosicurezza. Collegare il vaso a unità nebulizzatore e regolare il tubo verticale in acciaio, in modo che l'estremità inferiore (assunzione) è circa un quarto di pollice sotto il livello del fluido nel vaso.</li>
	<li>Tutti gli animali necessari per l'esperimento (la camera può contenere fino a 90 topi) nel vano di carico e chiudere tutti i fermi sulla porta.</li>
	<li>Verifica principale (camera) Misuratore di flusso aria. Assicurarsi che il centro del galleggiante (palla) eseguito circa 50 L/min come misurato sulla scala di sinistra.</li>
	<li>Premere il tasto Start sul pannello di controllo della camera. Impostare la velocità di flusso d'aria attraverso il misuratore di portata aria compressore (il metro più piccolo a sinistra) come 4 L/min sulla scala. Controllare visivamente per assicurarsi che l'inoculo di sfida è essere nebulizzato.</li>
	<li>Dopo 15 min, quando appare la luce rossa sulla parte anteriore del pannello di controllo e un segnale acustico indica la fine della corsa, premere il pulsante Reset in basso a destra del pannello di controllo di azzerare il timer.</li>
	<li>Tenere premuto il pulsantino rosso sulla porta della camera per rilasciare il vuoto.</li>
	<li>Aprire la porta della camera e rimuovere gli animali. Posizionare i topi indietro nelle loro gabbie.</li>
	<li>Togliete il vaso del nebulizzatore di vetro e mettere in un contenitore di trasporto sigillata, a tenuta stagna. Posizionare il contenitore all'interno del cabinet di bio-sicurezza e scartare la sospensione di sfida in un contenitore per rifiuti designato.</li>
	<li>Posizionare il vaso di nebulizzatore usato all'interno di un sacchetto di biohazard e sigillare il sacchetto per il trasporto all'autoclave.</li>
	<li>Al termine della procedura l'infezione, spruzzare all'interno della camera di etanolo fenolo e 70% tamponata e fare la camera a riposare per 10 min.</li>
	<li>Quindi, pulire molto accuratamente tutte le superfici interne accessibili. Smaltire tutti gli asciugamani di carta contaminati, ecc. nel cestino biohazard. Autoclave nel Cestino, contenitore per rifiuti e utilizzato nebulizzatore vasetti.</li>
	<li>Sistemare gli animali torna nella camera di contenimento fino al punto di tempo imaging.</li>
	<li>Il giorno dell'imaging, è possibile trasferire gli animali in un contenitore secondario alla camera imaging.</li>
</ol>3. animale anestesia
<ol><li>Anestetizzare i topi con isoflurano utilizza un sistema di anestesia di gas su misura.</li>
	<li>Pesare ognuna della due cartuccia filtro carbone situato sopra l'apparecchio di anestesia.</li>
	<li>Sostituire con una nuova cartuccia se il peso è di 50 g sopra il peso iniziale.</li>
	<li>Controllare l'apparecchio vaporizzatore per garantire sufficiente isoflurano per la procedura.</li>
	<li>Collocare il supporto del cono di naso all'interno della camera di formazione immagine. Inserire il numero di coni di naso necessaria per la procedura e sigillare le aperture rimanenti con i bloccanti del cono di naso.</li>
	<li>Accendere l'alimentazione di ossigeno dal cilindro ad alta pressione e impostarlo a 55 psi.</li>
	<li>Accendere la pompa di evacuazione situata di fronte l'unità di anestesia e impostarlo a 8 L/min.</li>
	<li>Accendere il commutatore di ossigeno che si trova di fronte l'unità di anestesia.</li>
	<li>Attivare il flusso di gas alla camera di induzione di anestesia per impostare il flusso del gas a 1,5 L/min Disabilita il flusso del gas.</li>
	<li>Attivare il flusso di gas alla camera di formazione immagine per impostare il flusso del gas a 0,25 L/min Disabilita il flusso del gas.</li>
	<li>Accendere il vaporizzatore di isoflurano e impostarla a 2-2,5%. Regolare il livello di isoflurane secondo il numero e il peso degli animali essendo utilizzati per l'esperimento ruotando la manopola sul vaporizzatore di isoflurane (2-2,5% per un mouse pesa ~ 20 g; 4% per una cavia di un peso di 300 g).</li>
	<li>Posizionare i topi in camera di anestesia e chiudere il coperchio. Attivare il flusso del gas nella camera di induzione di anestesia.</li>
	<li>Lasciare i topi nella camera di induzione di anestesia per 5-10 minuti fino a quando completamente anestetizzato.</li>
	<li>Una volta che i topi sono anestetizzati, applicare una pomata ottica agli occhi per proteggerli durante la formazione immagine.</li>
	<li>Disporre i topi in decubito sternale o ventrale in modo tale che i nasi sono collocati nel cono di naso per facilitare l'anestesia dei topi durante la procedura di imaging.</li>
</ol>4. imaging di fluorescenza (REF) enzima reporter
<ol><li>Iniettare il substrato (20 µM, 2,5 µ l/g di peso) di iniezione intraperitoneale in infetti, come pure i topi di controllo. I topi sono sotto anestesia all'interno della camera imaging per meno di 1 min.</li>
	<li>Avviare il sistema di imaging.</li>
	<li>Inizializzare il sistema facendo clic su Inizializza. Attendere che la barra di temperatura diventa verde. Nota: La camera imaging è costituito da una piattaforma riscaldata per mantenere la temperatura corporea dell'animale durante la formazione immagine.</li>
	<li>Per l'imaging di impostazione di acquisizione, selezionare fluorescenti | Trans-illuminazione per animale intero o Epi-illuminazione per tessuti polmonari, struttura e sovrapposizione nel pannello di controllo di acquisizione.</li>
	<li>Campo di vista impostata B per singolo mouse e livello di lampada ad alto.</li>
	<li>Impostare il tempo di esposizione di auto, binning medie, 2-3 per il f/stop e filtro di eccitazione a 745 nm ed emissione filtri da 780 nm a 840 nm.</li>
	<li>Per l'installazione di sequenza, fare clic sulla sequenza di installazione, selezionare punti di Trans-illuminazione di 9-12 nell'area del polmone.</li>
	<li>Fare clic su Acquisisci per acquisizione di immagini.</li>
	<li>Inserire il mouse post-l'imaging gabbia.</li>
	<li>Monitorare i topi fino a completamente recuperato o sacrificare per quantificare CFU se imaging presso un punto di tempo dell'esperimento. Eseguire un punteggio di Karnofsky modificato per monitorare il benessere dei topi post-imaging.</li>
</ol>5. analisi di REF imaging
<ol><li>Aprire il software di imaging.</li>
	<li>Caricare i file immagine facendo clic sull'icona Sfoglia.</li>
	<li>Per unmixing spettrale, fare clic su Spectral Unmixing nella tavolozza degli strumenti e fare clic sugli spettri per unmix necessaria. Fare clic su start unmixing.</li>
	<li>Per la ricostruzione della superficie ottica, clicca sulla topografia di superficie.</li>
	<li>Selezionare l'orientamento alla dorsale, soggette a mouse pelliccia e, fare clic su genera superficie.</li>
	<li>Ritagliare l'immagine e imposta immagine di soglia per una regione di interesse. Fare clic su Chiudi.</li>
	<li>Per la registrazione dell'organo, vai alla scheda di registrazione in 3D dal menu a discesa di strumenti ottici.</li>
	<li>Registro di organi di interesse in un Atlante di organo.</li>
	<li>Regolare la dimensione dell'organo o posizione alla topografia superficiale generata utilizzando strumento di trasformazione inserita/disinserita situato sugli strumenti pannello-registrazione.</li>
	<li>Vai alla tomografia fluorescente (FLIT) ricostruzione 3D e selezionare analizzare sulla scheda e selezionare le immagini per essere inclusi per analisi, tipo all'efficienza di trasmissione fluorescenza normalizzata (NTF) immagine, fare clic su Start.</li>
	<li>Verifica su Seleziona tutto e ricostruire nella scheda Anteprima dati.</li>
	<li>Per la quantificazione di fluorescenza, vai strumenti regione di interesse (ROI), di aggiungere cubo ROI all'organo di interesse e regolare le dimensioni del cubo per coprire l'organo di interesse. Fare clic su misura 3D ROIs.</li>
	<li>Nella finestra di misurazione del ROI, vai a misure ROI 3D, selezionare il tipo di dati all'unità di voxel e misurazioni di fonte a pmolM-1cm-1.</li>
	<li>Salvare e/o esportare il risultato di analisi FLIT ricostruzione 3D in un file di dati o di figura.</li>
</ol>6. quantificazione dei batteri di CFU
<ol><li>Eutanasia i topi tramite l'iniezione intraperitoneale di 0,1 mL sodio pentobarbital (390 mg/mL).</li>
	<li>Controllo per pedale riflesso comprimendo le pastiglie dei piedi dei topi per accertarsi che non vi è nessuna reazione riflessa.</li>
	<li>Explant il tessuto polmonare da topi con delle forbici, pinze sterili. Omogeneizzare il tessuto polmonare in 1 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x.</li>
	<li>Effettuare diluizioni seriali 10 volte dell'omogeneato del polmone in PBS 1X sterile.</li>
	<li>Per la placcatura, spot tre aliquote di 20 µ l della diluizione rispettiva sulla piastra di agar.</li>
	<li>Incubare le piastre in un incubatore a 37 ° C e monitor per la crescita batterica.</li>
	<li>Conteggio delle colonie in ogni spot dopo il tempo di incubazione e rapidi come CFU / mL correggendo per volume e diluizione utilizzando la seguente equazione: CFU / mL = (C/V) x M Dove C = conteggi di Colonia per spot, V = volume di campione inoculato su ogni piatto (mL) e M = fattore di moltiplicazione (reciproco della diluizione utilizzata). Nota: Se vengono contate le 11 colonie in uno spot per un volume di campione di 0,002 mL ad una diluizione del campione di 10-4, utilizzando l'equazione, il conteggio delle colonie sarà calcolato come (11/0,02) x 104 = 5.5 x 106 CFU / mL</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lewinson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Official+American+thoracic+society/infectious+diseases+society+of+America/+centers+for+disease+control+and+prevention+clinical+practice+guidelines:+diagnosis+of+tuberculosis+in+adults+and+children.">Official American thoracic society/infectious diseases society of America/ centers for disease control and prevention clinical practice guidelines: diagnosis of tuberculosis in adults and children.</a> Clin Infect Dis. 64 (2), 1-33 (2017).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensititre+MYCOTB+MIC+plate+for+testing+Mycobacterium+tuberculosis+susceptibility+to+first-+and+second-line+drugs.">Sensititre MYCOTB MIC plate for testing Mycobacterium tuberculosis susceptibility to first- and second-line drugs.</a> Antimicrob Agents Ch. 58 (1), 11-18 (2014).</li><li>Dheda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+pathogenesis,+transmission,+diagnosis,+and+management+of+multidrug-resistant,+extensively+drug-resistant,+and+incurable+tuberculosis.">The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis.</a> Lancet Resp Med. 5 (4), 291-360 (2017).</li><li>Behr, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+Mycobacterium+tuberculosis+from+patients+smear-negative+for+acid-fast+bacilli.">Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-fast bacilli.</a> Lancet. 353 (9151), 444-449 (1999).</li><li>Cruz, A. T., Revell, P. A., Starke, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastric+aspirate+yield+for+children+with+suspected+pulmonary+tuberculosis.">Gastric aspirate yield for children with suspected pulmonary tuberculosis.</a> J Pediatric Infect Dis Soc. 2 (2), 171-174 (2013).