Il pMSCV-AID-I-Thy1.1 e pKat2 vettori erano un gentile dono della DG Schatz e pVSV-G, pRSV-Rev, e pMDLg / pRRE vettori erano un gentile dono da BR Cullen.

1. Preparazione dei campioni e le cellule <ol><li> Eseguire una preparazione media scala del DNA (midiprep) della sovraespressione o shRNA contenenti costrutti e il vettore retrovirale imballaggio pKat2 o vettori lentivirali imballaggio pVSV-G, pMDLg / pRRE e pRSV-Rev 25. Usare 6 mg per ogni DNA costruire e uno di 4 microgrammi pKat2 (per infezioni retrovirali) o 1,5 mg di DNA per ciascuna delle pVSV-g, pMDLg / pRRE e pRSV-Ap vettori di imballaggio (per le infezioni lentivirali). </li><li> Preparare 23 BOSC media. Per la trasfezione, utilizzare sia emendata Dulbecco modificato Eagle medium (DMEM), così come DMEM completo. Per rendere completo DMEM, aggiungere 1 tampone HEPES%, 1% penicillina-streptomicina-glutamina (PGS), e il 10% di siero di vitello neonato (NCS) per una bottiglia di DMEM. </li><li> Preparare Ramos media. Per la fase di infezione, di dare integrale RPMI-1640 medium (RPMI) con l&#39;aggiunta di 1% HEPES, 1% PGS, e il 10% di siero fetale bovino (FBS) per una bottiglia di RPMI. Per passo la semina delle cellule, mAke &quot;condizionato&quot; dei media da una crescente cellule Ramos in RPMI completo per 2 giorni, riducendo la velocità delle celle verso il basso a 400 X g per 4 minuti e filtrare il surnatante con un filtro 0,2 micron in una bottiglia sterile. Come altri mezzi di comunicazione completo, media condizionata è conservato a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Split 3 x 10 6 23 BOSC cellule in un piatto da 100 mm in 10 ml completo DMEM il giorno prima della trasfezione in modo che le cellule sarà al 50-60% confluenza del giorno di trasfezione. Fai una piastra di cellule per ogni vettore si pensa di trasfezione. E &#39;importante che le cellule non sono state mantenute in coltura per troppo tempo, l&#39;uso delle cellule a basso numero di passaggio o di cellule recentemente scongelato sia per la trasfezione e passi l&#39;infezione per assicurare una buona infezione. </li><li> Includono i controlli per i vostri esperimenti. Per trasfezioni e infezioni, creare un controllo negativo (cellule non infette o untransfected) e un controllo positivo (virus che esprime la GFP e puromicina gene per la resistenza). Per shRNA knock-down compeiments, infettare un bene con un strapazzate o controllo shRNA irrilevante. </li></ol> 2. 23 BOSC trasfezione delle cellule <ol><li> Riscaldare le bottiglie di emendata DMEM e DMEM completo a 37 ° C. </li><li> Rimuovere i supporti dal 23 BOSC cellule e sostituire con 5 ml di DMEM completo. Ritorna le cellule a 37 ° C in incubatore fino al momento dell&#39;uso in fase 2.6. </li><li> Scaldare la bottiglia di FuGENE 6 a temperatura ambiente per 5 minuti poi mescolare brevemente nel vortex (&lt;1 secondo). </li><li> Aliquota 600 microlitri DMEM emendata in una provetta 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Diluire 30 microlitri FuGENE 6 nel 600 microlitri DMEM non emendato, mescolare brevemente nel vortex (&lt;1 secondo), e poi incubare a temperatura ambiente per cinque minuti. Fare attenzione a pipetta direttamente nella media. Non lasciare che la FuGENE 6 toccare i lati del tubo. </li><li> Aggiungere 6 costruire mg o 4 mg e pKat2 (infezioni retrovirali) o 1,5 mg ogni pVSV-G, pMDLg / pRRE e pRSV-Rev (infezioni lentivirale) al DMEM / FuGENE 6 mix, vortice bri<html> Efly (&lt;1 secondo), e poi incubare a temperatura ambiente per 25 minuti. </li><li> Aggiungere il DNA / DMEM / FuGENE 6 mix al 23 BOSC cellule e ritorno a 37 ° C in incubatore per 24 ore. </li><li> Dopo 24 ore, aggiungere 5 ml completo DMEM alle cellule trasfettate e tornare a 37 ° C in incubatore per altre 24 ore. </li></ol> 3. La raccolta particelle virali <ol><li> Raccolto il 10 mL di supporto dal transfettate BOSC 23 celle con una siringa da 10 ml. </li><li> Collegare un filtro di 0,45 micron fino alla fine della siringa e il filtro dei media in un tubo di polipropilene pulita da 15 ml. </li><li> Utilizzare i mezzi di comunicazione virale subito o congelare aliquote come 1 ml in 2 fiale ml criogenico a -80 ° C. </li><li> Dopo la raccolta i mezzi di comunicazione virale, confermano che la trasfezione efficiente si è verificato nelle cellule controllo positivo da FACS. Questo può essere fatto anche per tutti i campioni, se il costrutto contiene un fluorescente (GFP per esempio) o di una superficie cellulare marcatore (ad esempio Thy1). </li></ol>DENOMINAZIONE &quot;&gt; 4. Infezione delle cellule B <ol><li> Semi di 2 ml di 2 x 10 5 cellule / ml cellule Ramos in RPMI completo in un 6-pozzetti 24 ore prima dell&#39;infezione. Anche in questo caso, assicurarsi di utilizzare le celle a basso numero di passaggio o di cellule recentemente scongelati per assicurare una buona infezione. </li><li> Se si utilizza aliquote congelate di virus, il disgelo media virali rapidamente a 37 ° C. </li><li> Mescolare 1 ml mezzi virale con 3 ml di 10 mg / ml polibrene. La concentrazione finale di polibrene dovrebbe essere di 10 mg / ml in un volume totale di 3 ml. </li><li> Aggiungere il virus / polibrene mix per le cellule e mescolare bene pipettando. Come accennato in precedenza, un bene dovrebbe essere utilizzato come controllo non infetto; aggiungere 1 ml di RPMI completo e 3 polibrene microlitri di questo bene, invece di virus 1 ml. Assicurati di infettare un pozzetto con un controllo abbinati negativo. Abbiamo anche infettare un pozzetto con una GFP-vettore contenente, per determinare l&#39;efficienza infezione da FACS. </li><li> Centrifugare il 6-pozzetti a 3000 X g per 90 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Riportare la piastra per37 ° C in incubatore per 48 ore. </li><li> Dopo 48 ore, centrifugare le cellule infette in un tubo da 15 ml in polipropilene a 400 X g per 4 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il supporto per aspirazione, facendo attenzione a non disturbare il pellet. Risospendere le cellule in fresco RPMI. </li><li> Confermare l&#39;efficienza di infezione nel campione di controllo positivo da FACS. Come prima, è possibile farlo per tutti i vostri campioni se il costrutto contiene un fluorescente (GFP per esempio) o una superficie cellulare marcatore (ad esempio Thy1). </li><li> Inizio selezione di celle (se del caso). Il