Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni del Canadian Institutes of Health Research (numero di sovvenzione MOP 38040) a R.K., Muscular Dystrophy Association (USA) a R.K., Families of SMA to R.K. e L.M.M, The SMA Trust to T.H.G., e The Muscular Dystrophy Campaign to T.H.G.. L.M.M è un destinatario di una Borsa di studio post-dottorato della Multiple Sclerosis Society of Canada, e R.K. è un destinatario di una cattedra di ricerca sanitaria universitaria presso l'Università di Ottawa.

Tutte le procedure dovrebbero essere eseguite secondo gli standard di cura degli animali stabiliti dall'istituzione.
1. Dissezione della muscolatura addominale dal topo
<ol><li>Prima di iniziare, coformare il 4% di paraformaldeide (PFA). Attenzione: tenere sempre pfa all'interno di una cappa aspirante e indossare dispositivi di protezione appropriati.</li>
	<li>Eutanasia del mouse con un metodo approvato. Nota: Il mouse mostrato nel video è stato eutanasiato da overdose di CO2 e lussazione cervicale. Questo mouse è un mouse di tipo jolly di 4 settimane su uno sfondo ibrido CD1/C57Bl6. Questo topo è stato allevato nelle strutture per animali dell'Università di Ottawa da topi originariamente acquistati.</li>
	<li>Fai un'incisione iniziale attraverso la pelle a livello dell'anca e taglia la pelle intorno al topo.</li>
	<li>Staccare la pelle, tirando verso l'alto fino a raggiungere il livello dell'avaro.</li>
	<li>Tagliare la muscolatura addominale a livello dell'anca e continuare l'incisione fino a raggiungere la colonna vertebrale.</li>
	<li>A questo punto, iniziare a tagliare verso l'alto attraverso la muscolatura e le costole fino a raggiungere l'arto superiore.</li>
	<li>Tagliare dritto fino a raggiungere la colonna vertebrale dall'altra parte.</li>
	<li>Tagliare verso il basso fino a raggiungere il punto in cui si è iniziato.</li>
	<li>Rilasciare il diaframma dal basso (facendo attenzione a non danneggiare il muscolo TVA) e posizionare in soluzione salina tamponata di fosfato (PBS) in una piastra di dissezione rivestita in SYLGARD con perni di dissezione da 0,2 mm.</li>
	<li>Pin fuori la gabbia toracica e muscolatura associata nel piatto, lato superficiale verso l'alto, assicurandosi che il muscolo sia completamente allungato.</li>
	<li>Versare il 1x PBS e sostituire con 4% PFA.</li>
	<li>Coprire e lasciare su una piattaforma a dondolo a temperatura ambiente per 15 minuti.</li>
	<li>Lavare 3 volte in 1x PBS a temperatura ambiente per 10 minuti.</li>
</ol>* A questo punto i muscoli fissi possono essere lasciati in frigo durante la notte prima della successiva dissezione.
2. Isolamento del muscolo TVA
<ol><li>Per procedere con l'isolamento del muscolo TVA, al microscopio a dissezione, iniziare tagliando il muscolo obliquo esterno a livello delle ultime costole (vedi figura 1 per una guida annotata).</li>
	<li>Tagliare dritto accanto alla linea alba (facendo attenzione a non tagliare il TVA sottostante) fino a raggiungere l'inizio del muscolo obliquo interno.</li>
	<li>Quindi tagliare per rilasciare l'abdominis retto sovrascritti e i muscoli obliqui esterni dalla parte superiore del TVA sottostante.</li>
	<li>Rimuovere il vaso sanguigno e qualsiasi grasso sovrascriva dal muscolo TVA.</li>
	<li>Rilasciare il muscolo dall'ultima costola sovrascriva.</li>
	<li>Tagliare intorno ai margini del muscolo e rimuovere su una piastra da 24 po 'contenente PBS.</li>
</ol>3. Etichettatura immunofluorescente e microscopia del muscolo TVA
Per tutti i passaggi successivi, rimuovere il liquido utilizzando una pipetta a punta fine e lasciare la piastra su una piattaforma a dondolo. Salvo diversa indicazione, tutti i passaggi successivi vengono eseguiti a temperatura ambiente.
<ol><li>Incubare in PBS contenente 1:1.000 bungarotossina con tag fluorescente per 30 minuti per etichettare gli NMJ. Questo può essere fatto in una stanza buia o sotto un foglio.</li>
	<li>Permeabilizzare il muscolo aggiungendo 300 μl per pozzo del 2% di Triton X-100 in PBS e lasciare su una piattaforma a dondolo per 30 min.</li>
	<li>Incubare nel reagente di blocco (4% BSA, 1% Tritone in PBS) per 30 min.</li>
