Questo lavoro è stato sostenuto da un L. Dan Duncan collaborativa assegno di ricerca (CMB e EJS), il National Heart, Lung, and Blood Institute (US4HL081007), un Leukemia and Lymphoma Society Clinical Research Scholar premio (CMB), e il National Cancer Institute (RO1 CA06150816; EJS).

1. Cella di isolamento mononucleare (giorno 0) <ol><li> Inserire spike di luer femmina nella porta di uscita della frazione 20% della unità di sangue cordonale, collegare la siringa e rimuovere il sangue. Trasferimento sangue scongelati a 20 ml di RPMI riscaldato in tubo da 50 ml per centrifuga. Risciacquare sangue borsa dei cavi con 5 ml di RPMI e trasferire al tubo da centrifuga stessa. </li><li> Centrifugare le cellule per 10 minuti a 400 x g. Aspirare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 20 ml di RPMI caldo. Cellule strato su 15 ml di Lymphoprep in tubo da 50 ml per centrifuga. Centrifugare 40 minuti a 400 x g. </li><li> Raccogliere l&#39;interfaccia contenente le cellule mononucleari e lavare in 20 ml di RPMI. Centrifugare per 10 minuti a 450 x g. </li><li> Aspirare il surnatante e lavare in 20 ml di RPMI. Contare le celle e girare per 5 minuti a 400 x g. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere le cellule a 5 x 10 6 cellule mononucleate / mL di Cellgenix DC media (privo di siero). Togliere 1 mL per EBV-LCL generazione e mettere in 15 mL centrifuge tubo. </li></ol> 2. Cellule dendritiche Generation (a partire dal giorno 0) <ol><li> Piastra 2 ml di cellule (sono già a 5 x 10 6 cellule / ml di DC media) per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti. Lasciare in incubatore per 1-2 ore. </li><li> Dopo 1-2 ore, lavare le cellule non aderenti mediante lavaggio 3-4 volte con PBS. Raccogliere le cellule non aderenti e congelare. Aggiungere 2 mL / pozzetto di supporti contenenti CC 1000 U / ml di IL-4 e 800 U / ml di GM-CSF. </li><li> 3-4 giorni dopo DC iniziazione, rifornire di IL-4 e GM-CSF aggiungendo 100 pl / pozzetto di supporti contenenti una concentrazione finale di 1000U/mL IL-4 e 800 U / ml di GM-CSF. </li><li> Il giorno 5-6, raccolto la DC raschiando il bene con una pipetta di trasferimento. Contare le cellule grandi e centrifugare per 5 minuti a 400 x g. Aspirare media e risospendere CC a 2x10 6 cellule / ml di DC media. Aggiungere 0,5 ml / pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. </li><li> Trasdurre la DC con il Ad5f35pp65 vettore in una cella per MOI di 10 unità infettive. Aggiungi vector a ciascun pozzetto in una piastra da 24 pozzetti. Incubare le cellule per 1,5 ore. Dopo 1,5 ore, aggiungere 1,5 mL / pozzetto di DC supporto contenente: 1000 U / ml di IL-4, 800 U / ml di GM-CSF, 10 ng / mL TNF-alfa, 1 pg / mL PGE-1, 100 ng / mL IL-6, e 10 ng / ml di IL-1beta. Queste citochine maturare i controller di dominio. </li></ol> 3. Generazione di EBV-LCL (a partire dal giorno 0) <ol><li> Centrifugare la provetta contenente le x 5 10 6 cellule mononucleate. Aggiungere 200 ml di concentrato EBV B95.8 surnatante e 1,8 ml di mezzo completo (RPMI + 10% FBS + 2 mM L-glutammina) contenente ciclosporina (1 pg / mL). </li><li> Aliquotare 100 ml di cellule in 10 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti e 200 pl in 5 pozzetti. Aggiungere 100 ml di mezzi completi ciclosporina + ai pozzetti contenenti solo 100 ml di cellule. Riempire i pozzetti rimanenti con acqua sterile. </li><li> Alimentare il settimanale LCL ed