nostro shRNA contenenti costruisce contengono tutti una cassetta resistenza puromicina. Selezioniamo shRNA cellule infettate Ramos con 0,25 mg / mL puromicina. Troviamo che i derivati ​​delle cellule Ramos a volte mostrano alterata suscettibilità alle puromicina e, quindi, eseguire uccidere le curve per ottimizzare la concentrazione di puromicina per ogni derivato. Anche il trattamento di cellule di controllo non infettate con puromicina per confermare che la selezione è efficace. </li></ol> &lt;p class = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. Semina singola cellula Semina singolo può essere eseguita in due modi: da FACS ordinamento o manualmente. <ol><li> FACS: Utilizzare un FACS sorter con un adattatore piastra alle sementi 1 cella / e in una piastra a 96 pozzetti pre-riempita con 100 ml di 40% RPMI/40% condizionata media/20% FBS. Questo metodo dà un sacco cloni cellulari più solo per piastra. </li><li> Manualmente: Contare le cellule. Diluire una parte di cellule a 10 cellule / ml nel 40% RPMI/40% condizionata media/20% FBS. Usare 10 ml di cellule diluito per ogni piatto seminato. Diversi cloni mostrerà di recupero variabili in questa fase quindi è utile per creare piatti diversi a diverse concentrazioni (da 3 a 20 cellule / ml). Utilizzare quello che produce meno escrescenze per evitare cloni derivanti da più celle). Utilizzare una pipetta multicanale per seminare piastre a 96 pozzetti con 100 ml di cellule diluita. </li><li> Posizionare la piastra in un incubatore a 37 ° C per 2 settimane. </li><li> Controllare i singoli pozzi under il microscopio per confermare la presenza di cellule un giorno dopo la semina. Singole cellule può essere difficile da trovare a causa della necessità di messa a fuoco la corretta profondità. Concentrandosi sui numeri ben impresso sul fondo della piastra a 96 pozzetti dovrebbe aiutare. Le cellule sono più facili da trovare quando seminato dal selezionatore FACS poiché la maggior parte i pozzi hanno una cella. </li><li> Dopo 2 settimane, colonie di crescita può essere a mala pena visti ad occhio nudo, cercando in piatti dal basso. Essi sono molto più facili da vedere al microscopio. Le colonie tendono a crescere lungo i bordi del pozzo e di solito più colonie in un piatto crescono lungo il bordo stesso in pozzi diversi. Segna i pozzi con la crescita cellulare robusto e trasferire le cellule a 24-pozzetti in 1 ml di RPMI e tornare a 37 ° C incubatore. </li><li> Mantenere le cellule a 1 x 10 5 a 1 x 10 6 cellule / ml. Modificare i media facendo girare le cellule a 400 X g per 4 minuti a temperatura ambiente e di estrarre il supporto, se necessario. Sostituire con 1 ml di RPMI fresca. </li><li> Dopo diversi days di crescita, il trasferimento alle cellule di un 6-pozzetti e continuare a crescere in un incubatore a 37 ° C. </li><li> Dopo 3 settimane, analizzare i cloni per la perdita di IgM (come descritto di seguito). </li><li> Continuano a crescere le cellule per altre 2 settimane e poi analizzare i cloni di nuovo al punto 5 settimane di tempo. </li></ol> 6. Analisi: la perdita di IgM (3 settimane e 5 settimane) <ol><li> Aliquota 5 x 10 5 cellule di ogni pozzetto in una provetta da microcentrifuga 1,5 ml e girare le celle in basso a 400 X g per 4 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare le cellule da ogni controllo e shRNA-knock-down pozzi, così come un campione per un controllo senza macchia. </li><li> Lavare le cellule in 1 ml di PBS e poi girare di nuovo a 400 X g per 4 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Risospendere in 50 ml di PBS (controllo non colorate) o PBS + 1:20 diluizione del PE-marcato α-umano degli anticorpi IgM. Incubare in ghiaccio per 1 ora. </li><li> Spin le cellule giù a 400 X g per 4 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare il cells due volte con 1 ml di PBS e spin per 400 X g per 4 minuti ogni volta a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere il surnatante e risospendere in 100 ml di PBS. Trasferire le cellule risospese macchiato di un tubo di FACS. </li><li> Analizzare le cellule utilizzando una macchina FACS. </li><li> Confrontare la percentuale di IgM - le cellule dai controlli contro il shRNA smontati cellule. Come notato prima, la perdita IgM come misurato da FACS è un affidabile semi-quantitativa misura di SHM nelle cellule Ramos. </li></ol> 7. Analisi: Conferma knock-down da RT-PCR quantitativa (5 settimane) <ol><li> Aliquota 3 x 10 6 cellule di ogni pozzetto e spin down a 400 X g per 4 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Preparare l&#39;RNA dalla aliquota di cellule. Noi usiamo TRIzol secondo le raccomandazioni del fabbricante. </li><li> Preparare cDNA dalla preparazione RNA. Usiamo 2 mg di RNA e Superscript II secondo le raccomandazioni del fabbricante. </li><li> Eseguire una PCR quantitativa utilizzando il cDNA di confermam knock-down. Utilizziamo GAPDH come controllo normalizzazione, e FAST kit qPCR SYBR in un volume di 10 L di reazione totale. </li></ol> 8. Analisi: il sequenziamento genomico (5 settimane) <ol><li> Aliquota 5 x 10 6 cellule di ogni pozzetto e spin down a 400 X g per 4 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Isolare il DNA genomico da queste cellule. Usiamo il genoma guidata SV kit di purificazione del DNA secondo le raccomandazioni del fabbricante. </li><li> PCR amplifica il DNA genomico per i geni Ig V 19 (Tabella 1) e qualsiasi altri geni di interesse utilizzando la DNA polimerasi KAPA HiFi. Usiamo questa polimerasi a causa del suo basso tasso di errori, ma ogni alta fedeltà polimerasi PCR dovrebbe essere accettabile. </li><li> Gel purificare i prodotti di PCR su un 1% gel di agarosio utilizzando il kit di gel QIAquick estrazione. </li><li> Alcuni polimerasi aggiunge un singolo deossiadenosina (A) residui a fini 3 &#39;dei prodotti di PCR, mentre altri no. Questi 3 &#39;A code sono necessari per il TA TOPOpasso clonazione. La polimerasi KAPA HiFi non lascia 3 &#39;A code. A-coda i prodotti PCR incubando 25 microlitri di gel-purificati prodotto PCR con 3 ml tampone di reazione 10x Taq, 1 ml 10 mM dNTPs, e 1 unità di Taq polimerasi a 72 ° C per 30 minuti. </li><li> Clonare il gel-purificati prodotti PCR utilizzando il TOPO TA Cloning kit. Trasformare i prodotti della reazione TOPO nel fornita E. coli DH5α T1-R cellule competenti e piastra su LB / piastre