Gli autori desiderano ringraziare il Dr. Carl giugno (Università della Pennsylvania) per aiuto produzione, fornitura clone AAPC # 4 e il dottor Perry Hackett (University of Minnesota) per ottenere assistenza con il sistema SB. Concessione del sostegno: Cancer Center nucleo Grant (CA16672), RO1 (CA124782, CA120956, CA141303), R33 (CA116127), P01 (CA148600), SPORE (CA136411); Albert J Ward Fondazione; Burroughs Wellcome Fondo; Gillson Longenbaugh Foundation; la prevenzione del cancro e Research Institute del Texas; CLL Global Research Foundation, Dipartimento della Difesa, Tenuta di Noelan L. Bibler; Harry T. Mangurian, Jr., Fondo per l&#39;immunoterapia leucemia, Institute of Cancer Therapy personalizzati, Leukemia and Lymphoma Society, Research Foundation linfoma; MDACC sorella di istituzione della rete Fondo; Miller Foundation, Mr. Herb Simons, il signor e la signora Joe H. Scales, il signor Thomas Scott, Fondazione Nazionale per la Ricerca sul Cancro; Pediatric Cancer Research Foundation; assistenza ed Produzionee per le terapie cellulari (PACT), William Lawrence e Fondazione Blanche Hughes bambini.

<html> Giorno 0 o Prima 1. Isolamento di cellule mononucleate (MNC) da PB e UCB <ol><li> Diluire PB con un volume uguale, e UCB con quattro volumi di PBS-EDTA. </li><li> Lentamente sangue strato diluito (25 ml) sul Ficoll (12 ml) in una provetta da centrifuga da 50 ml (s) e centrifugare a 400 xg per 30 - 40 min (frenatura). </li><li> Raccogliere e trasferire la frazione di cellule mononucleate (interfaccia) con una pipetta di trasferimento in una nuova centrifuga tubo da 50 ml. </li><li> Portare il volume a 50 ml con PBS-EDTA e centrifugare a 450 xg per 10 min. </li><li> Aspirare il surnatante, risospendere delicatamente il pellet (s) in 50 ml di mezzo di coltura completo (CCM), e centrifugare a 400 xg per 10 min. </li><li> Risospendere delicatamente e la piscina il pellet di cellule in CCM ed eseguire una conta delle cellule con il metodo di esclusione blu Trypan (Cellometer, programma PBMC). </li><li> MNC può ora essere utilizzato per elettroporazione (Nucleofection) o crioconservati per un uso futuro. </li></ol>titolo &quot;&gt; 2. Preparazione di cellule T per elettroporazione al giorno 0 <ol><li> Se si utilizza crioconservato MNC, scongelare rapidamente le cellule sufficienti per una elettroporazione fondo scala (2 x 10 8 aggiunta di ~ 20% per tenere conto di perdita di cellule durante la centrifugazione e 2 ore di incubazione) a 37 ° C bagnomaria. Se si utilizzano appena isolati MNC passare al punto 2.3. </li><li> Risospendere delicatamente e trasferire le cellule a un tubo da centrifuga di dimensioni adeguate (s) contenuta preriscaldata Complete Fenolo-Free coltura RPMI supporti (PF-RPMI) e centrifugare a 200 xg per 10 min (senza freno), sovranatante aspirato. </li><li> Risospendere il MNC in RPMI-PF, eseguire una conta cellulare (Cellometer) e trasferire le cellule a un recipiente di dimensioni adeguate coltura cellulare (s) ad una concentrazione di 10 6 cellule / ml. </li><li> Incubare in un umidificata 37 ° C / 5% CO 2 incubatore per 2 h ± 30 min. </li><li> Trasferire il MNC per provetta da centrifuga sterile (s), rotazione a 200 xg per 5 min (senza freni), aspirare il supernatante e delicatamente re-sospendere e combinare il pellet cellulare (s) in RPMI-PF. </li><li> Eseguire una conta cellulare (Cellometer) e calcolare il volume della sospensione cellulare richiesta (2 x 10 8 MNC). </li><li> Trasferire il volume calcolato per un tubo da 50 ml sterile da centrifuga e centrifugare a 200 xg per 10 min (senza freno). </li><li> Aspirare il supernatante in modo che nessun media residua e delicatamente risospendere toccando lato del tubo. </li></ol> 3. Elettroporazione (Nucleofection) di MNC (Process Scala con 10 cuvette) il giorno 0 <ol><li> Pre-incubare a 12 sterile piastra con 10 pozzetti contenenti 4 ml di RPMI caldo PF-in un umidificata 37 ° C / 5% CO 2 incubatore. </li><li> Preparare