	<li>Incubare nel reagente bloccante contenente anticorpi primari (neurofilamento 1:100; proteina sinaptica vescicolare 2, 1:250) a 4 °C durante la notte.</li>
	<li>Lavare 3 volte in 1x PBS.</li>
	<li>Incubare in PBS contenente 1:250 anticorpi secondari per 2-4 ore.</li>
	<li>Lavare 3 volte in 1x PBS.</li>
	<li>Montare i muscoli su vetrini utilizzando mezzi di montaggio fluorescenti sufficienti e coverlip.</li>
	<li>Le diapositive sono meglio visualizzate utilizzando un filtro passa a doppia banda su un microscopio epifluorescente standard.</li>
	<li>Gli NMJ sono meglio immagini utilizzando una proiezione della serie Z su un microscopio confocale dotato di almeno un obiettivo 40X.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sanes, J. R., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+vertebrate+neuromuscular+junction.">Development of the vertebrate neuromuscular junction.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 389-442 (1999).</li><li>Dupuis, L., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuromuscular+junction+destruction+during+amyotrophic+lateral+sclerosis:+insights+from+transgenic+models.">Neuromuscular junction destruction during amyotrophic lateral sclerosis: insights from transgenic models.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 9, 341-346 (2009).</li><li>Murray, L. M., Talbot, K., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review:+neuromuscular+synaptic+vulnerability+in+motor+neurone+disease:+amyotrophic+lateral+sclerosis+and+spinal+muscular+atrophy.">Review: neuromuscular synaptic vulnerability in motor neurone disease: amyotrophic lateral sclerosis and spinal muscular atrophy.</a> Neuropathol. Appl. Neurobiol. 36, 133-156 (2010).</li><li>Murray, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+motor+neurons+and+dissociation+of+pre-+and+post-synaptic+pathology+at+the+neuromuscular+junction+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Selective vulnerability of motor neurons and dissociation of pre- and post-synaptic pathology at the neuromuscular junction in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 949-962 (2008).</li><li>Kariya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+SMN+protein+impairs+maturation+of+the+neuromuscular+junctions+in+mouse+models+of+spinal+muscular+atrophy.">Reduced SMN protein impairs maturation of the neuromuscular junctions in mouse models of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 17, 2552-2569 (2008).</li><li>Iguchi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+TDP-43+causes+age-dependent+progressive+motor+neuron+degeneration.">Loss of TDP-43 causes age-dependent progressive motor neuron degeneration.</a> Brain. 136, 1371-1382 (2013).</li><li>Martinez-Hernandez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+defects+in+type+I+spinal+muscular+atrophy+in+human+development.">Synaptic defects in type I spinal muscular atrophy in human development.</a> J. Pathol. 229, 49-61 (2013).</li><li>Fischer, L. R., Li, Y., Asress, S. A., Jones, D. P., Glass, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absence+of+SOD1+leads+to+oxidative+stress+in+peripheral+nerve+and+causes+a+progressive+distal+motor+axonopathy.">Absence of SOD1 leads to oxidative stress in peripheral nerve and causes a progressive distal motor axonopathy.</a> Exp. Neurol. 233, 163-171 (2012).</li><li>Cifuentes-Diaz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurofilament+accumulation+at+the+motor+endplate+and+lack+of+axonal+sprouting+in+a+spinal+muscular+atrophy+mouse+model.">Neurofilament accumulation at the motor endplate and lack of axonal sprouting in a spinal muscular atrophy mouse model.</a> Hum. Mol. Genet. 11, 1439-1447 (2002).</li><li>Fischer, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyotrophic+lateral+sclerosis+is+a+distal+axonopathy:+evidence+in+mice+and+man.">Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: evidence in mice and man.</a> Exp. Neurol.. 185, 232-240 (2004).