di agar contenente 100 mg / ml ampicillina ed integrata con 1,6 mg di X-gal in base alle raccomandazioni del fabbricante. </li><li> Invia singole colonie per il sequenziamento. </li><li> Effettuare analisi di sequenza per determinare i tipi e le posizioni di mutazioni. </li></ol> 9. Rappresentante dei risultati: Come notato in precedenza, usiamo un vettore positivo di controllo virale che esprime sia la GFP e un puromicina gene per la resistenza. Noi di solito vede il 50-75% delle cellule GFP + due giornidopo la trasfezione. Nel nostro infezioni, di solito vede il 50-70% delle cellule sono GFP + due giorni dopo l&#39;infezione, ma prima selezione. Dopo la selezione è terminata,&gt; 95% delle cellule sono + GFP. Come esperimenti di rappresentanza, mostriamo gli effetti degli aiuti iperespressione o abbattere un fattore di riparazione nelle cellule Ramos. In particolare, abbiamo transfettate un vettore retrovirale sovraespressione per gli aiuti connessi attraverso un sito IRES per Thy1.1 insieme con il vettore retrovirale pKat2 imballaggio in 23 BOSC cellule. Virus contenenti media è stata filtrata e poi utilizzato per infettare le cellule Ramos. Entrambe le wild-type (WT) e AID sovraesprimono (AID hi) le cellule sono state singola cella seminati e coltivati ​​per 3 settimane, ea quel punto sono stati analizzati per l&#39;espressione genica attraverso qRT-PCR (Figura 2) e per la perdita di IgM da FACS (Figura 3 ). Per la colorazione FACS, le cellule sono state incubate con entrambe le 1:20 diluita PE marcate α-umano di anticorpi IgM e diluito 1:400 FITC-marcato α-ratto CD90/mouseCD90.1 (Thy1.1) anticorpi. In un esperimento separato, che contiene sia un lentivirus irrilevante shRNA (controllo) o un shRNA contro un fattore ad alta fedeltà di riparazione del DNA dovrebbe proteggere contro SHM sono state effettuate in 23 BOSC celle e quindi infettati in un clone di cellule SOCCORSO hi Ramos. Anche in questo caso, l&#39;espressione genica (Figura 4) e la perdita di IgM (Figura 5) sono stati analizzati nei cloni singola cella dopo 3 settimane. Dal momento che il fattore di riparazione è pensato per fornire una protezione contro le mutazioni durante SHM, vediamo un aumento della perdita di IgM e SHM, in assenza del fattore. Se avessimo abbattuto un fattore coinvolto nella generazione SHM mutazioni associate, avremmo visto una diminuzione della perdita di IgM, invece. Come previsto, il nostro qRT-PCR risultati mostrano un marcato aumento dell&#39;espressione SOCCORSO dopo l&#39;infezione di cellule con un vettore iperespressione AIUTO (Figura 2), mentre i livelli del fattore di caduta di riparazione del DNA in presenza di un shRNA mirato contro tale fattore (figura 4 ). Perché clon individualees possono variare, si potrebbe vedere qualche variazione nei livelli di espressione genica. Poiché l&#39;espressione genica può variare, è necessario confermare l&#39;espressione in ogni clone si prevede di analizzare ulteriormente. ShRNAs diverse contro lo stesso gene potrebbe avere effetti diversi sulla espressione genica e, così si dovrebbe schermo shRNAs diversi per determinare quale ha il maggiore impatto. Knockdown può anche essere confermata a livello proteico mediante immunoblotting. Allo stesso modo, cloni individuo può variare notevolmente a livello di perdita di IgM. Alcuni cloni potrebbero dimostrare un effetto &quot;jackpot&quot;, dove una mutazione IgM è verificato in una delle prime divisioni cellulari - per esempio, si vedrà la perdita di IgM&gt; 50% semplicemente perché una delle celle divenne IgM - alla stadio di due cellule. L&#39;influenza di questi cloni è ridotto al minimo calcolando la media per diversi cloni singola cella. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig1.jpg" /> Figura 1. Schematica per la trasmissioneperfezione, l&#39;infezione e l&#39;analisi di perdita di IgM. Si veda il testo per i dettagli. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig2.jpg" /> Figura 2. SOCCORSO sovraespressione in cellule Ramos. WT e AID hi cellule Ramos singola cella sono stati clonati e cresciuti per 3 settimane, in cui è stata misurata l&#39;espressione SOCCORSO punto cloni singoli qRT-PCR. Espressione di GAPDH è stato utilizzato per la normalizzazione. WT è stato impostato a 1. Il valore mediano è indicato. * Indica un valore di p &lt;0,01, calcolato come una coda di Student t-test. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig3.jpg" /> Figura 3. Aumentata perdita di IgM in celle hi AID rispetto alle cellule WT. IgM superficie è stata misurata mediante FACS al punto 3 settimane di tempo, e la percentuale di perdita di IgM è stato calcolato per WT e celle hi AIUTO. (A) Rappresentante trama FACS di un clone WT e un clone AID hi. L&#39;AID sovraespressione vettore ha AID collegato a Thy1.1 tramite un sito IRES, in modo Thy1.1 espressione è utilizzata come un surrogato per l&#39;espressione AIUTO. (B) La quantificazione della perdita di IgM nel WT diversi cloni hi AID. Il valore mediano è indicato. * Indica un valore di p &lt;0,01, calcolato come una coda di Student t-test. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig4.jpg" /> Figura 4. Knockdown di un fattore di riparazione nelle cellule hi AIUTO. Le cellule sono state infettate con un controllo sia irrilevante shRNA (controllo) o il nostro shRNA di interesse (shRNA), e singole cellule seminato. Dopo 3 settimane, l&#39;espressione genica nei cloni individuali è stata misurata mediante qRT-PCR. Espressione di GAPDH è stato utilizzato per la normalizzazione. WT è stato impostato a 1. Il valore mediano è indicato. * Indica un valore di p &lt;0,01, calcolato come una coda di Student t-test. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3573/3573fig5.jpg" /> Figura 5. Perdita IgM Maggiorenelle cellule SOCCORSO hi con livelli abbattuto di un fattore di riparazione. IgM di superficie in diversi cloni è stata misurata mediante FACS al punto 3 settimane di tempo, e la percentuale di perdita di IgM è stata calcolata in cellule ancora AID sovraesprimono. Il valore mediano è indicato. * Indica un valore di p &lt;0,01, calcolato come una coda di Student t-test. <img src="/files/ftp_upload/3573/3573table1.jpg" alt="Tabella 1" /> . Tabella 1 sequenze primer per i geni Ig 19: il Cμ regione costante, la pesante catena regione V (V H), e la luce regione catena V (V L).