espandere da una piastra a 96 pozzetti a un 24-pozzetti dopo ~ 2 settimane. Dopo un&#39;altra settimana, trasferire in un matraccio T25 ed il trasferimento settimana successivauna beuta T75. In questa fase si consiglia di congelare aliquote di LCL. Si richiede in genere 1 mese a generare un numero sufficiente di LCL. </li></ol> 4. CTL Initiation - 7 giorni dopo l&#39;inizio delle DC <ol><li> DC Harvest e irradiano a 30 Gy. Lavare 4 x e il conteggio. Risospendere DC in mezzi cellule T contenenti siero umano (45% RPMI, 45% CLICK, il 10% di siero umano, 2 mM L-glutammina) @ 1 x 10 5 cellule dendritiche / mL. </li><li> Scongelare le cellule non aderenti a partire dal punto 2.2. Lavare le cellule, e contare. Risospendere a 2 x 10 6 cellule non aderenti / ml in mezzi cellule T contenenti siero umano. Aggiungere 10 ng / ml di IL-7 e IL-12, e 5 ng / ml di IL-15. Aggiungere 1 ml di cellule per pozzetto in una piastra da 24 pozzetti. Aggiungere 1 ml di DC per pozzetto. Riempire i pozzetti vuoti di 24 pozzetti con acqua sterile. </li><li> 7 giorni dopo l&#39;inizio delle cellule T, mangimi e / o dividere le celle con i media delle cellule T contenenti siero umano. </li><li> 9-12 giorni dopo l&#39;inizio delle cellule T, congelare le cellule T fino a quando il LCL sono pronti. </li><li> Once LCL si sono ampliati e sono diversi passaggi in fiasche T75, trasdurre l&#39;LCL mediante centrifugazione per 5 minuti a 400 x g. Aggiungere il vettore al pellet cellulare ad una MOI di 100 unità infettive per cellula. Incubare per 1,5 ore. Dopo 1,5 ore, risospendere in mezzi completi a 5 x 10 5 LCL / ml e aggiungere 2 ml per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti 12. </li><li> Dopo 2 giorni, raccogliere il LCL e irradiano a 40 Gy. Lavare 4 x e il conteggio. Risospendere il LCL in mezzi cellule T contenenti siero umano a 2,5 x 10 5 cellule / ml. Aggiungere 1 ml di LCL per pozzetto di una piastra a 24 pozzetti. Inoltre, aggiungere 5 x 10 6 LCL ad un dispositivo di coltura Grex40 e 5 ng / ml di IL-15. 13 </li><li> Raccogliere le cellule T. Centrifugare per 5 minuti a 400 xg, aspirare il surnatante, risospendere in mezzi e cellule T contenenti siero umano a 1 x 10 6 cellule T / mL. Aggiungere 5 ng / ml di IL-15 e di aggiungere 1 ml / pozzetto di cellule T (totale di 1 x 10 6 cellule T) al LCL che sono già in 24-pozzetti. Nel Grex40, portareil volume totale del supporto fino a 30 mL. </li><li> Il giorno 3-4 post-stimolazione, se le cellule confluenti sono poi divisi (nel piatto) 1:1 e aggiungere mezzo fresco contenente 50 U / ml IL-2. Se non sono confluenti poi semplicemente aspirare ½ media e sostituirlo con supporti contenenti 50 U / mL di IL-2. Nel Grex40, aspirare la metà dei mezzi di comunicazione, sostituire con mezzi freschi, e aggiungere 50 U / mL di IL-2. </li><li> Il giorno 7, ripetere come nel passo 4,6 ma utilizzare IL-2 nel giorno della stimolazione non, IL-15. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Uno schema del GMP approvato dalla FDA protocollo di fabbricazione è rappresentato in figura 1. Il processo dura circa 50 giorni. Metodi tipici di generazione di virus-specifiche cellule T espandere preesistenti cellule T di memoria, tuttavia, il sangue del cordone non ha virus esperti cellule T, e quindi abbiamo bisogno di prime ingenuo T cellule ex vivo. Per fare ciò, usiamo cellule dendritiche e le citochine IL-7, IL-12 e IL-15,necessaria per generare specificità virale. Dopo 3 stimolazioni, il rendimento deve essere superiore a 100x10 6 celle. Se le cellule non siano disponibili sufficienti, stimolazioni supplementari possono essere eseguite fino a quando il numero desiderato di CTL sono disponibili. La maggior parte di queste cellule dovrebbe essere CD3 + con una miscela di CD4 + e CD8 + T cellule. Ci dovrebbe essere inferiore a 15% delle cellule NK (CD3-/CD56 +) e meno di 1% di cellule B CD19 + (Figura 2). Il CTL estesa dovrebbe riconoscere l&#39;antigene pp65 da CMV, hexon e Penton da adenovirus, nonché numerosi antigeni EBV che sono espressi sulla EBV-LCL. Quando la prova è in un saggio ELISPOT, CTL dovrebbe secernere più IFN-? in risposta a questi antigeni di antigeni irrilevanti (Figura 3). Il CTL dovrebbe anche lisare virali peptide-pulsati tali obiettivi blasti PHA. In un saggio di rilascio Cr 51, CTL dovrebbe lisare LCL, CMVpp65-pulsato e Adenovirus esone-e /o Penton-pulsato obiettivi, ma non obiettivi pulsate con peptidi irrilevanti (Figura 4). <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig1.jpg" alt="Figura 1."/> Figura 1. Generazione di multi-virus CTL specifici dal cordone ombelicale. Schematico che mostra l&#39;intero processo di fabbricazione CTL da cordone ombelicale. Prima le cellule mononucleate del sangue del cordone sono isolati dalla frazione 20% della frazionato unità di sangue del cordone ombelicale. Con l&#39;eccezione di 5x10 6 cellule salvate per generazione LCL, tutte le cellule vengono quindi piastrate in mezzi cellule dendritiche per 1-2 ore, a questo punto le cellule non aderenti sono raccolte e congelate. La DC vengono poi alimentati DC supporti contenenti IL-4 e GM-CSF. Dopo 5 giorni di coltura, la DC sono maturato e trasdotte con un vettore adenovirale contenente l&#39;antigene immunodominante CMV pp65. All&#39;iniziazione DC questi sono combinati con le cellule non aderenti e le citochine IL-7, IL-12,e IL-15. A stimolazioni successive, lo stesso vettore adenovirale viene utilizzato per trasdurre EBV-LCL, che sono utilizzati come le cellule presentanti l&#39;antigene. IL-15 viene utilizzato al secondo stimolazione e IL-2 in seguito. <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig2.jpg" alt="Figura 2."/> Figura 2. Fenotipo delle cellule T risultante. Mostrata è la percentuale di cellule vive inclusi nel gate linfocitario. CTL sono CD3 + e CD4 + e CD8 +, ma in gran parte CD3-/CD56- e CD19-. <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig3.jpg" alt="Figura 3."/> Figura 3. Funzionalità delle cellule T. Specificità delle cellule T è stato testato da IFN-γELISPOT. Le cellule T sono state pulsate con peptidi sovrapposti copre l&#39;intera proteina di hexon, Penton, pp65, e l&#39;antigene irrilevante IE-1. CTL da solo indica un mezzo solo. Autologo LCL sono stati irradiati e ha aggiunto a 1x10 5 / bene. Viene mostrato il punto medio di formazione delle cellule cim porto di pozzetti in triplicato. <img src="/files/ftp_upload/3627/3627fig4.jpg" alt="Figura 4."/> Figura 4. Attività citolitica dei CTL. La capacità del CTL risultante per lisare bersagli esprimenti antigeni virali è stato testato in un saggio di 51 Cr. 51 Cr-etichettati blasti autologhe PHA sono state pulsate con peptidi sovrapposti copre l&#39;intera o antigene marcato con 51 Cr LCL autologhe sono stati co-coltivate con CTL. Dopo 4 ore, gamma di rilascio è stato contato in un contatore gamma.