e pre-riscaldare la soluzione Lonza Nucleofector umano T Kit cella (ricostituito secondo le istruzioni del produttore, <a href="http://www.lonza.com" target="_blank">www.lonza.com</a> ) a temperatura ambiente in un cabinet sicurezza biologica (BSC). </li><li> Preparare la soluzione Nucleofector / master mix DNA adding 100 pl di soluzione integrata Nucleofector, 15 pg di trasposoni (DNA plasmidico superavvolto designato come CD19RCD28/pSBSO) e 5 pg di transposasi (DNA plasmidico superavvolto designato come pCMV-SB11) per reazione / cuvetta. </li><li> Disperdere il pellet di cellule (dal punto 2.8) battendo leggermente il lato della provetta da centrifuga e risospendere in Nucleofection soluzione / master mix di DNA (concentrazione finale cella: 2 x 10 7 cells/100 pl). </li><li> Cautela trasferire 100 microlitri della sospensione cellulare (dal punto 3.4) a ciascuno dei dieci (10) Cuvette Nucleofection Lonza, facendo attenzione a evitare bolle. </li><li> Toccare la cuvetta una volta, e electroporate utilizzando il programma U-014 (per non stimolate le cellule T). </li><li> Trasferire le cuvette e dei 12 pozzetti (Fase 3.1) al BSC. </li><li> Raccogliere le cellule elettroporate da ciascuna cuvetta con una multa Amaxa pipetta punta, aggiungendo ~ 500 microlitri della pre-riscaldato terreno di coltura dal pozzetto corrispondente (12-pozzetti preparata in Step 3.1) e restituire la piastra ad un umidificata 37 ° C / 5% CO 2 incubatore per 2 h ± 30 min. </li><li> Seguendo il 2-h di incubazione, raccolto e trasferire le cellule da tutti i pozzetti in una provetta da centrifuga sterile. </li><li> Lavare le cellule per centrifugazione a 140 xg per 8 min, temperatura ambiente, senza freno e aspirare ed eliminare il surnatante in modo che nessun residuo medio copre il pellet. </li><li> Disperdere il pellet cellulare delicatamente la parte della provetta da centrifuga e delicatamente risospendere in CCM per ottenere una sospensione di cellule singole. </li><li> Effettuare conteggio delle cellule e regolare la concentrazione cellulare a 10 6 cellule / ml in CCM. </li><li> Trasferimento sospensione cellulare al pallone di coltura cellulare (s) e posto in incubatrice durante la notte. </li><li> Fasi di processo 2,1-3,8 sono state ripetute per controllo: EGFP cellule trasfettate (5 x 10 6 cellule / cuvetta con 5 pg Amaxa controllo EGFP plasmide superavvolto, pmaxGFP). </li></ol> 1 ° giorno del 1 ° e successiviStimolazione Cicli 4. Analisi di espressione CAR mediante citometria di flusso al giorno 1 <ol><li> Raccogliere le cellule elettroporate ed eseguire una conta di cellule utilizzando Trypan metodo di esclusione blu (emocitometro). </li><li> Colorazione (da 1 a 2 x 10 6) con anticorpi specifici per CD3, CD4, CD8, e umana IgG Fcy (come misura di espressione CAR). </li><li> Acquisire celle FACS Calibur e analizzare i dati utilizzando FCS software Express per calcolare espressione di CAR. <ol><li> Calcola le cellule + AUTO in coltura con la formula: (Numero di cellule vitali totali) x (AUTO% + cellule) = N. di CAR + cellule </li></ol></li></ol> 5. Preparazione di AAPC (clone # 4) al giorno 1. AAPC (clone # 4) sono stati derivati ​​da cellule K562 (linea parentale Ottenuto da American Type Culture Collection) di Co-express Desiderato cellule T Co-stimolatorio Molecule <ol><li> Scongelare una aliquota di congelati 100 AAPC Gy irradiato a 37 °, C acqua del bagno. </li><li> Le cellule vengono lavate due volte mediante centrifugazione a 400 xg, 10 min in CCM e contati utilizzando Cellometer (esclusione Trypan blu). </li><li> Calcolare il numero di AAPC vitali necessari per la stimolazione: (Numero di auto + cellule) x 2 = Numero di AAPC irradiato richiesta </li></ol> 6. AAPC-mediata stimolazione del CAR + cellule T al Day 1 Inizio del 1 ° e successivi cicli di stimolazione <ol><li> Mescolare le cellule esprimono elettroporate (CAR) e γ-irradiati AAPC (clone # 4) in un contenitore sterile con un rapporto di 