<ol>
	<li>Di Noia, J. M., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+antibody+somatic+hypermutation.">Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Biochem. 76, 1-22 (2007).</li><li>Peled, J. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biochemistry+of+somatic+hypermutation.">The biochemistry of somatic hypermutation.</a> Annu. Rev. Immunol. 26, 481-511 (2008).</li><li>Longerich, S., Basu, U., Alt, F., Storb, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination.">AID in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> Curr. Opin. Immunol. 18, 164-174 (2006).</li><li>Bardwell, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+somatic+hypermutation+and+reduced+class-switch+recombination+in+exonuclease+1-mutant+mice.">Altered somatic hypermutation and reduced class-switch recombination in exonuclease 1-mutant mice.</a> Nat. Immunol. 5, 224-229 (2004).</li><li>Martomo, S. A., Yang, W. W., Gearhart, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+Msh6+but+not+Msh3+in+somatic+hypermutation+and+class+switch+recombination.">A role for Msh6 but not Msh3 in somatic hypermutation and class switch recombination.</a> J. Exp. Med. 200, 61-68 (2004).</li><li>Phung, Q. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+hypermutation+at+G+and+C+nucleotides+in+immunoglobulin+variable+genes+from+mice+deficient+in+the+MSH2+mismatch+repair+protein.">Increased hypermutation at G and C nucleotides in immunoglobulin variable genes from mice deficient in the MSH2 mismatch repair protein.</a> J. Exp. Med. 187, 1745-1751 (1998).</li><li>Rada, C., Ehrenstein, M. R., Neuberger, M. S., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hot+spot+focusing+of+somatic+hypermutation+in+MSH2-deficient+mice+suggests+two+stages+of+mutational+targeting.">Hot spot focusing of somatic hypermutation in MSH2-deficient mice suggests two stages of mutational targeting.</a> Immunity. 9, 135-141 (1998).</li><li>Rada, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+isotype+switching+is+inhibited+and+somatic+hypermutation+perturbed+in+UNG-deficient+mice.">Immunoglobulin isotype switching is inhibited and somatic hypermutation perturbed in UNG-deficient mice.</a> Curr. Biol. 12, 1748-1755 (2002).</li><li>Delbos, F., Aoufouchi, S., Faili, A., Weill, J. C., Reynaud, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+polymerase+eta+is+the+sole+contributor+of+A/T+modifications+during+immunoglobulin+gene+hypermutation+in+the+mouse.">DNA polymerase eta is the sole contributor of A/T modifications during immunoglobulin gene hypermutation in the mouse.</a> J. Exp. Med. 204, 17-23 (2007).</li><li>Masuda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+polymerase+eta+is+a+limiting+factor+for+A:T+mutations+in+Ig+genes+and+contributes+to+antibody+affinity+maturation.">DNA polymerase eta is a limiting factor for A:T mutations in Ig genes and contributes to antibody affinity maturation.</a> Eur. J. Immunol. 38, 2796-2805 (2008).</li><li>Lim, D. S., Hasty, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mutation+in+mouse+rad51+results+in+an+early+embryonic+lethal+that+is+suppressed+by+a+mutation+in+p53.">A mutation in mouse rad51 results in an early embryonic lethal that is suppressed by a mutation in p53.</a> Mol. Cell. Biol. 16, 7133-7143 (1996).</li><li>Xiao, Y., Weaver, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+gene+targeted+deletion+by+Cre+recombinase+demonstrates+the+requirement+for+the+double-strand+break+repair+Mre11+protein+in+murine+embryonic+stem+cells.">Conditional gene targeted deletion by Cre recombinase demonstrates the requirement for the double-strand break repair Mre11 protein in murine embryonic stem cells.</a> Nucleic. Acids. Res. 25, 2985-2991 (1997).</li><li>Zhu, J., Petersen, S., Tessarollo, L., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+Nijmegen+breakage+syndrome+gene+NBS1+leads+to+early+embryonic+lethality+in+mice.">Targeted disruption of the Nijmegen breakage syndrome gene NBS1 leads to early embryonic lethality in mice.</a> Curr. Biol. 11, 105-109 (2001).</li><li>Luo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+mRad50+causes+embryonic+stem+cell+lethality,+abnormal+embryonic+development,+and+sensitivity+to+ionizing+radiation.">Disruption of mRad50 causes embryonic stem cell lethality, abnormal embryonic development, and sensitivity to ionizing radiation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 96, 7376-7381 (1999).</li><li>Pavri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation-induced+cytidine+deaminase+targets+DNA+at+sites+of+RNA+polymerase+II+stalling+by+interaction+with+Spt5.">Activation-induced cytidine deaminase targets DNA at sites of RNA polymerase II stalling by interaction with Spt5.</a> Cell. 143, 122-133 (2010).</li><li>Lee-Theilen, M., Matthews, A. J., Kelly, D., Zheng, S., Chaudhuri, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CtIP+promotes+microhomology-mediated+alternative+end+joining+during+class-switch+recombination.">CtIP promotes microhomology-mediated alternative end joining during class-switch recombination.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 75-79 (2011).</li><li>Basu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+RNA+exosome+targets+the+AID+cytidine+deaminase+to+both+strands+of+transcribed+duplex+DNA+substrates.">The RNA exosome targets the AID cytidine deaminase to both strands of transcribed duplex DNA substrates.</a> Cell. 144, 353-363 (2011).</li><li>Yabuki, M., Fujii, M. M., Maizels, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MRE11-RAD50-NBS1+complex+accelerates+somatic+hypermutation+and+gene+conversion+of+immunoglobulin+variable+regions.">The MRE11-RAD50-NBS1 complex accelerates somatic hypermutation and gene conversion of immunoglobulin variable regions.</a> Nat. Immunol. 6, 730-736 (2005).</li><li>Sale, J. E., Neuberger, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TdT-accessible+breaks+are+scattered+over+the+immunoglobulin+V+domain+in+a+constitutively+hypermutating+B+cell+line.">TdT-accessible breaks are scattered over the immunoglobulin V domain in a constitutively hypermutating B cell line.</a> Immunity. 9, 859-869 (1998).</li><li>Cumbers, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+and+iterative+affinity+maturation+of+antibodies+in+vitro+using+hypermutating+B-cell+lines.">Generation and iterative affinity maturation of antibodies in vitro using hypermutating B-cell lines.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1129-1134 (2002).</li><li>Papavasiliou, F. N., Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-cycle-regulated+DNA+double-stranded+breaks+in+somatic+hypermutation+of+immunoglobulin+genes.">Cell-cycle-regulated DNA double-stranded breaks in somatic hypermutation of immunoglobulin genes.</a> Nature. 408, 216-221 (2000).</li><li>Parsa, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AID+mutates+a+non-immunoglobulin+transgene+independent+of+chromosomal+position.">AID mutates a non-immunoglobulin transgene independent of chromosomal position.</a> Mol. Immunol. 44, 567-575 (2007).</li><li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonal+instability+of+V+region+hypermutation+in+the+Ramos+Burkitt's+lymphoma+cell+line.">Clonal instability of V region hypermutation in the Ramos Burkitt's lymphoma cell line.</a> Int. Immunol. 13, 1175-1184 (2001).</li><li>Ukai, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+a:T+mutations+is+dependent+on+cellular+environment+but+independent+of+mutation+frequency+and+target+gene+location.">Induction of a:T mutations is dependent on cellular environment but independent of mutation frequency and target gene location.</a> J. Immunol. 181, 7835-7842 (2008).</li><li>Dull, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+third-generation+lentivirus+vector+with+a+conditional+packaging+system.">A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system.</a> J. Virol. 72, 8463-8471 (1998).</li><li>Nakamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+frequency+class+switching+of+an+IgM++B+lymphoma+clone+CH12F3+to+IgA++cells.">High frequency class switching of an IgM+ B lymphoma clone CH12F3 to IgA+ cells.</a> Int. Immunol. 8, 193-201 (1996).</li><li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+expression+of+activation-induced+cytidine+deaminase+(AID),+a+novel+member+of+the+RNA-editing+deaminase+family+in+germinal+center+B+cells.">Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells.</a> J. Biol. Chem. 274, 18470-18476 (1999).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Come discusso precedentemente, i modelli di linee cellulari per la diversificazione degli anticorpi sono diventati un punto di partenza per identificare nuove proteine ​​che influenzano le diverse fasi durante la diversificazione degli anticorpi. Vi presentiamo qui un metodo per l&#39;utilizzo di infezione virale alle proteine ​​o knock-down o iperespressione in cellule B Ramos linea e quindi esaminare l&#39;impatto sulla SHM. Per questi studi, ci avvaliamo sia Ramos WT e AID hi...