</li><li>Monkongdee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yield+of+acid-fast+smear+and+mycobacterial+culture+for+tuberculosis+diagnosis+in+people+with+human+immunodeficiency+virus.">Yield of acid-fast smear and mycobacterial culture for tuberculosis diagnosis in people with human immunodeficiency virus.</a> Am J Resp Crit Care. 180, 903-908 (2009).</li><li>Karstaedt, A. S., Jones, N., Crewe-Brown, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacteriology+of+pulmonary+tuberculosis+in+a+population+with+high+human+immunodeficiency+virus+seroprevalence.">The bacteriology of pulmonary tuberculosis in a population with high human immunodeficiency virus seroprevalence.</a> Int J Tuberc Lung D. 2 (4), 312-316 (1998).</li><li>Yang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+Mycobacterium+tuberculosis,+using+a+novel+near-infrared+fluorescent+substrate.">Real-time imaging of Mycobacterium tuberculosis, using a novel near-infrared fluorescent substrate.</a> J Infect Dis. 215 (3), 405-414 (2017).</li><li>Nooshabadi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+excitation+increases+detection+sensivity+for+pulmonary+tuberculosis+by+whole-body+imaging+with+&#946;-lactamase+reporter+enzyme+fluorescence.">Intravital excitation increases detection sensivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with &#946;-lactamase reporter enzyme fluorescence.</a> J Biophotonics. , (2016).</li><li>Chang, M. H., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+luciferase+to+image+bacterial+infections+in+mice.">Using luciferase to image bacterial infections in mice.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Kong, Y., Subbian, S., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+optical+imaging+to+study+of+extrapulmonary+spread+by+tuberculosis.">Application of optical imaging to study of extrapulmonary spread by tuberculosis.</a> Tuberculosis. 89 (1), 15-17 (2009).</li><li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vivo+assessment+of+drug+efficacy+against+Mycobacterium+tuberculosis+using+an+improved+firefly+luciferase.">Rapid in vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis using an improved firefly luciferase.</a> J Antimicrob Chemoth. 68 (9), 2118-2127 (2013).</li><li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+bioluminescent+reporters+for+use+with+Mycobacteria.">Optimisation of bioluminescent reporters for use with Mycobacteria.</a> PLoS ONE. 5 (5), 10777 (2010).</li><li>Nooshabadi, F., Yang, H. Y., Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+fluorescence+excitation+in+whole-animal+optical+imaging.">Intravital fluorescence excitation in whole-animal optical imaging.</a> PLoS ONE. 11 (2), 0149932 (2016).</li><li>Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Matiland, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+fluorescence+imaging+of+bacterial+infections+in+animal+models.">Multi-scale fluorescence imaging of bacterial infections in animal models.</a> Proc. SPIE 8565, Photonic Therapeut Diagnos IX. , 856537 (2013).</li><li>Mufti, N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bacterial+infection+with+a+fiber+optic+microendoscope.">Detection of bacterial infection with a fiber optic microendoscope.</a> Proc. SPIE 8092, Med Laser Appl Laser-tissue Interac V. , 80920A (2011).</li><li>Zelmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vivo+model+to+test+anti-tuberculosis+drugs+using+fluorescence+imaging.">A new in vivo model to test anti-tuberculosis drugs using fluorescence imaging.</a> J Antimicrob Chemoth. 67 (8), 1948-1960 (2012).</li><li>Yang, D., Ding, F., Mitachi, K., Kurosu, M., Lee, R. E., Kong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+probe+for+detecting+Mycobacterium+tuberculosis+and+identifying+genes+critical+for+cell+entry.">A fluorescent probe for detecting Mycobacterium tuberculosis and identifying genes critical for cell entry.</a> Front. Microbiol. 7, (2016).</li><li>Ordonez, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Model+of+pulmonary+cavitary+tuberculosis+and+expression+of+matrix+metalloproteinase-9.">Mouse Model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9.</a> Dis Model Mech. 9, 778-779 (2016).</li><li>Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+bacterial+infections.">Optical imaging of bacterial infections.</a> Clin Transl Imaging. 4, 163-174 (2016).</li><li>Calderon, V., Valbuena, G., Goez, Y., Endlsey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+humanized+mouse+model+of+tuberculosis.">A humanized mouse model of tuberculosis.</a> PLoS ONE. 8 (5), 63331 (2013).</li><li>Vergne, I., Chua, J., Lee, H. H., Lucas, M., Belisle, J., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+phagolysosome+biogenesis+block+by+viable+Mycobacterium+tuberculosis.">Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis.</a> P Natl Acad Sci Usa. 102 (11), 4033-4038 (2004).</li><li>Kong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tuberculosis+with+endogenous+&#946;-+lactamase+reporter+enzyme+fluorescent+in+live+mice.">Imaging tuberculosis with endogenous &#946;- lactamase reporter enzyme fluorescent in live mice.</a> P Natl Acad Sci Usa. 107 (27), 12239-12244 (2010).</li><li>Kong, Y., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+enzyme+fluorescence+(REF)+imaging+and+quantification+of+tuberculosis+in+live+animals.">Reporter enzyme fluorescence (REF) imaging and quantification of tuberculosis in live animals.</a> Virulence. 1 (6), 558-622 (2010).</li><li>Skoura, E., ZumLa, A., Bomanji, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+tuberculosis.">Imaging in tuberculosis.</a> Int J Infect Dis. 32, 87-93 (2015).</li><li>Lee, K. S., Im, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CT+in+adults+with+tuberculosis+of+the+chest:+characteristic+findings+and+role+in+management.">CT in adults with tuberculosis of the chest: characteristic findings and role in management.</a> Am J Roentgenol. 164, 1361-1367 (1995).</li><li>Hoffman, E. B., Crosier, J. H., Cremin, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+children+with+spinal+tuberculosis.+A+comparison+of+radiography,+computed+tomography+and+magnetic+resonance+imaging.">Imaging in children with spinal tuberculosis. A comparison of radiography, computed tomography and magnetic resonance imaging.</a> J Bone Joint Surg Br. 75 (2), 233-239 (1993).</li><li>Soussan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+pulmonary+tuberculosis+on+FDG-PET/CT.">Patterns of pulmonary tuberculosis on FDG-PET/CT.</a> Eur J Radiol. 81 (10), 2872-2876 (2012).</li><li>Sule, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+directions+using+reporter+enzyme+fluorescence+(REF)+as+a+tuberculosis+diagnostic+platform.">New directions using reporter enzyme fluorescence (REF) as a tuberculosis diagnostic platform.</a> Tuberculosis. 101, 78-82 (2016).</li><li>Heuts, F., Carow, B., Wigzell, H., Rottenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+non-invasive+bioluminescent+imaging+to+assess+mycobacterial+dissemination+in+mice,+treatment+with+bactericidal+drugs+and+protective+immunity.">Use of non-invasive bioluminescent imaging to assess mycobacterial dissemination in mice, treatment with bactericidal drugs and protective immunity.</a> Microbes Infect. 11 (14-15), 1114-1121 (2009).</li><li>Kong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescent+protein+expressing+strains+to+evaluation+of+anti-tuberculosis+therapeutic+efficacy+in+vitro+and+in+vivo.">Application of fluorescent protein expressing strains to evaluation of anti-tuberculosis therapeutic efficacy in vitro and in vivo.</a> PLoS ONE. 11 (3), 0149972 (2016).</li><li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+point-of-care+detection+of+the+tuberculosis+pathogen+using+a+BlaC-specific+fluorogenic+probe.">Rapid point-of-care detection of the tuberculosis pathogen using a BlaC-specific fluorogenic probe.</a> Nature Chem. 4, 802-809 (2012).</li><li>Nooshabadi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-animal+imaging+of+bacterial+infection+using+endoscopic+excitation+of+&#946;-lactamase+(BlaC)-+specific+fluorogenic+probe.">Whole-animal imaging of bacterial infection using endoscopic excitation of &#946;-lactamase (BlaC)- specific fluorogenic probe.</a> Proc SPIE. 9715, 97150 (2016).</li><li>Ghiasi, M., Pande, T., Pai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+tuberculosis+diagnostics.">Advances in tuberculosis diagnostics.</a> Curr Trop Med Rep. 2 (2), 54-61 (2015).</li><li>Rao, J., Andrasi, A. D., Yao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+in+vivo:+recent+advances.">Fluorescence imaging in vivo: recent advances.</a> Curr Opin Biotech. 18 (1), 17-25 (2007).</li><li>Marshall, M. V., Draney, D., Sevick-Muraca, E. M., Olive, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-dose+intravenous+toxicity+study+of+IRDye+800CW+in+Sprague-Dawley+rats.">Single-dose intravenous toxicity study of IRDye 800CW in Sprague-Dawley rats.</a> Mol Imaging Biol. 12 (6), 583-594 (2010).</li><li>Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+tuberculosis+in+translational+and+precision+medicine.">Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine.</a> Front Microbiol. 8, 717 (2017).</li><li>Rao, J., Xie, H., Cheng, Y., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,7-disubstituted+cephalosporin+derivatives+as+beta-lactamase+substrates+and+methods+for+their+use+for+the+diagnosis+of+tuberculosis.">2,7-disubstituted cephalosporin derivatives as beta-lactamase substrates and methods for their use for the diagnosis of tuberculosis.</a> US patent. , (2015).</li><li>Shao, Q., Zheng, Y., Dong, X., Tang, K., Yan, X., Xing, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Covalent+Reporter+of+&#946;-Lactamase+Activity+for+Fluorescent+Imaging+and+Rapid+Screening+of+Antibiotic-Resistant+Bacteria.">A Covalent Reporter of &#946;-Lactamase Activity for Fluorescent Imaging and Rapid Screening of Antibiotic-Resistant Bacteria.</a> Chem Eur J. 19 (33), 10903-10910 (2013).</li><li>Li, L., Li, Z., Shi, W., Li, X., Ma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+and+Selective+Near-Infrared+Fluorescent+Off-On+Probe+and+Its+Application+to+Imaging+Different+Levels+of+&#946;-Lactamase+in+Staphylococcus+aureus.">Sensitive and Selective Near-Infrared Fluorescent Off-On Probe and Its Application to Imaging Different Levels of &#946;-Lactamase in Staphylococcus aureus.</a> Anal Chem. 86 (12), 6115-6120 (2014).</li><li>Ashizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+lung+cancer+and+tuberculoma+in+the+same+lesion:+demonstration+by+high+resolution+and+contrast-enhanced+dynamic+CT.">Coexistence of lung cancer and tuberculoma in the same lesion: demonstration by high resolution and contrast-enhanced dynamic CT.</a> BRIT J RADIOL. 77 (923), 959-962 (2004).</li><li>Figueroa, C. J., Riedel, E., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+radiographic+differentiation+of+lung+nodules+caused+by+mycobacteria+and+lung+cancer:+a+case-control+study.">Clinical and radiographic differentiation of lung nodules caused by mycobacteria and lung cancer: a case-control study.</a> BMC Infect Dis. 15 (482), (2015).</li></ol>