</li><li>Diers, A., Kaczinski, M., Grohmann, K., Hubner, C., Stoltenburg-Didinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ultrastructure+of+peripheral+nerve,+motor+end-plate+and+skeletal+muscle+in+patients+suffering+from+spinal+muscular+atrophy+with+respiratory+distress+type+1+(SMARD1).">The ultrastructure of peripheral nerve, motor end-plate and skeletal muscle in patients suffering from spinal muscular atrophy with respiratory distress type 1 (SMARD1).</a> Acta Neuropathol. 110, 289-297 (2005).</li><li>Ang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+axonal+sprouting+and+neuromuscular+junction+loss+in+an+animal+model+of+Charcot-Marie-Tooth+disease.">Motor axonal sprouting and neuromuscular junction loss in an animal model of Charcot-Marie-Tooth disease.</a> J. Neuropathol. Exp. Neurol. 69, 281-293 (2010).</li><li>Simon, C. M., Jablonka, S., Ruiz, R., Tabares, L., Sendtner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+neurotrophic+factor-induced+sprouting+preserves+motor+function+in+a+mouse+model+of+mild+spinal+muscular+atrophy.">Ciliary neurotrophic factor-induced sprouting preserves motor function in a mouse model of mild spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 19, 973-986 (2010).</li><li>Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+mouse+cranial+muscles+to+investigate+neuromuscular+pathology+in+vivo.">Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo.</a> Neuromuscul. Disord. 20, 740-743 (2010).</li><li>Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+photo-bleaching+to+delineate+single+Schwann+cells+at+the+neuromuscular+junction.">Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction.</a> J. Vis. Exp. (4460), (2013).</li><li>Murray, L. M., Thomson, D., Conklin, A., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+translation+elongation+factor+(eEF1A2)+expression+in+vivo+differentiates+between+Wallerian+degeneration+and+dying-back+neuronal+pathology.">Loss of translation elongation factor (eEF1A2) expression in vivo differentiates between Wallerian degeneration and dying-back neuronal pathology.</a> J. Anat. 213, 633-645 (2008).</li><li>Bowerman, M., Murray, L. M., Beauvais, A., Pinheiro, B., Kothary, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+smn+threshold+in+mice+dictates+onset+of+an+intermediate+spinal+muscular+atrophy+phenotype+associated+with+a+distinct+neuromuscular+junction+pathology.">A critical smn threshold in mice dictates onset of an intermediate spinal muscular atrophy phenotype associated with a distinct neuromuscular junction pathology.</a> Neuromuscul. Disord. 22, 263-276 (2012).</li><li>Comley, L. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ApoE+isoform-specific+regulation+of+regeneration+in+the+peripheral+nervous+system.">ApoE isoform-specific regulation of regeneration in the peripheral nervous system.</a> Hum. Mol. Genet. 20, 2406-2421 (2011).</li><li>Wright, M., Kim, A., Son, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subcutaneous+administration+of+muscarinic+antagonists+and+triple-immunostaining+of+the+levator+auris+longus+muscle+in+mice.">Subcutaneous administration of muscarinic antagonists and triple-immunostaining of the levator auris longus muscle in mice.</a> J. Vis. Exp. (55), (2011).</li><li>Ling, K. K., Gibbs, R. M., Feng, Z., Ko, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severe+neuromuscular+denervation+of+clinically+relevant+muscles+in+a+mouse+model+of+spinal+muscular+atrophy.">Severe neuromuscular denervation of clinically relevant muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy.</a> Hum. Mol. Genet. 21, 185-195 (2012).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo video, abbiamo dettagliato un protocollo per la dissezione del muscolo TVA dal mouse e per l'etichettatura immunofluorescente a montaggio intero di NMJs all'interno del muscolo. Presentiamo anche dati che mostrano che questo muscolo può essere utilizzato per analizzare la patologia della giunzione neuromuscolare in un modello di topo di SMA.