Reagenti suggerito - la maggior parte di questi possono essere sostituiti con prodotti simili di altri vendor. <table border="1" ><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th > Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti </th></tr><tr><td > 6-ben chiaro TC-trattati piastre </td><td > Corning </td><td> 3516 </td><td ></td></tr><tr><td > 10 mL BD Luer-Loksyringes </td><td > BD Medical </td><td > 309604 </td><td ></td></tr><tr><td> 24-ben chiaro TC-trattati piastre </td><td > Corning </td><td > 3526 </td><td></td></tr><tr><td > 96-polistirolo ben chiaro fondo piatto TC-trattati micropiastre </td><td > Corning </td><td > 3596 </td><td ></td></tr><tr><td > TC-100 millimetri trattati cultura piatti </td><td > Corning </td><td > 430167 </td><td ></td></tr><tr><td > Filtri per siringa Acrodisc, 0,45 micron </td><td > Pall Life Sciences </td><td > 4604 </td><td ></td></tr><tr><td > Agar </td><td > Teknova </td><td > A7777 </td&gt; <td ></td></tr><tr><td > Agarosio </td><td > GeneMate </td><td> E-3120-500 </td><td ></td></tr><tr><td > Ampicillina </td><td> Sigma </td><td > A0166 </td><td> 100 mg / mL in acqua </td></tr><tr><td > BD FACSCanto II citometro a flusso </td><td> BD Biosciences </td><td ></td><td > o simili </td></tr><tr><td> BD Falcon rotondo fondo polistirolo tubi </td><td> BD Biosciences </td><td > 352054 </td><td > per FACS </td></tr><tr><td > BOSC 23 celle </td><td > ATCC </td><td > CRL-11270 </td><td ></td></tr><tr><td > CO 2 incubatore capace di 37 ° C </td><td ></td><td ></td><td ></td></tr><tr><td > DMEM (medio Dulbecco modificato Eagle) </td><td > Sigma </td><td> D6429 </td><td ></td></tr><tr><td > FBS (siero fetale bovino) </td><td > Gemini Bio-Prodotti </td><td > 100-106 </td><td ></td></tr><tr><td > FITC α-ratto CD90/mouse CD90.1 anticorpi </td><td > BioLegend </td><td > 202503 </td><td > FITCα-Thy1.1 </td></tr><tr><td > FuGENE 6 Transfection Reagent </td><td > Roche </td><td > 11814443001 </td><td></td></tr><tr><td > HEPES soluzione tampone </td><td > Invitrogen </td><td > 15630-080 </td><td ></td></tr><tr><td > KAPA HiFi DNA polimerasi </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK2101 </td><td ></td></tr><tr><td > LB Broth (brodo lisogenia - Luria) Polvere </td><td > Difco </td><td > 240230 </td><td ></td></tr><tr><td > MISSIONE TRC shRNA magazzino glicerolo batterico </td><td > Sigma </td><td ></td><td> shRNA vettori </td></tr><tr><td > NCS (siero di vitello neonato) </td><td > Gemini Bio-Prodotti </td><td > 100-504 </td><td ></td></tr><tr><td> PBS (soluzione tampone fosfato) </td><td > Invitrogen </td><td> 70011 </td><td > diluito a 1x in acqua </td></tr><tr><td > PE-α umano anticorpi IgM </td><td > BioLegend </td><td > 314508 </td><td ></td></tr><tr><td > PGS (penicillina-streptomicina-glutamina soluzione) </td><td > Gemini Bio-Prodotti </td><td > 400-110 </td><td ></td></tr><tr><td> Polibrene (hexadimethrine bromuro) </td><td > Sigma </td><td > 107689 </td><td > 10 mg / ml in acqua </td></tr><tr><td > PureYield sistema Midiprep plasmidi </td><td > Promega </td><td > A2495 </td><td></td></tr><tr><td> Puromicina </td><td> Sigma </td><td > P8833 </td><td > 250 mcg / ml in acqua </td></tr><tr><td > QIAquick gel kit di estrazione </td><td > QIAGEN </td><td > 28706 </td><td ></td></tr><tr><td> Ramos (RA 1) le cellule </td><td > ATCC </td><td > CRL-1596 </td><td ></td></tr><tr><td > RPMI-1640 medium </td><td > Sigma </td><td > R8758 </td><td ></td></tr><tr><td > SuperScript II </td><td > Invitrogen </td><td > 18064-022 </td><td></td></tr><tr><td > SYBR VELOCE qPCR kit </td><td > KAPA Biosystems </td><td > KK4601 </td><td ></td></tr><tr><td > Taq DNA polimerasi </td><td > Invitrogen </td><td > 18038-042 </td><td ></td></tr><tr><td > TOPO TA Cloning Kit </td><td > Vitrogenerazione </td><td > K4520-01 </td><td ></td></tr><tr><td > TRIzol </td><td > Invitrogen </td><td > 15596-026 </td><td ></td></tr><tr><td > Wizard SV sistema di purificazione del DNA genomico </td><td > Promega </td><td > A2361 </td><td ></td></tr><tr><td > X-Gal [5-bromo-4-cloro-3-indoyl-β-D-galatopyranoside] </td><td > Growcells </td><td > C-5687 </td><td > 40 mg / ml in DMSO </td></tr></tbody></table>