Quando si utilizza tecniche di imaging, quali REF, non ci sono strategie chiave che consentono la generazione di dati affidabili e coerenti. Imaging ottico produce luce diffusa nei tessuti che possono influenzare la profondità di penetrazione, dato che è difficile da catturare la luce emessa in tutte le direzioni. Uso di un fluoroforo infrarosso vicino (NIR) substrato per REF imaging avendo una lunghezza d'onda di eccitazione e di emissione in Querange di 700-900 nm facilita l'assorbimento minimo del segnale fluorescente da tessuti di mammiferi. Il substrato personalizzato progettato fu costruito collegando un fluoroforo NIR, IRDye 800Cw a un quencher, QC IRDye-1, da un anello di lattame permettendo tempra basati sul trasferimento di fluorescenza risonanza energia. IRDye ha tessuto eccellente penetrazione e le caratteristiche di dispersione della luce e non ha alcun effetto nocivo evidente su mammiferi36, viene eliminato dal sangue e organi da 24 h. fluorescenza segnale significativamente aumenta cominciano 4 h dopo amministrazione di substrato, raggiungendo maximal livelli 6 h dopo la somministrazione.
La dose infettiva batterica, modalità di somministrazione della dose infettante e il substrato così come tempo-punti di imaging post infezione eseguendo studi pilota dovrebbe essere standardizzata prima di intraprendere grandi e complessi, esperimenti. Studi pilota possono ridurre notevolmente i tempi e i costi quando un gran numero di animali di imaging poiché una procedura standard può essere ottimizzata prima di fare l'esperimento chiave. Batteriche carichi dovrebbero essere determinati in organi/tessuti di interesse seguendo imaging di tutto il corpo utilizzando trans-illuminazione ed ex vivo formazione immagine del polmone usando epi-illuminazione per convalidare l'origine del segnale e determinare la qualità di correlazione con numeri batterici presenti8. Studi pilota fornirà approfondimenti la soglia di rilevazione, gamma dinamica della tecnica nonché la determinazione delle condizioni sperimentali ottimali per l'imaging.
I vantaggi principali dell'utilizzo di REF imaging come rispetto ad altre strategie di fluorescente e bioluminescenti sono sua alta sensibilità e abilità all'immagine naturale M. tuberculosis ceppi. REF imaging utilizza l'enzima cataliticamente robusto BlaC che è conservata in tutti gli isolati clinici di M. tuberculosis e ceppi di tubercolosi-complesso. La grande sensibilità di REF imaging è a causa del rapido tasso catalitico di BlaC in combinazione con conservazione del prodotto fluorescente fenduto dalla cellula ospite. Continuamente il segnale aumenta fino a quando il substrato è disponibile con conseguente accumulo quasi illimitata del segnale all'interno delle cellule infettate e tessuti. Questa maggiore sensibilità di REF imaging come rispetto ad approcci alternativi di imaging permette di rilevazione specifica di M. tuberculosis entrambi in vitro e in vivo8,23,24, 29.
REF di imaging può essere utilizzato per il rilevamento di batterico senza modificazioni genetiche che permette la sua applicazione diretta a qualsiasi modello di infezione, di animali o laboratorio8,37 o materiali clinici umani29,38 . REF può essere utilizzato per rilevare e immagine una vasta gamma di agenti patogeni39,40, poiché substrati fluorogenici possono essere sviluppati per numerosi obiettivi enzimatici oltre a BlaC come proteasi, chinasi, ureases e β-galattosidasi. Tuttavia, attenzione dovrebbe pensare alla destinazione al fine di garantire Visualizza caratteristiche ottimali per l'imaging. BlaC rappresenta un enzima buon modello per caratteristiche che garantiranno la riuscita applicazione di questa strategia. REF imaging fornisce una lettura immediata sulla carica batterica presente nei polmoni durante le infezioni, che accelera notevolmente i progressi nello studio della patogenesi di tubercolosi, poiché la determinazione dei numeri batterici normalmente richiede tre-sei settimane, ma anche in più rapida crescita organismi questo approccio vi farà risparmiare moltissimo tempo. REF potrebbe anche essere utilizzato per discriminare carcinomi da tubercolosi, un problema chiave nella diagnosi delle lesioni nodulari in pazienti41,42. REF serve come un nuovo strumento per accelerare la formazione immagine traslazionale tubercolosi e può essere applicato anche agli esseri umani, consentendo potenzialmente rapido pronostico dei risultati terapeutici.