1:2 (CAR + cella: vitale AAPC) in CCM. <ol><li> Si noti il rapporto AAPC è regolato per l&#39;espressione di CAR base citofluorimetria il giorno dopo l&#39;elettroporazione. </li></ol></li><li> Aggiungi IL-21 (30 ng / ml) alla sospensione cellulare. </li><li> Aliquotare in T-75 cm 2 pallone (s) e / o borse Vue Vita coltura ad una concentrazione di 10 6 cellule / ml e tornare alla incubato. </li></ol> Giorni 3, 5 7. Cultura Continua CAR + cellule T <ol><li> Eseguire un mezzo-media cambiamento, ricostituire IL-21, e mantenere le cellule T ad una concentrazione di 10 6 cellule / ml. </li></ol> 7 ° giorno 8. Fine del primo AAPC-mediata ciclo di stimolazione <ol><li> Cellule Harvest, contare e colorare per CD3, CD4, CD8, e Fcy (CAR) e passare al punto 10.1. </li></ol> 9. L&#39;esaurimento delle cellule CD56 + (di solito tra 7 e 14 giorni dopo l&#39;elettroporazione) <ol><li> Eseguire un CD56 esaurimento utilizzando perline paramagnetiche se CD56 + CD3 linfociti neg ≥ 10%. </li></ol> Cicli di stimolazione # 2, # 3, # 4 e corrispondenti a Giorni 8 → 14, giorno 15 → 21, e giorni 22 → 28 10. L&#39;aggiunta ricorsiva di AAPC propagazione delle cellule T con i numeri clinicamente sufficienti <ol><li> Ripetere la stimulatioprocesso n (4 volte), come descritto nelle fasi 4,3-8,1. </li><li> Aggiungi IL-2 (50U/ml) alle culture che iniziano nei giorni 7, 14 e 21, e quindi ad ogni cambio dei media (tre volte alla settimana, su un Lunedi-Mercoledì-Venerdì orario). </li><li> Crioconservare (archivio), le cellule T in eccesso, se necessario. <ol><li> Le cellule T congelate utilizzando congelatore Pilotato dalla frequenza. </li></ol></li></ol> Giorno 28 11. Fine Ultimo AAPC-mediata del ciclo di stimolazione: cellule T Harvest <ol><li> Crioconservare le cellule T per il test di rilascio e infusione. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Trasposone e sistemi trasposasi, come da piggyBac 12,19 e 18,20-22 SB, sono non-virali approcci alla terapia genica che sono un&#39;alternativa al virale mediata trasduzione di grado clinico CAR + cellule T. La SB è stato scelto come il sistema di trasferimento genico basato sul suo potenziale per la terapia genica umana 1,6,23. Abbiamo sviluppato le tecnologie duali di trasposizione SB (introdurre un CAR) e aggiunta ricorsiva di γ-irradiati AAPC (per recuperare geneticamente modificati cellule T che esprimono stabilmente un CAR) per servire come tecnologie di piattaforma per la fabbricazione di TAA-specifiche cellule T in conformità con cGMP per la fase I / II (Figura 4). Dopo 28 giorni (quattro-sette giorni cicli di stimolazione) di co-coltura su γ-irradiati AAPC, ci sono tipicamente in grado di generare almeno ~ 10 10 cellule geneticamente modificate T adatto per applicazioni umane. Se necessario, ulteriori cicli di stimolazione può essere intrapresa to generare un maggior numero di cellule T geneticamente modificate. Inoltre, se meno CAR + cellule T sono necessari, l&#39;approccio alla elettroporazione e propagazione può essere ridotto impiegando meno cuvette e riporto solo un sottoinsieme delle cellule T espanse numericamente per successivi cicli di proliferazione AAPC all&#39;inizio di ciascun Stimolazione ciclo. La maggior parte dei elettroporate e propagato cellule T raccolte per infusione esprimono stabilmente il CAR. La conseguenza di CD4 + e CD8 + cellule T che esprimono il nostro 2 AUTO di seconda generazione includono cellule con una memoria / ingenuo fenotipo e presentano tre caratteristiche di ri-diretto specificità. In primo luogo, le cellule T geneticamente modificate appositamente lisare CD19 + obiettivi, in secondo luogo, produrre IFN-γ in risposta a CD19 + cellule stimolatrici e in terzo luogo, proliferano in risposta a CD19 + cellule di alimentazione, il tutto in un CAR-dipendente 13,18. Il nostro approccio alla integrmangiato un transgene CAR per elettro-trasferimento non virali plasmidi di DNA dal sistema SB può essere intrapresa in cellule