assessing somatic hypermutation in ramos b cells after overexpression or knockdown of specific genes

Le cellule B iniziano la loro vita con gli anticorpi a bassa affinità generato da V (D) J ricombinazione. Tuttavia, al rilevamento un agente patogeno, la (V) regione variabile di un gene immunoglobuline (Ig) è mutato circa 100.000 volte più del resto del genoma attraverso la mutazione somatica (SHM), con conseguente 1,2 anticorpi ad alta affinità. Inoltre, passare ricombinazione di classe (CSR) produce anticorpi con differenti funzioni effettrici a seconda del tipo di risposta immunitaria che è necessario per un particolare agente patogeno. Sia CSR e SHM vengono avviate attraverso l&#39;attivazione indotta citidina deaminasi (AID), che deamina residui di citosina nel DNA per produrre uracils. Queste uracils sono trattati con forme soggette a errori di percorsi di riparazione, alla fine portano a mutazioni e la ricombinazione 1-3. La nostra attuale comprensione dei dettagli molecolari di SHM e RSI provenire da una combinazione di studi in topi, pile, di linee cellulari e cellule-free esperimenti. Modelli murini rimangono il gold standard con fori genetica che mostrano ruoli critici per la riparazione di molti fattori (ad esempio Ung, MSH2, MSH6, Exo1 e polimerasi η) 4-10. Tuttavia, non tutti i geni sono suscettibili per gli studi di eliminazione diretta. Per esempio, KO di proteine ​​diverse rottura a doppio filamento di riparazione sono embrionalmente letali o mettere in pericolo lo sviluppo delle cellule B 11-14. Inoltre, a volte la funzione specifica di una proteina in SHM o CSR può essere mascherato da più difetti globale causato dalla eliminazione diretta. Inoltre, dal momento che gli esperimenti sui topi possono essere lunghe, alterando l&#39;espressione di singoli geni in linee cellulari è diventata una tappa sempre più popolare primi a identificare e caratterizzare geni candidati 15-18. Ramos - una linea cellulare di linfoma di Burkitt che subisce costitutivamente SHM - è stata una popolare linea cellulare modello per studiare SHM 18-24. Un vantaggio di cellule Ramos è che hanno un built-in semi conveniente-Quantitativa misura di SHM. Cellule wild-type esprimere IgM e, come raccogliere le mutazioni, alcune delle mutazioni knock out espressione IgM. Pertanto, il saggio perdita IgM di fluorescenza attivata la scansione cellulare (FACS) fornisce una rapida lettura per il livello di SHM. Una misura più quantitativa di SHM possono essere ottenute direttamente sequenziamento dei geni anticorpali. Dato che le cellule Ramos è difficile trasfezione, produciamo derivati ​​stabili che hanno aumentato o diminuito l&#39;espressione di un singolo gene da infettare le cellule con costrutti retrovirali o lentivirali che contengono una cassetta iperespressione o un breve hairpin RNA (shRNA), rispettivamente. Qui, descriviamo il modo in cui infettare le cellule Ramos e quindi utilizzare queste cellule per studiare il ruolo di specifici geni in SHM (Figura 1).

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes at JoVE.com

Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Ci descrivono come eseguire infezioni retrovirali o lentivirali di sovraespressione o shRNA contenenti costruisce nell&#39;essere umano a cellule B Ramos line e come misurare mutazione somatica in queste cellule.

Valutare mutazione somatica nel Ramos cellule B dopo iperespressione o Knockdown di specifici geni

B cells start their life with low affinity antibodies generated by V(D)J recombination.  However, upon detecting a pathogen, the variable (V) region of an ...

assessing-somatic-hypermutation-ramos-b-cells-after-overexpression-or

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

18.1K Views.  Duke University. Ci descrivono come eseguire infezioni retrovirali o lentivirali di sovraespressione o shRNA contenenti costruisce nell'essere umano a cellule B Ramos line e come misurare mutazione somatica in queste cellule.

Video: Assessing Somatic Hypermutation in Ramos B Cells after Overexpression or Knockdown of Specific Genes

Murine Model of CD40-activation of B cells

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L), human B cells can be expanded without difficulties from small amounts of peripheral blood within 14 days to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients1-4. CD40-B cells express important lymph node homing molecules and can attract T cells in vitro5. Furthermore they efficiently take up, process and present antigens to T cells6,7. CD40-B cells were shown to not only prime na&iacute;ve, but also expand memory T cells8,9. Therefore CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been studied as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cell-based immunotherapy1,5,10. In order to further study whether CD40-B cells induce effective T cell responses in vivo and to study the underlying mechanism we established a cell culture system for the generation of murine CD40-activated B cells. Using splenocytes or purified B cells from C57BL/6 mice for CD40-activation, optimal conditions were identified as follows: Starting from splenocytes of C57BL/6 mice (haplotype H-2b) lymphocytes are purified by density gradient centrifugation and co-cultured with HeLa cells expressing recombinant murine CD40 ligand (tmuCD40L HeLa)11. Cells are recultured every 3-4 days and key components such as CD40L, interleukin-4, -Mercaptoethanol and cyclosporin A are replenished. In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated murine CD40-B cells (mCD40B) with similar APC-phenotype to human CD40-B cells (Fig 1a,b). CD40-stimulation leads to a rapid outgrowth and expansion of highly pure (&gt;90%) CD19+ B cells within 14 days of cell culture (Fig 1c,d). To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the murine CD40 ligand on the transfectants has to be controlled regularly (Fig 2). Murine CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation and differentiation as well as to investigate their potential to function as APC in vitro and in vivo. Moreover, they represent a promising tool for establishing therapeutic or preventive vaccination against tumors and will help to answer questions regarding safety and immunogenicity of this approach12.

In this video, we demonstrate the procedure of CD40-activation and expansion of murine B cells from splenocytes of C57BL/6 mice, which can be used as a model antigen-presenting cell (APC) to study induction of immunity.

Modello murino di CD40-attivazione delle cellule B

Research on B cells has shown that CD40 activation improves their antigen presentation capacity. When stimulated with interleukin-4 and CD40 ligand ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Induction and Assessment of Class Switch Recombination in Purified Murine B Cells

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the immunoglobulin locus undergoes a series of genetic modifications to alter the binding capacity and effector function of secreted antibodies. This process is highlighted by a genomic recombination event known as class switch recombination (CSR) in which the default IgM antibody isotype is substituted for one of IgG, IgA, or IgE. Each isotype possesses distinct effector functions thereby making CSR crucial to the maintenance of immunity. Diversification of the immunoglobulin locus is mediated by the enzyme activation-induced cytidine deaminase (AID). A schematic video describing this process in detail is available online (http://video.med.utoronto.ca/videoprojects/immunology/aam.html). AID's activity and the CSR pathway are commonly studied in the assessment of B cell function and humoral immunity in mice. The protocol outlined in this report presents a method of B cell isolation from murine spleens and subsequent stimulation with bacterial lipopolysaccharide (LPS) to induce class switching to IgG3 (for other antibody isotypes see Table 1). In addition, the fluorescent cell staining dye Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) is used to monitor cell division of stimulated cells, a process crucial to isotype switching 1, 2. The regulation of AID and the mechanism by which CSR occurs are still unclear and thus in vitro class switch assays provide a reliable method for testing these processes in various mouse models. These assays have been previously used in the context of gene deficiency using knockout mice 3. Furthermore, in vitro switching of B cells can be preceded by viral transduction to modulate gene expression by RNA knockdown or transgene expression 4-6. The data from these types of experiments have impacted our understanding of AID activity, resolution of the CSR reaction, and antibody-mediated immunity in the mouse.