Il tasso di crescita lenta di M. tuberculosis è un ostacolo importante nella diagnosi rapida di tubercolosi1,2,3. Mentre la cultura basata diagnosi vogliono settimane per produrre risultati, vetrino ha limiti diagnostici4 bambini5 e pazienti co-infetti con virus dell'immunodeficienza umana6,7. Tecnologie di imaging ottiche sono stati recentemente riconosciute come un'alternativa ai tradizionali metodi diagnostici per la tubercolosi8,9. Fluorescenza e bioluminescenza può essere utilizzati per immagine otticamente M. tuberculosis in animali vivi in tempo reale10,11,12,13,14, 15,16,17,18,19. Imaging ottico ha il vantaggio di una valutazione rapida e specifica di un'infezione con la tubercolosi di M.20,21,22.
Delineiamo dettagli per imaging ottico di M. tuberculosis in topi dal vivo utilizzando REF. Questo metodo è molto sensibile e specifico23,24 e, simile ad altri metodi ottici, è meno costoso rispetto ad altri metodi di imaging25, compreso tomografia computata (CT)26, magnetica la tubercolosi (TB) resonance imaging (MRI)27e F-fluorodesossiglucosio tomografia a emissione di positroni/CT (F-FDG PET/CT)28. REF utilizza personalizzati substrati fluorescenti o bioluminescenti che al momento della scissione di un enzima batterico, producono un prodotto fluorescente8,29. Quindi, ha il vantaggio di non richiedere un reporter micobatterica ricombinante ceppo30,31. Il substrato FRET descritto è composto di un fluorocromo e un quencher collegati da un anello β-lattamico che viene idrolizzato dalla BlaC (β-lattamasi), naturalmente costitutivamente espresso da tubercolosi-complesso Mycobacterium8, 32. i batteri direttamente generano segnale a causa di attività catalitica REF che permette l'amplificazione di molti ordini di grandezza e rivelazione sensibile di M. tuberculosis.
Il substrato REF utilizzato in questo studio ha tessuto eccellente penetrazione negli animali vivi e ridotto sfondo a causa della sua lunghezza d'onda. Con questo substrato di lunghezza d'onda è possibile raggiungere una soglia di rilevazione per M. tuberculosis di quasi 100 Colonia formando unità (CFU) in vitro e < 1000 CFU nei polmoni dei topi in vivo (animale intero)8, 33. REF può essere utilizzato come strumento diagnostico per espettorato, materiali clinici ed anche direttamente in pazienti con micro sistemi endoscopici16,32,33,34 dovuto la sua alta sensibilità e specificità. REF può essere applicato a qualsiasi ceppo clinico di tubercolosi, perché utilizza un enzima batterico prodotto naturalmente, BlaC, per rilevazione presente in tutti i ceppi. Queste caratteristiche rendono REF imaging in generale uno strumento prezioso nella ricerca pre-clinica tubercolosi per facilitare terapeutico e valutazione del vaccino, nonché analisi della patogenesi, ma anche, in definitiva, possono essere applicate alla diagnosi di tubercolosi pazienti.