Il successo di questa tecnica dipende da una serie di fattori. Alcuni dei problemi più comuni sono descritti di seguito. Primo: scarsa colorazione immunoistochimica. Ci possono essere una serie di ragioni per questo, una delle più comuni è l'uso di reagenti diversi da quelli elencati in questo protocollo. Un PFA di microscopia elettronica di alta qualità è molto importante per garantire una buona colorazione, così come la scelta degli anticorpi elencati in questo protocollo. Inoltre, negli animali più anziani(cioè >3 mesi), ottenere una colorazione di buona qualità può essere più difficile. Ciò è dovuto all'aumento dello spessore della fascia che circonda il muscolo e all'aumento dell'accumulo di grasso tra l'obliquo esterno e il tranversus abdominis. È importante rimuovere il grasso, prima di procedere all'immunofluorescenza. Potrebbe anche essere necessario rimuovere parte della fascia che copre il muscolo, che può diventare ispessito. A volte è difficile rimuovere la fascia e il grasso dal muscolo senza incorrere in qualche danno alla fibra muscolare e un'interruzione del modello di innervazione. Tuttavia, se questa tecnica viene eseguita con attenzione, è possibile acquisire una colorazione di buona qualità da topi fino ad almeno 1 anno di età. Nei topipiù giovani (cioè meno di3 mesi di età) non dovrebbe essere necessario eseguire alcuna presa in giro o separazione delle fibre muscolari. In secondo luogo, difficile trovare nmj dopo la dissezione e la colorazione. Questo spesso perché la dissezione non si è estesa sotto l'ultima costola. La maggior parte degli NMJ si trova appena sotto l'ultima costola e quindi bisogna fare attenzione a garantire che questa parte del muscolo sia inclusa nella dissezione. Terzo: aderenza del muscolo EO al muscolo TVA. Questo è spesso un reclamo quando gli individui tentano di estendere la dissezione al di sotto del livello del muscolo obliquo interno (IO). L'area del muscolo TVA in cui è presente anche l'IO è più difficile da analizzare in quanto può essere difficile distinguere quale muscolo è quale. Per questo motivo, di routine sezioniamo solo la parte più superiore del muscolo TVA. A questo livello, non vi è aderenza tra i muscoli EO e TVA, e quindi questo non dovrebbe essere un problema significativo.
Un ostacolo significativo all'uso del muscolo TVA, rispetto ai muscoli appendicolari, è l'accessibilità per manipolazioni chirurgiche o iniezione di sostanze. Questi tipi di esperimenti possono essere cruciali per indagare la fisiologia NMJ in un dato muscolo. Sebbene il TVA sia certamente meno facilmente accessibile rispetto ai muscoli più comunemente usati come tibialis anteriore o gastrocnemio,il lavoro precedente ha dimostrato che è possibile denervare il TVA con lesioni chirurgiche dei nervi intercostali18. Recentemente abbiamo anche usato questo muscolo per la somministrazione locale di sostanze sotto anestetico generale (dati inediti). Sebbene questi esperimenti possano rappresentare una sfida tecnica moderata, questo lavoro dimostra che sono fattibili e quindi estendono l'utilità di questo muscolo per l'analisi degli MN sotto manipolazione patologica e fisiologica.
Il muscolo TVA è uno dei numerosi muscoli piatti sottili situati in tutto il corpo che possono essere utilizzati per l'analisi a montaggio intero dei modelli di innervazione. Altri muscoli includono un gruppo di muscoli cranici innervati dai motoneuroni provenienti dal nucleo facciale del tronco encefalico, che comprendono levatore auris longus, auricularis superiore auris longus adduttore,le cui dissezioni sono state descritte in precedenza14,19. Inoltre, la muscolatura che circonda il muscolo TVA, tra cui EO, IO e rectus abdominis, può anche essere etichettata e utilizzata per l'analisi NMJ. Per un'analisi completa della patologia NMJ in un modello di topo, è importante considerare un certo numero di muscoli situati in tutto il corpo e non limitare l'analisi a un singolo muscolo. Questo è esemplificato nei modelli di topo di malattie dei motoneuroni dove c'è una significativa eterogeneità nei livelli di patologia NMJ tra diversi muscoli20. Tale variabilità intermuscolare è uno strumento estremamente prezioso quando si studia il meccanismo della vulnerabilità dei motoneuroni e quindi limitare l'analisi a un singolo muscolo potrebbe ridurre significativamente il potenziale della ricerca.