Following antigen exposure, subpopulations of activated B cells undergo a process known as class switch recombination (CSR) to produce antibody isotypes with distinct effector functions. The protocol outlined in this report explains how CSR can be induced and analyzed in vitro for the purposes of studying B cell function.

Induzione e Valutazione della ricombinazione Classe Switch in depurata cellule B murini

Humoral immunity is the branch of the immune system maintained by B cells and mediated through the secretion of antibodies. Upon B cell activation, the ...

Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully generated and infused T-cells specific for Epstein Barr virus (EBV), cytomegalovirus (CMV) and Adenovirus (Adv) using monocytes and EBV-transformed lymphoblastoid cell (EBV-LCL) gene-modified with an adenovirus vector as antigen presenting cells (APCs). As few as 2x105/kg trivirus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) proliferated by several logs after infusion and appeared to prevent and treat even severe viral disease resistant to other available therapies. The broader implementation of this encouraging approach is limited by high production costs, complexity of manufacture and the prolonged time (4-6 weeks for EBV-LCL generation, and 4-8 weeks for CTL manufacture &#x2013; total 10-14 weeks) for preparation. To overcome these limitations we have developed a new, GMP-compliant CTL production protocol. First, in place of adenovectors to stimulate T-cells we use dendritic cells (DCs) nucleofected with DNA plasmids encoding LMP2, EBNA1 and BZLF1 (EBV), Hexon and Penton (Adv), and pp65 and IE1 (CMV) as antigen-presenting cells. These APCs reactivate T cells specific for all the stimulating antigens. Second, culture of activated T-cells in the presence of IL-4 (1,000U/ml) and IL-7 (10ng/ml) increases and sustains the repertoire and frequency of specific T cells in our lines. Third, we have used a new, gas permeable culture device (G-Rex) that promotes the expansion and survival of large cell numbers after a single stimulation, thus removing the requirement for EBV-LCLs and reducing technician intervention. By implementing these changes we can now produce multispecific CTL targeting EBV, CMV, and Adv at a cost per 106 cells that is reduced by &gt;90%, and in just 10 days rather than 10 weeks using an approach that may be extended to additional protective viral antigens. Our FDA-approved approach should be of value for prophylactic and treatment applications for high risk allogeneic HSCT recipients.

A rapid, simple and cost-effective protocol for the generation of donor-derived multivirus-specific CTLs (rCTL) for infusion to allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients at risk of developing CMV, Adv or EBV infections. This manufacturing process is GMP-compliant and should ensure the broader implementation of T-cell immunotherapy beyond specialized centers.

Generazione di Multivirus-cellule T specifiche per prevenire / curare infezioni virali dopo trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche

Viral infections cause morbidity and mortality in allogeneic hematopoietic stem cell transplant (HSCT) recipients. We and others have successfully ...

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the simultaneous infection of the cell by a number of phages, one of two pathways is chosen: lytic (virulent) or lysogenic (dormant)3,4. We recently developed a method for fluorescently labeling individual phages, and were able to examine the post-infection decision in real-time under the microscope, at the level of individual phages and cells5. Here, we describe the full procedure for performing the infection experiments described in our earlier work5. This includes the creation of fluorescent phages, infection of the cells, imaging under the microscope and data analysis. The fluorescent phage is a "hybrid", co-expressing wild- type and YFP-fusion versions of the capsid gpD protein. A crude phage lysate is first obtained by inducing a lysogen of the gpD-EYFP (Enhanced Yellow Fluorescent Protein) phage, harboring a plasmid expressing wild type gpD. A series of purification steps are then performed, followed by DAPI-labeling and imaging under the microscope. This is done in order to verify the uniformity, DNA packaging efficiency, fluorescence signal and structural stability of the phage stock. The initial adsorption of phages to bacteria is performed on ice, then followed by a short incubation at 35&deg;C to trigger viral DNA injection6. The phage/bacteria mixture is then moved to the surface of a thin nutrient agar slab, covered with a coverslip and imaged under an epifluorescence microscope. The post-infection process is followed for 4 hr, at 10 min interval. Multiple stage positions are tracked such that ~100 cell infections can be traced in a single experiment. At each position and time point, images are acquired in the phase-contrast and red and green fluorescent channels. The phase-contrast image is used later for automated cell recognition while the fluorescent channels are used to characterize the infection outcome: production of new fluorescent phages (green) followed by cell lysis, or expression of lysogeny factors (red) followed by resumed cell growth and division. The acquired time-lapse movies are processed using a combination of manual and automated methods. Data analysis results in the identification of infection parameters for each infection event (e.g. number and positions of infecting phages) as well as infection outcome (lysis/lysogeny). Additional parameters can be extracted if desired.

Following Cell-fate in E. coli After Infection by Phage Lambda

This article describes the procedure for preparing a fluorescently-labeled version of bacteriophage lambda, infection of E. coli bacteria, following the infection outcome under the microscope, and analysis of infection results.

A seguito di Cell-destino<em&gt; E. coli</em&gt; Dopo l&#39;infezione da fago lambda

The system comprising bacteriophage (phage) lambda and the bacterium E. coli has long served as a paradigm for cell-fate determination1,2. Following the ...

Detection of True IgE-expressing Mouse B Lineage Cells

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH isotypes, such as IgA, IgE and IgG. Measurement of IgH CSR in vitro is a key method for the study of a number of biologic processes ranging from DNA recombination and repair to aspects of molecular and cellular immunology. In vitro CSR assay involves the flow cytometric measurement surface Ig expression on activated B cells. While measurement of IgA and IgG subclasses is straightforward, measurement of IgE by this method is problematic due to soluble IgE binding to Fc&#949;RII/CD23 expressed on the surface of activated B cells. Here we describe a unique procedure for accurate measurement of IgE-producing mouse B cells that have undergone CSR in culture. The method is based on trypsin-mediated cleavage of IgE-CD23 complexes on cell surfaces, allowing for detection of IgE-producing B lineage cells by cytoplasmic staining. This procedure offers a convenient solution for flow cytometric analysis of CSR to IgE.

In vitro analysis of class switch recombination in mice is challenging due to cytophilic IgE molecules bound to Fc receptors on the surface of B cells. We describe a method for IgE detection using trypsin-mediated cleavage of surface-bound IgE prior to fixation and permeabilization for cytoplasmic fluorescence staining.