<table><tbody><tr><td>Isoflurane</td><td>VETONE</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>CNIR800</td><td>Custom synthesized</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fatal Plus solution</td><td>Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7H9 Middlebrook broth</td><td>BD</td><td>271310</td><td></td></tr><tr><td>OADC Middlebrook enrichment</td><td>BD</td><td>212351</td><td></td></tr><tr><td>Sporcidin</td><td></td><td>RE-1284F</td><td></td></tr><tr><td>7H11 Middlebrook Agar</td><td>BD</td><td>212203</td><td></td></tr><tr><td>Madison Chamber</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>XGI-8-gas Anesthesia System</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Imaging software</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transparent nose cones</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;M. tuberculosis&lt;/em&gt; strain CDC1551</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Female BALB/C mice, 5-7 weeks</td><td>Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imaging mycobacterium tuberculosis in mice with reporter enzyme fluorescence

Fluorescenza di enzima reporter (REF) utilizza substrati specifici per enzimi presenti negli organismi bersaglio di interesse per formazione immagine o rilevazione di fluorescenza o bioluminescenza. Utilizziamo BlaC, un enzima espresso costitutivamente da tutti i ceppi di M. tuberculosis . REF permette rapida quantificazione dei batteri nei polmoni dei topi infettati. Lo stesso gruppo di topi possa essere imaged in molti punti di tempo, notevolmente riducendo i costi, l'enumerazione dei batteri più rapidamente, permettendo osservazioni romanzo nelle interazioni ospite-patogeno e aumentando il potere statistico, poiché più animali per gruppo sono facilmente mantenuti . REF è estremamente sensibile a causa della natura catalitica del reporter enzimatica BlaC e specifico a causa del trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza personalizzato (FRET) o substrati fluorogenici utilizzati. REF non richiedono ceppi ricombinanti, garantendo interazioni ospite-patogeno normale. Descriviamo l'imaging dell'infezione di tubercolosi del M. usando un substrato FRET con emissione massima a 800 nm. La lunghezza d'onda del substrato permette imaging sensibile dei tessuti profondi nei mammiferi. Ci illustrerà l'infezione aerosol dei topi con M. tuberculosis, anestesia dei topi, l'amministrazione del substrato REF e imaging ottico. Questo metodo è stato applicato con successo alla valutazione di efficacia di antibiotici targeting per M. tuberculosise interazioni ospite-patogeno.