Le giunzioni neuromuscolari (NMJs) sono la connessione sinaptica tra un motoneurone inferiore e una fibra muscolare scheletrica. Sono tradizionalmente considerati una sinapsi tripartita, composta da un neurone (terminale presinaptico), fibra muscolare (terminale post sinaptico) e cellula terminale di Schwann1. Gli NMJ sembrano essere obiettivi precoci e significativi in patologia in una serie di malattie dei motoneuroni e modelli ditopi 2,3. I sintomi tipici includono la denervazione, dove la piastra terminale motoria diventa priva di innervazione presnaptica, gonfiore del terminale presnaptico e riduzione della complessità della morfologia NMJ4-11. Si possono anche notare risposte compensative, che includono la germinazione terminale e nodale, in cui i processi assonali si estendono dai terminali sinaptici rimanenti o dagli internodi alle piastre terminali denervatate reinnervate12,13. A causa della stretta correlazione tra l'attività sinaptica e la morfologia nmj, è possibile ottenere una grande quantità di informazioni sullo stato funzionale dei motoneuroni dall'analisi della morfologia NMJ. Poiché la perdita di NMJ rappresenta spesso uno dei primi aspetti della patologia neuromuscolare4,10, la quantificazione a livello di innervazione può fornire informazioni importanti sulla progressione della patologia e sul potenziale effetto di un intervento terapeutico. Inoltre, poiché la perdita di NMJ rappresenta un passo significativo nella progressione patologica, lo sviluppo di terapie in grado di stabilizzare le connessioni e incoraggiare la rigenerazione può produrre un beneficio significativo.
Quando si analizza la morfologia nmj, la scelta muscolare è di grande importanza. Alcune delle considerazioni principali potrebbero includere il tipo di fibra muscolare, la posizione corporea e l'analisi comparativa alle condizioni umane. Inoltre, laddove sono necessarie manipolazioni come l'iniezione di sostanze o lesioni nervose traumatiche, è importante considerare anche l'accessibilità sperimentale. In generale, è preferibile analizzare una gamma di muscoli posizionati in tutto il corpo che riflettono una gamma di sottotipi di unità motorie. Spesso, tuttavia, la scelta muscolare è influenzata dalla facilità di dissezione. Di conseguenza, l'analisi NMJ viene spesso eseguita esclusivamente su grandi muscoli appendicolari come gastrocnemius. Per ottenere una buona colorazione NMJ in tali muscoli, è spesso necessario sessare o interruzione meccanica delle fibre muscolari. Di conseguenza, il modello di innervazione può essere interrotto e un'analisi completa e di alta qualità dei modelli di innervazione, germogliazione e denervazione è spesso compromessa. Un approccio alternativo è quello di utilizzare sottili muscoli piatti che non richiedono sessatura e possono essere macchiati e montati intatti, consentendo una panoramica completa dell'intera innervazione del muscolo. Ci sono un certo numero di muscoli che possono essere utilizzati per tale analisi, tra cui un gruppo di muscoli cranici, (che comprende levatore auris longus, auricularis superiore adduttore auris longus)14, muscoli toracici (ad esempio. triangolare sterni) 15, e muscoliaddominali (ad esempio transversus abdominis (TVA)). Il principale ostacolo all'uso di tali muscoli è l'esperienza tecnica necessaria per sezionarli senza danni.
In questo video, forniamo un protocollo per sezionare ed eseguire l'etichettatura immunofluorescente del muscolo TVA dal mouse per consentire un'analisi completa del modello di innervazione e della morfologia NMJ. Il muscolo TVA è un muscolo a contrazione prevalentemente lento che comprende lo strato più profondo di muscolatura addominale ed è innervato dai nervi intercostali inferiori. Lavori precedenti hanno dimostrato che è costantemente altamente vulnerabile alla patologia in una serie di modelli di topi della malattia del motoneurone infantile atrofia muscolare spinale (SMA) e in altri modelli di topo di degenerazione del motoneurone ad esordioprecoce 4,16. Suggeriamo quindi che il TVA sia un muscolo utile per intraprendere l'analisi NMJ nelle neuropatie periferiche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="958">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Paraformaldehyde Aqueous Solution (16% )</td>
			<td style="width:259px;">Electron Micropscopy Sciences</td>
			<td style="width:216px;">15700</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Angled Sprung Scissors</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>15006-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fine Scissors - ToughCut</td>
			<td style="width:259px;">Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td style="width:259px;">Dow Corning</td>
			<td style="width:216px;">dependant on local supplier</td>
			<td>Use this to make dissection dish for pinning out muscle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Minutien Pins</td>
			<td style="width:259px;">Fine science tools</td>
			<td>26002-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">&#945;-Bungarotoxin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:216px;">B-13422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Albumin from Bovine Serum</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">A4503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">Neurofilament Primary antibody (2H3), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:316px;">SV2 Primary antibody (SV2), Supernatant</td>
			<td style="width:259px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td style="width:259px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td>115-166-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Fluorescence Mounting Medium</td>
			<td style="width:259px;">Dako</td>
			<td>S3023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Slides (Superfrost Plus; White)</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Coverslips</td>
			<td style="width:259px;">Fisher</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:259px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:216px;">T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:316px;">CD1/C57Bl6 mouse</td>
			<td style="width:259px;">Jackson Labs</td>
			<td style="width:216px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis

L'analisi della morfologia della giunzione neuromuscolare può dare una visione importante dello stato fisiologico di un dato motoneurone. L'analisi dei muscoli sottili piatti può offrire un vantaggio significativo rispetto ai muscoli più spessi tradizionalmente utilizzati, come quelli dell'artoposteriore( ad esempio . gastrocnomio). I muscoli sottili consentono una panoramica completa dell'intero modello di innervazione per un dato muscolo, che a sua volta consente l'identificazione di pool selettivamente vulnerabili di motoneuroni. Questi muscoli consentono anche l'analisi di parametri come le dimensioni dell'unità motoria, la ramificazione assonale e la germinazione terminale / nodale. Un ostacolo comune nell'uso di tali muscoli è ottenere l'esperienza tecnica per sezionarli. In questo video, dettagliamo il protocollo per sezionare il muscolo transversus abdominis (TVA) da giovani topi ed eseguire l'immunofluorescenza per visualizzare assoni e giunzioni neuromuscolari (NMJs). Dimostriamo che questa tecnica fornisce una panoramica completa del modello di innervazione del muscolo TVA e può essere utilizzata per indagare la patologia NMJ in un modello di topo della malattia del motoneurone infantile, atrofia muscolare spinale.

Il protocollo di cui sopra dirige l'isolamento e la colorazione del muscolo TVA per l'analisi NMJ. Ciò consente l'analisi a montaggio intero dei modelli di innervazione muscolare e l'analisi ad alta risoluzione della morfologia nmj(Figura 2). Questa tecnica può essere applicata con successo per rivelare la patologia NMJ nei modelli di topo della malattia dei motoneuroni, come la SMA4,17(Figura 3). Nei modelli di topo di SMA c'è una significativa variabilità intramuscolare nella patologia, tuttavia il muscolo TVA è costantemente altamente colpito. Ciò è dimostrato dalla denervazione delle piastre terminali motorie, dall'accumulo di neurofilamenti al terminale presnaptico e dalla germinazione terminale (Figura 3). I risultati qui presentati dimostrano quindi che la tecnica sopra descritta può essere un metodo potente per fornire una panoramica completa dell'innervazione e dell'analisi della patologia NMJ nei modelli di topo.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig1.jpg" width="600px"> Figura 1. Panoramica della muscolatura addominale del topo. (A) L'immagine mostra la gabbia toracica con muscolatura addominale attaccata, che è stata rimossa da un topo recentemente eutanasiato e appuntata in un lato superficiale del piatto di dissezione (A). (B) La dissezione in A è stata annotata per contrassegnare i confini approssimativi dei muscoli addominali. I muscoli addominali superficiali possono essere visti sul lato sinistro della dissezione e includono obliquo esterno (delineato in blu) e retto abdominis (delineato in rosso). Sul lato destro della dissezione, i muscoli superficiali sono stati rimossi per la visualizzazione del muscolo transversus abdominis (delineato in verde) e del muscolo obliquo interno (delineato in giallo). Lo scopo di questo protocollo è quello di dirigere la dissezione della parte superiore del muscolo TVA, qui mostrata come un solido triangolo verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig2.jpg" width="600px"> Figura 2. Panoramica a montaggio intero delle giunzioni neuromuscolari nel muscolo TVA. Immagini che mostrano nmjs di esempio dal muscolo TVA visualizzati con colorazione immunofluorescente per neurofilamento (NF; verde), proteina vescicolare sinaptica 2 (SV2; verde) e bungarotossina (BTX; rosso). Le immagini sono micrografie fluorescenti montate che mostrano l'intero muscolo (A) o immagini confocali che mostranogruppi (B) osingoli NMJ (C) NMJs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande</a>.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51162/51162fig3.jpg" width="600px"> Figura 3. Patologia della giunzione neuromuscolare nel muscolo TVA da un modello di topo di SMA. Micrografie confocali che mostrano I MN del muscolo TVA visualizzati con colorazione immunofluorescente per neurofilamento (NF; verde), proteina vescicolare sinaptica 2 (SV2; verde) e bungarotossina (BTX; rosso) da entrambi icontrolli (Smn2B/+) o modello di topo SMA(Smn2B/-). Si noti che mentre la normale morfologia nmj può essere osservata nei topi di controllo, nei muscoli TVA dei topi Smn2B /- ci sono prove di denervazione completa (punta di freccia bianca), denervazione parziale (punta di freccia viola) terminale che germoglia (punta di freccia blu) e gonfiore presnaptico (punta di freccia gialla). Le piastre finali post-sinaptiche sono anche meno complesse riflettendo un fenotipo apparentemente meno maturo. Barra di scala = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51162/51162fig3highres.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare l'immagine più grande</a>.