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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+of+T+cells+targeting+multiple+antigens+of+cytomegalovirus,+Epstein-Barr+virus+and+adenovirus+to+provide+broad+antiviral+specificity+after+stem+cell+transplantation.">Expansion of T cells targeting multiple antigens of cytomegalovirus, Epstein-Barr virus and adenovirus to provide broad antiviral specificity after stem cell transplantation.</a> Cytotherapy. , (2011).</li><li>Gerdemann, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+Multivirus-specific+T+Cells+to+Prevent/treat+Viral+Infections+after+Allogeneic+Hematopoietic+Stem+Cell+Transplant.">Generation of Multivirus-specific T Cells to Prevent/treat Viral Infections after Allogeneic Hematopoietic Stem Cell Transplant.</a> J. Vis. Exp. 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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

<html> Attuali strategie volte a controllare le infezioni virali dopo CBT può essere efficace, ma sono associati a tossicità significative, sono costosi, e non conferiscono protezione a lungo termine contro l&#39;infezione in seguito. In effetti, l&#39;uso di alcuni farmaci antivirali possono limitare l&#39;espansione del virus-specifiche cellule T che altrimenti sarebbero protettivo. 14 Un&#39;altra opzione è l&#39;infusione di donatore-derivati ​​virus-cellule T specifiche. Noi e altri hanno dimostrat...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870-076 </td></tr><tr><td> DC supporti </td><td> CellGenix </td><td> 20801-0500 </td></tr><tr><td> EHAA (Medium Click di) </td><td> Irvine Scientific </td><td> 9195 </td></tr><tr><td> Siero umano </td><td> Gemini Bio Prodotti </td><td> 100-110 </td></tr><tr><td> Gas Permeabile Cultureware 18 </td><td> Wilson-Wolf </td><td> 80040S </td></tr><tr><td> IL-2 </td><td> Chirone (TCH Farmacia) </td><td></td></tr><tr><td> IL-12 </td><td> NCI / CTEP </td><td></td></tr><tr><td> IL-15 </td><td> CellGenix </td><td> 1013-050 </td></tr><tr><td> IL-7 </td><td> R &amp; S </td><td> AFL207 </td></tr><tr><td> IL-1beta </td><td> R &amp; S </td><td> AFL201 </td></tr><tr><td> IL-6 </td><td> CellaGenix </td><td> 1004-050 </td></tr><tr><td> GM-CSF </td><td> TCH Farmacia </td><td></td></tr><tr><td> IL-4 </td><td> R &amp; S </td><td> <a href="http://www.rndsystems.com/pdf/AFL204.pdf" target="_blank">AFL204</a> </td></tr><tr><td> TNF-alfa </td><td> R &amp; S </td><td> AFL210 </td></tr><tr><td> Ad5f35pp65 </td><td> BCM CAGT Vector Production Facility </td><td></td></tr><tr><td> Trasferimento al plasma con adattatore femmina luer </td><td> Carta Medical </td><td> 89-550-66J </td></tr><tr><td> Lymphoprep </td><td> Nycomed </td><td> 1114550 </td></tr></tbody></table>

expanding cytotoxic t lymphocytes from umbilical cord blood that target cytomegalovirus, epstein-barr virus, and adenovirus

Infezione da virus dopo il trapianto di cellule staminali sono tra le cause più comuni di morte, specialmente dopo sangue cordonale (CB) trapianto (CBT) in cui l&#39;organismo di certificazione non contiene numeri notevoli di virus-esperti cellule T in grado di proteggere il destinatario dalle infezioni 1. - 4 Noi e altri hanno dimostrato che virus specifica CTL generati da donatori sieropositivi e infuso al destinatario sono sicuri e protettivi. 5-8 Tuttavia, fino a poco tempo, virus-specifiche cellule T non può essere generato dal sangue del cordone ombelicale, probabilmente a causa del assenza di celle di memoria virus-T specifiche. Nel tentativo di imitare il meglio in condizioni di innesco in vivo di cellule T naive, abbiamo stabilito un metodo utilizzato CB derivate da cellule dendritiche (DC) trasdotte con un vettore adenovirale (Ad5f35pp65) contenente l&#39;antigene immunodominante CMV pp65, quindi guidare specificità delle cellule T verso CMV e adenovirus. 9 Alla iniziazione, usiamo queste macchineDCs strutturati come anche cellule T CB-derivato in presenza delle citochine IL-7, IL-12 e IL-15. 10 Alla stimolazione secondo abbiamo usato EBV-trasformate cellule B, o EBV-LCL, che esprimono sia latente e litiche antigeni EBV. Ad5f35pp65-trasdotte EBV-LCL sono usati per stimolare le cellule T in presenza di IL-15 alla seconda stimolazione. Stimoli successivi utilizzano Ad5f35pp65-trasdotte EBV-LCL e IL-2. Da 50x10 6 cellule mononucleate CB siamo in grado di generare l&#39;alto di 150 x 10 6 cellule T virus-specifici che lisare antigene-pulsate obiettivi e citochine rilascio in risposta alla stimolazione antigenica. 11 Queste cellule sono state prodotte in un modo conforme GMP utilizzando solo la frazione al 20% di una unità di sangue del cordone frazionato e tradotti per l&#39;uso clinico.

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Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Qui si descrive la prima pratica di fabbricazione (GMP) conforme metodo per produrre virus-specifici linfociti T citotossici (CTL) da sangue del cordone ombelicale, fonte di cellule T prevalentemente ingenuo.

Espansione linfociti T citotossici da sangue del cordone ombelicale che Target Citomegalovirus, virus di Epstein-Barr virus, e Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

expanding-cytotoxic-t-lymphocytes-from-umbilical-cord-blood-that

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Immunology and Infection

12.6K Views.  Baylor College of Medicine. Qui si descrive la prima pratica di fabbricazione (GMP) conforme metodo per produrre virus-specifici linfociti T citotossici (CTL) da sangue del cordone ombelicale, fonte di cellule T prevalentemente ingenuo.