REF imaging dei topi infettati con la tubercolosi di M. insieme a controllo non infetti del mouse sono mostrati in Figura 1A. I topi infetti ha prodotto una significativamente (P = 0,0057) segnale di fluorescenza maggiore dai polmoni alle post-infezione 6 settimane, rispetto al controllo sulla gestione di substrato. Un corso tipico di tempo per studiare l'efficacia terapeutica contro M. tuberculosis mediante REF potrebbe essere imaging in settimana 1, 2, 4, 6, 15, 24 post-infezione. L'intensità di fluorescenza è quantificato utilizzando epi-illuminazione per tessuti polmonari (Figura 1B). Il segnale costantemente crescente dalla settimana 2 alla settimana 6 nei polmoni dei topi infettati suggerisce che REF è stato in grado di rilevare M. tuberculosis in vivo. Un calo del segnale di fondo dei topi di controllo in un secondo tempo (Figura 1B) potrebbe essere attribuito all'aumento nel corpo massa e volume dei topi in un periodo di 6 settimane, riducendo in tal modo la penetrazione di lunghezza d'onda di eccitazione. Ricostruzione 3D di FLIT delle fonti di fluorescenza in topi infettati con M. tuberculosis è rappresentato in Figura 2A. Le sequenze di immagini vengono acquisite in più punti trans-illuminazione del mouse utilizzando la stessa eccitazione e la serie di filtri di emissione. Queste sequenze di immagini vengono quindi utilizzate per la ricostruzione 3D di fuga alla CHETICHELLA per distribuzione sorgente fluorescente all'interno del soggetto animale. Figura 2 A-D di seguito viene illustrato le diverse direzioni (coronali, sagittali e transaxial) di tomografia del mouse con la registrazione dell'organo polmone. Efficienza NTF mappe per controllare la qualità di ricostruzione sono rappresentati in Figura 2,E. NTF permette di sottrarre le perdite di luce di sfondo dalle immagini di trans-illuminazione attraverso un'immagine supplementare catturata con filtro a densità neutra. L'immagine presa con il filtro di eccitazione specifico (Figura 2E-misurato) è normalizzato all'immagine di trasmissione misurata con lo stesso filtro di emissione e un filtro di eccitazione aperta (Figura 2E simulato) per dare il segnale prodotto dal substrato da solo. Il simile misurato e simulato il profilo di efficienza NTF in sia orizzontale (Figura 2,F) e verticale (Figura 2G) profili con quasi 0% percentuale di errore (Figura 2E-% errore) fornisce la prova di una ricostruzione 3D di buona qualità con riduzione artefatti e localizzazione del segnale migliorata e sensibilità.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig1.jpg"> Figura 1 . Imaging di M. tuberculosis con rif. (A) in vivo imaging dei topi non infetti e infettati con la tubercolosi di M. a 2, 4 e 6 settimane post-infezione. La barra dei colori rappresenta l'intensità del segnale fluorescente in fotoni al secondo per cm2 da basso (giallo) a alta (rosso). (B) quantificazione dell'intensità di fluorescenza da topi infettati con M. tuberculosis. Valori di fluorescenza per entrambi controllo (nero) e infetto (rosso) è rappresentato insieme all'errore standard per ogni punto di tempo. Il significato dei risultati è stato determinato da studenti t-test, i valori di p del < 0,05 sono stati considerati significativi. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig2.jpg"> Figura 2 . 3D FLIT ricostruzione delle sorgenti di fluorescenza in topi infettati con M. tuberculosis. Tomografia del mouse rappresentata in direzioni diverse; A) coronale, B) sagittale e C) transaxial con registrazione dell'organo D) del polmone. La regione di interesse (ROI) 3D è rappresentata come un cubo rosso nel polmone per misurazioni di origine. (E) efficienza NTF mappe di misurato e simulato per verificare la qualità di ricostruzione. Il profilo di efficienza misurato e simulato NTF è stato confrontato, providing di buona qualità di ricostruzione 3D (efficienza simile misurato e simulato NTF). Segnale verticale orizzontale F) e G) profili che rappresentano misurato (blu) e simulata la curva di efficienza NTF (rossa). Le barre orizzontali e verticali rosse indicano la posizione di origine. La barra dei colori rappresenta l'intensità del segnale fluorescente in fotoni al secondo per cm2 da basso (blu) a alta (rosso). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56801/56801fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence at JoVE.com

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Descriviamo l'imaging ottico dei topi infettati con la tubercolosi del micobatterio (M. tuberculosis) usando la fluorescenza di enzima reporter (REF). Questo protocollo facilita la rilevazione sensibile e specifica di M. tuberculosis in modelli animali preclinici per la ricerca di patogenesi, terapeutica e vaccino.