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Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In questo video dimostriamo un protocollo per la dissezione del muscolo transversus abdominis del topo e usiamo l'immunofluorescenza e la microscopia per visualizzare le giunzioni neuromuscolari.

Dissezione del muscolo Transversus Abdominis per l'analisi della giunzione neuromuscolare a montaggio intero

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

11.4K Views.  Ottawa Hospital Research Institute. In questo video dimostriamo un protocollo per la dissezione del muscolo transversus abdominis del topo e usiamo l'immunofluorescenza e la microscopia per visualizzare le giunzioni neuromuscolari.

Video: Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissezione di un occhio mouse per un monte intero di dell&#39;epitelio pigmentato retinico

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

Ricerca

Neuroscienze

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

Dissezione e immagini di zone attive nel Drosophila Giunzione neuromuscolare

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

Reproducible Mouse Sciatic Nerve Crush and Subsequent Assessment of Regeneration by Whole Mount Muscle Analysis

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative response mounted by PNS neurons thereby possibly illuminating the failures of CNS regeneration1. Sciatic nerve crush (axonotmesis) is one of the most common models of peripheral nerve injury in rodents2. Crushing interrupts all axons but Schwann cell basal laminae are preserved so that regeneration is optimal3,4. This allows the investigator to study precisely the ability of a growing axon to interact with both the Schwann cell and basal laminae4. Rats have generally been the preferred animal models for experimental nerve crush. They are widely available and their lesioned sciatic nerve provides a reasonable approximation of human nerve lesions5,4. Though smaller in size than rat nerve, the mouse nerve has many similar qualities. Most importantly though, mouse models are increasingly valuable because of the wide availability of transgenic lines now allows for a detailed dissection of the individual molecules critical for nerve regeneration6, 7. Prior investigators have used multiple methods to produce a nerve crush or injury including simple angled forceps, chilled forceps, hemostatic forceps, vascular clamps, and investigator-designed clamps8,9,10,11,12. Investigators have also used various methods of marking the injury site including suture, carbon particles and fluorescent beads13,14,1. We describe our method to obtain a reproducibly complete sciatic nerve crush with accurate and persistent marking of the crush-site using a fine hemostatic forceps and subsequent carbon crush-site marking. As part of our description of the sciatic nerve crush procedure we have also included a relatively simple method of muscle whole mount we use to subsequently quantify regeneration.

In this report we describe a method to crush mouse sciatic nerve. This method uses readily available hemostatic forceps and easily and reproducibly produces complete sciatic nerve crush. In addition, we describe a method to prepare muscle whole mounts suitable for analysis of nerve regeneration after sciatic nerve crush.