Rilevazione di True IgE-esprimono mouse B Cells Lineage

B lymphocyte immunoglobulin heavy chain (IgH) class switch recombination (CSR) is a process wherein initially expressed IgM switches to other IgH ...

Detection and Enrichment of Rare Antigen-specific B Cells for Analysis of Phenotype and Function

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate and enrich these rare cells for studies of their phenotype and biology. Approaches are inevitably based on the principle that B cells recognize native antigen by virtue of cell surface receptors that are representative in specificity of antibodies that will eventually be secreted by their differentiated daughters. Perhaps the most obvious approach to the problem involves use of fluorochrome-conjugated antigens in conjunction with fluorescence-activated cell sorting (FACS). However, the utility of these methods is limited by cell frequency and the achievable rate of analysis and isolation by electronic sorting. A novel method to enrich rare antigen-specific B cells using magnetic nanoparticles that results in high yield enrichment of antigen-reactive B cells from large starting cell populations is described. This method enables improved monitoring of the phenotype and biology of antigen reactive cells before and following in vivo antigen encounter, such as after immunization or during development of autoimmunity.

A simple yet effective method that employs magnetic nanoparticles to detect and enrich antigen-reactive B cells for functional and phenotypic analysis is described.

Rilevamento e l&#39;arricchimento di Rare antigene-specifiche cellule B per l&#39;analisi del fenotipo e funzione

B cells reactive with a specific antigen usually occur at a frequency of &lt;0.05% of lymphocytes. For decades researchers have sought methods to isolate ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple condensation reactions. DHDDS (dehydrodolichyl diphosphate synthase) is a eukaryotic long-chain cis-PT (forming cis double bonds from the condensation reaction) that catalyzes chain elongation of farnesyl diphosphate (FPP, an allylic diphosphate) via multiple condensations with isopentenyl diphosphate (IPP). DHDDS is of biomedical importance, as a non-conservative mutation (K42E) in the enzyme results in retinitis pigmentosa, ultimately leading to blindness. Therefore, the present protocol was developed in order to acquire large quantities of purified DHDDS, suitable for mechanistic studies. Here, the usage of protein fusion, optimized culture conditions and codon-optimization were used to allow the overexpression and purification of functionally active human DHDDS in E. coli. The described protocol is simple, cost-effective and time sparing. The homology of cis-PT among different species suggests that this protocol may be applied for other eukaryotic cis-PT as well, such as those involved in natural rubber synthesis.

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

A simple protocol for overexpression and purification of codon-optimized, human cis-prenyltransferase, under non-denaturing conditions, from Escherichia coli, is described, along with an enzymatic activity assay. This protocol can be generalized for production of other cis- prenyltransferase proteins in quantity and quality suitable for mechanistic studies.

Sovrapressione e purificazione dell&#39;uomo<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferasi in<emEscherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Generazione di anticorpi monoclonali umani discriminante da rari B antigene-specifiche cellule circolanti nel sangue

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...

Assessing Cellular Stress and Inflammation in Discrete Oxytocin-secreting Brain Nuclei in the Neonatal Rat Before and After First Colostrum Feeding

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression of proteins known to respond to metabolic stress was measured in brain-nuclei isolates using Western blotting. This was done to assess whether metabolic stress-induced nutrient insufficiency in the body triggered neuronal stress. We have previously demonstrated that nutrient insufficiency in neonates elicits metabolic stress in the gut. Furthermore, colostrum oxytocin modulates cellular stress response, inflammation, and autophagy markers in newborn rat gut villi prior to and after first feed. Signaling protein markers associated with the endoplasmic reticulum stress [ER chaperone binding immunoglobulin protein (BiP), eukaryotic translation initiation factor 2A (eIF2a), and eIF2a kinase protein kinase R (p-PKR)], as well as two inflammation-signaling proteins [nuclear factor-&#954;B (NF-kB) and inhibitor &#954;B (IkB)], were measured in newborn brain nuclei [nucleus of the solitary tract (NTS), paraventricular nucleus (PVN), supra-optic nucleus (SON), cortex (CX), striatum nuclei (STR), and medial preoptic nucleus (MPO)] before the first feed (unprimed by colostrum) and after the start of nursing (primed by colostrum). Expression of BiP/GRP78 and p-eIF2a were upregulated in unprimed and downregulated in primed NTS tissue. NF-kB was retained (high) in the CX, STR, and MPO cytoplasm, whereas NF-kB was lower and unchanged in NTS, PVN, and SON in both conditions. The collective BiP and p-eIF2 findings are consistent with a stress response. eIf2a was phosphorylated by dsRNA dependent kinase (p-PKR) in the SON, CX, STR, and MPO. However, in the NTS (and to a lesser extent in PVN), eIf2a was phosphorylated by another kinase, general control nonderepressible-2 kinase (GCN2). The stress-modulating mechanisms previously observed in newborn gut enterocytes appear to be mirrored in some OTR-rich brain regions. The NTS and PVN may utilize a different phosphorylation mechanism (under nutrient deficiency) from other regions and be refractory to the impact of nutrient insufficiency. Collectively, this data suggests that brain responses to nutrient insufficiency stress are offset by signaling from colostrum-primed enterocytes.

Here, we present a protocol to isolate brain nuclei in the neonatal rat brain in conjunction with first colostrum feeding. This technique allows the study of nutrient insufficiency stress in the brain as modulated by enterocyte signaling.

Valutazione Stress cellulare e l'infiammazione nei Nuclei di cervello che secerne l'ossitocina discreti nel ratto neonatale prima e dopo la prima poppata di colostro

The goal of this protocol is to isolate oxytocin-receptor rich brain nuclei in the neonatal brain before and after first colostrum feeding. The expression ...

Analysis of Shear Flow-induced Migration of Murine Marginal Zone B Cells In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, MZBs must migrate up the shear force of blood flow. We present here a method for analyzing this flow-induced MZB migration in vitro. First, MZBs are isolated from the mouse spleen. Second, MZBs are settled on integrin ligands in flow chamber slides, exposed to shear flow, and imaged under a microscope while migrating. Third, images of the migrating MZBs are processed using the MTrack2 automatic cell tracking plugin for ImageJ, and the resulting cell tracks are quantified using the Ibidi chemotaxis tool. The migration data reveal how fast the cells move, how often they change direction, whether the shear flow vector affects their migration direction, and which integrin ligands are involved. Although we use MZBs, the method can easily be adapted for analyzing migration of any leukocyte that responds to the force of shear flow.

Marginal zone B cells (MZBs) respond to the force of shear flow by re-orienting their migration path up the flow. This protocol shows how to record and analyze the migration using a fluidics unit, pump, microscope imaging system, and free software.

Analisi di taglio indotta da flusso di migrazione delle cellule di B di zona marginale murino In Vitro

Marginal zone B cells (MZBs) are a population of B cells that reside in the mouse splenic marginal zones that envelop follicles. To reach the follicles, ...