Tubercolosi del micobatterio in topi con fluorescenza enzima Reporter di imaging

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

imaging-mycobacterium-tuberculosis-mice-with-reporter-enzyme

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

7.3K Views.  Texas A&M Health Science Center. Descriviamo l'imaging ottico dei topi infettati con la tubercolosi del micobatterio (M. tuberculosis) usando la fluorescenza di enzima reporter (REF). Questo protocollo facilita la rilevazione sensibile e specifica di M. tuberculosis in modelli animali preclinici per la ricerca di patogenesi, terapeutica e vaccino.

Video: Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

Utilizzando luciferasi di infezioni batteriche immagine in topi

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

Un metodo basato su fluorescenza per studiare la regolazione genica batterica nei tessuti infetti

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

Genetica

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

This protocol outlines the steps required to longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging tomography with integrated &mu;CT (DLIT-&mu;CT) and the subsequent use of this data to generate a four dimensional (4D) movie of the infection cycle. To develop the 4D infection movies and to validate the DLIT-&mu;CT imaging for bacterial infection studies using an IVIS Spectrum CT, we used infection with bioluminescent C. rodentium, which causes self-limiting colitis in mice. In this protocol, we outline the infection of mice with bioluminescent C. rodentium and non-invasive monitoring of colonization by daily DLIT-&mu;CT imaging and bacterial enumeration from feces for 8 days.
The use of the IVIS Spectrum CT facilitates seamless co-registration of optical and &mu;CT scans using a single imaging platform. The low dose &mu;CT modality enables the imaging of mice at multiple time points during infection, providing detailed anatomical localization of bioluminescent bacterial foci in 3D without causing artifacts from the cumulative radiation. Importantly, the 4D movies of infected mice provide a powerful analytical tool to monitor bacterial colonization dynamics in vivo.

4D Multimodality Imaging of Citrobacter rodentium Infections in Mice

Multi-modality imaging is a valuable approach for studying bacterial colonization in small animal models. This protocol outlines infection of mice with bioluminescent Citrobacter rodentium and the longitudinal monitoring of bacterial colonization using composite 3D diffuse light imaging tomography with &mu;CT imaging to create a 4D movie of C. rodentium infection.

4D imaging multimodale di<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infezioni in topi

This protocol outlines the steps required to  longitudinally monitor a bioluminescent bacterial infection using composite 3D diffuse light imaging ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new transgenic reporter mouse model. We chose to visualize interleukin (IL) 22 gene expression because this cytokine has important activities in the intestine, where it contributes to repair tissues damaged by inflammation. Reporter systems offer considerable advantages over other methods of identifying products in vivo. In the case of IL-22, other studies had first isolated cells from tissues and then re-stimulated the cells in vitro. IL-22, which is normally secreted, was trapped inside cells using a drug, and intracellular staining was used to visualize it. This method identifies cells capable of producing IL-22, but it does not determine whether they were doing so in vivo. The reporter design includes inserting a gene for a fluorescent protein (tdTomato) into the IL-22 gene in such a way that the fluorescent protein cannot be secreted and therefore remains trapped inside the producing cells in vivo. Fluorescent producers can then be visualized in tissue sections or by ex vivo analysis through flow cytometry. The actual construction process for the reporter included recombineering a bacterial artificial chromosome that contained the IL-22 gene. This engineered chromosome was then introduced into the mouse genome. Homeostatic IL-22 reporter expression was observed in different mouse tissues, including the spleen, thymus, lymph nodes, Peyer&#39;s patch, and intestine, by flow cytometry analysis. Colitis was induced by T-cell (CD4+CD45RBhigh) transfer, and reporter expression was visualized. Positive T cells were first present in the mesenteric lymph nodes, and then they accumulated inside the lamina propria of the distal small intestine and colon tissues. The strategy using BACs gave good-fidelity reporter expression compared to IL-22 expression, and it is simpler than knock-in procedures.

We describe here a transgenic reporter mouse model to visualize the IL-22-producing cells inside different mouse tissues. This method can be used to track the location of other cytokines or secretary proteins in the mouse.

Visualizzazione di IL-22 che esprimono Linfociti Utilizzando topi Reporter

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

A Custom Multiphoton Microscopy Platform for Live Imaging of Mouse Cornea and Conjunctiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. Multiphoton microscopy (MPM) has become one of the most popular imaging modalities for biomedical study at cellular levels in vivo, advantages include high resolution, deep tissue penetration and minimal phototoxicity. We have designed an MPM imaging platform with a customized mouse eye holder and a stereotaxic stage for imaging ocular surface in vivo. Dual fluorescent protein reporter mouse enables visualization of cell nuclei, cell membranes, nerve fibers, and capillaries within the ocular surface. In addition to multiphoton fluorescence signals, acquiring second harmonic generation (SHG) simultaneously allows for the characterization of collagenous stromal architecture. This platform can be employed for intravital imaging with accurate positioning across the entire ocular surface, including cornea and conjunctiva.

Presented here is a multiphoton microscopic platform for live mouse ocular surface imaging. Fluorescent transgenic mouse enables the visualization of cell nuclei, cell membranes, nerve fibers and capillaries within the ocular surface. Non-linear second harmonic generation signals derived from collagenous structures provide label-free imaging for stromal architectures.

Una piattaforma di microscopia multifoto personalizzata per l'imaging dal vivo di Mouse Cornea e Conjunctiva

Conventional histological analysis and cell culture systems are insufficient to simulate in vivo physiological and pathological dynamics completely. ...