Riproducibile nervo sciatico Crush mouse e successiva valutazione da parte della Rigenerazione intera analisi Muscle Monte

Regeneration in the peripheral nervous system (PNS) is widely studied both for its relevance to human disease and to understand the robust regenerative ...

Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system and has served as guiding model to study synaptic structure and function. In mouse NMJs motor axon terminals form pretzel-like contact sites with muscle fibers. The motor axon and its terminal are sheathed by SCs. Over the past decades, several transgenic mice have been generated to visualize motor neurons and SCs, for example Thy1-XFP1 and Plp-GFP mice2, respectively.
Along motor axons, myelinating axonal SCs are arranged in non-overlapping internodes, separated by nodes of Ranvier, to enable saltatory action potential propagation. In contrast, terminal SCs at the synapse are specialized glial cells, which monitor and promote neurotransmission, digest debris and guide regenerating axons. NMJs are tightly covered by up to half a dozen non-myelinating terminal SCs - these, however, cannot be individually resolved by light microscopy, as they are in direct membrane contact3.
Several approaches exist to individually visualize terminal SCs. None of these are flawless, though. For instance, dye filling, where single cells are impaled with a dye-filled microelectrode, requires destroying a labelled cell before filling a second one. This is not compatible with subsequent time-lapse recordings3. Multi-spectral "Brainbow" labeling of SCs has been achieved by using combinatorial expression of fluorescent proteins4. However, this technique requires combining several transgenes and is limited by the expression pattern of the promoters used. In the future, expression of "photo-switchable" proteins in SCs might be yet another alternative5. Here we present sequential photo-bleaching, where single cells are bleached, and their image obtained by subtraction. We believe that this approach - due to its ease and versatility - represents a lasting addition to the neuroscientist's technology palette, especially as it can be used in vivo and transferred to others cell types, anatomical sites or species6.
In the following protocol, we detail the application of sequential bleaching and subsequent confocal time-lapse microscopy to terminal SCs in triangularis sterni muscle explants. This thin, superficial and easily dissected nerve-muscle preparation7,8 has proven useful for studies of NMJ development, physiology and pathology9. Finally, we explain how the triangularis sterni muscle is prepared after fixation to perform correlated high-resolution confocal imaging, immunohistochemistry or ultrastructural examinations.

Visualizing individual cells in densely packed tissues, such as terminal Schwann cells (SCs) at neuromuscular junctions (NMJs), is challenging. "Sequential photo-bleaching" allows delineating single terminal SCs, for instance in the triangularis sterni muscle explant, a convenient nerve-muscle preparation, where sequential bleaching can be combined with time-lapse imaging and post-hoc immunostainings.

Sequential Photo-sbiancante per Delineare cellule di Schwann singoli sulla giunzione neuromuscolare

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this information to the brain. As such, determining how olfactory information is transferred to the brain, modifying both perception and behavior, merits investigation. Interestingly, there is emerging evidence that cellular transduction and transcriptional factors are involved in the diversification of olfactory receptor neuron. Here we provide a robust whole mount immunological labeling method to assay in vivo olfactory receptor neuron organization. Using this method, we identified all olfactory receptor neurons with anti-ELAV antibody, a known pan-neural marker and Or49a-mCD8::GFP, an olfactory receptor neuron specifically expressed in Nba neuron using anti-GFP antibody.

Whole Mount Immunolabeling of Olfactory Receptor Neurons in the Drosophila Antenna

Herein we describe the process of whole mount immunostaining of Drosophila antennae, which enables us to better understand the molecular mechanisms involved in the diversification of olfactory receptor neurons (ORN)s.

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Odorant molecules bind to their target receptors in a precise and coordinated manner. Each receptor recognizes a specific signal and relays this ...

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

Perché Quantificazione Matters: Caratterizzazione dei fenotipi al<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvale Giunzione neuromuscolare

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Un semplice passo-dissezione Protocollo per tutto il montaggio Preparazione per adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Funzionalità di misurazione della giunzione neuromuscolare

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

Macropatch focale registrazioni delle correnti sinaptiche da giunzione neuromuscolare larvale della drosofila

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...