Bioingegneria

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 per codon, the actual error rates vary widely, depending on the species, environment, and codons being studied. We have previously shown that mycobacteria use a two-step pathway for the generation of aminoacylated glutamine and asparagine tRNAs and that this is specifically associated with relatively high error rates due to the modulation of mistranslation rates by an essential component of the pathway, the amidotransferase GatCAB. We modified a previously employed Renilla-Firefly dual-luciferase system that had been used to measure mistranslation rates in Escherichia coli for use in mycobacteria to measure specific mistranslation rates of glutamate at glutamine codons and aspartate for asparagine codons. Although this reporter system was suitable for the accurate estimation of specific error rates, lack of sensitivity and requirements for excessive manipulation steps made it unsuitable for high-throughput applications. Therefore, we developed a second gain-of-function reporter system, using Nluc luciferase and green fluorescent protein (GFP), which is more amenable to medium/high-throughput settings. We used this system to identify kasugamycin as a small molecule that can decrease mycobacterial mistranslation. Although the reporters that we describe here have been used to measure specific types of mycobacterial mistranslation, they may be modified to measure other types of mistranslation in a number of model systems.

In this article, we present two complementary methods to measure specific rates of translational error and mistranslation in the model mycobacterium, Mycobacterium smegmatis, using gain-of-function reporter systems. The methods can be employed to measure accurate error rates in low throughput or relative error rates in a more high-throughput setting.

Misurazione dei tassi di Mistranslazione micobatterica specifica con sistemi reporter di guadagno di funzione

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...

A Luciferase-fluorescent Reporter Influenza Virus for Live Imaging and Quantification of Viral Infection

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, studying IAV requires the use of laborious secondary approaches to detect the presence of the virus in infected cells and/or in animal models of infection. This limitation has been recently circumvented with the generation of recombinant IAVs expressing easily traceable fluorescent or bioluminescent (luciferase) reporter proteins. However, researchers have been forced to select fluorescent or luciferase reporter genes due to the restricted capacity of the IAV genome for including foreign sequences. To overcome this limitation, we have generated a recombinant replication-competent bi-reporter IAV (BIRFLU) stably expressing both a fluorescent and a luciferase reporter gene to easily track IAV infections in vitro and in vivo. To this end, the viral non-structural (NS) and hemagglutinin (HA) viral segments of influenza A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8) were modified to encode the fluorescent Venus and the bioluminescent Nanoluc luciferase proteins, respectively. Here, we describe the use of BIRFLU in a mouse model of IAV infection and the detection of both reporter genes using an in vivo imaging system. Notably, we have observed a good correlation between the expressions of both reporters and viral replication. The combination of cutting-edge techniques in molecular biology, animal research and imaging technologies, provides researchers the unique opportunity to use this tool for influenza research, including the study of virus-host interactions and dynamics of viral infections. Importantly, the feasibility to genetically alter the viral genome to express two foreign genes from different viral segments opens up opportunities to use this approach for: (i) the development of novel IAV vaccines, (ii) the generation of recombinant IAVs that can be used as vaccine vectors for the treatment of other human pathogen infections.

Influenza A viruses (IAVs) are contagious respiratory pathogens that cause annual epidemics and occasional pandemics. Here, we describe a protocol to track viral infections in vivo using a novel recombinant luciferase and fluorescence-expressing bi-reporter IAV (BIRFLU). This approach provides researchers with an excellent tool to study IAV in vivo.

Un virus fluorescente di Luciferasi-fluorescente Reporter per l'imaging dal vivo e la quantificazione dell'infezione virale

Influenza A viruses (IAVs) cause human respiratory disease that is associated with significant health and economic consequences. As with other viruses, ...

Reporter Enzyme Fluorescence Imaging for In Vivo Tracking of Bacterial Infection

Source: Sharan, R., et al. <a href="https://app.jove.com/v/56801">Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence.</a> J. Vis. Exp. (2018).
This video demonstrates the reporter enzyme fluorescence (REF) imaging for in vivo detection of Mycobacterium tuberculosis infection. The infected mice are intraperitoneally injected with a substrate for REF imaging. Upon being hydrolyzed by bacterial &#946;-lactamase enzyme, the substrate emits fluorescence, the detection of which aids evaluation of infection.

Imaging a fluorescenza enzimatica Reporter per il monitoraggio in vivo dell'infezione batterica

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
1. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Imaging and Visualization Techniques

Fluorescence Molecular Tomography: An Imaging Technique for In Vivo Imaging of Fluorescent Protein-tagged Glioblastoma Xenografts in Mouse Model

Source: Benitez, J. A. et al., <a href="https://www.jove.com/video/57448" target="_blank">Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts.</a> J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we describe fluorescence molecular tomography or FMT for in vivo imaging of fluorescent protein-tagged glioblastoma xenografts in mouse models. The technique is useful for elucidating the effects of anti-tumor therapeutics at the molecular level.

Tomografia molecolare a fluorescenza: una tecnica di imaging per l'imaging in vivo di xenotrapianti di glioblastoma con marcatura proteica fluorescente in un modello murino

Source: Benitez, J. A. et al., Fluorescence Molecular Tomography for In Vivo Imaging of Glioblastoma Xenografts. J. Vis. Exp. (2018)
In this video, we ...

Ricerca sul cancro

Cancers of the Nervous System

In vivo studies

A Technique to Detect Extrapulmonary Tuberculosis via Superparamagnetic Nanoprobes

Source: Lee, C., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58227">Synthesis, Characterization, and Application of Superparamagnetic Iron Oxide Nanoprobes for Extrapulmonary Tuberculosis Detection.</a> J. Vis. Exp. (2020).
This video demonstrates a technique for the detection of extrapulmonary tuberculosis. Superparamagnetic iron oxide (SPIO) nanoprobes, conjugated to Mycobacterium-specific antibodies, are injected into a mouse previously infected with Mycobacterium bovis BCG, labeling the granuloma and providing a better imaging contrast for its detection.

Tubercolosi del micobatterio in topi con fluorescenza enzima Reporter di imaging

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video