T quiescenti primarie derivate da PB e UCB. Noi e altri hanno modificato geneticamente cellule K562 per servire come AAPC per diffondere in modo efficiente i numeri clinicamente sufficiente di cellule T per infusione 24,25. Il AAPC e cultura ambiente tissutale (ad esempio l&#39;aggiunta di IL-21) sono stati sono stati modificati per generare paziente e donatore-CD19-derivato cellule T specifiche per infusione dopo cellule staminali ematopoietiche trapianto (Tabella 1) 13,18. Possiamo produrre CAR + cellule T dei PB semplicemente prelevati da una vena che evita il costo, il disagio, e l&#39;inconveniente di ottenere MNC da PB mediante aferesi. La possibilità di ricavare un gran numero di CAR + cellule T di un numero limitato di MNC è particolarmente interessante per l&#39;infusione delle cellule T dopo trapianto allogenico UCB. Le piccole dimensioni e l&#39;anonimato del donatore neonatale osta re-Accesso a questa persona in un punto secondo momento e solo un numero limitato di MNC raccolte sono disponibili come materiale di partenza per la produzione delle cellule T per evitare interferenze con ematopoiesi. Ulteriori progressi del processo di fabbricazione sono in corso di includere un dispositivo ad alta velocità elettroporazione accoppiato con un bioreattore WAVE completamente chiusa per ridurre al minimo la movimentazione. In totale, la SB e AAPC si appellano piattaforme per generare CD19-specifica CAR + cellule T che possono essere adattati per generare un gran numero di cellule T geneticamente modificate in grado di riconoscere alternative superficie cellulare TAA in conformità alle cGMP.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagenti </td><td> Venditore </td><td> Numero di catalogo </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Reagenti </td></tr><tr><td> DNA che esprimono GFP plasmide (pmaxGFP) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 (kit) </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Sigma </td><td> D8537 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS PBS-EDTA </td><td> Miltenyi Biotec </td><td> 70026 </td><td></td></tr><tr><td> HyQ RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30096.01 </td><td></td></tr><tr><td> Fenolo gratuita RPMI-1640 </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH30605.01 </td><td></td></tr><tr><td> Hyclone siero fetale bovino </td><td> Thermo Scientific </td><td> SH3007003HI </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax(100x) </td><td> Gibco </td><td> 3505-061 </td><td></td></tr><tr><td> Ficoll-Paque </td><td> GE Healthcare Biosciences </td><td> 17-1440-02 </td><td></td></tr><tr><td> Umana ricombinante IL-21 </td><td> Peprotech </td><td> AF-200-21 </td><td></td></tr><tr><td> Umana ricombinante IL-2 (Proleukin) </td><td> Novartis </td><td> NDC 65483-116-07 </td><td></td></tr><tr><td> Umano delle cellule T Kit (Soluzione Nucleofector) </td><td> Lonza </td><td> VPA-1002 </td><td></td></tr><tr><td> CliniMACS CD56 Reagente </td><td> Miltenyi </td><td> 70206 </td><td></td></tr><tr><td> FITC-coniugato con il mouse mAb specifiche per l&#39;uomo CD3 </td><td> BD Biosciences </td><td> 349201 </td><td></td></tr><tr><td> APC-topo coniugato a mAb specifici per CD4 umano </td><td> BD Biosciences </td><td> 340443 </td><td></td></tr><tr><td> PerCPCy5.5-coniugatoal mouse mAb CD8 specifiche per l&#39;uomo </td><td> BD Biosciences </td><td> 341051 </td><td></td></tr><tr><td> PE-coniugato a F (ab &#39;) 2 di capra frammento di anticorpo specifico per Fcy umana </td><td> Invitrogen </td><td> H10104 </td><td></td></tr><tr><td> Di sodio azide </td><td> Sigma </td><td> S2002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Monouso </td></tr><tr><td> 12-pozzetti </td><td> Corning </td><td> 3513 </td><td></td></tr><tr><td> T-75 cm 2 matraccio </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Cultura borse </td><td> Vue Vita </td><td> 290C, 750C </td><td></td></tr><tr><td> 50 ml centrifuga tubo </td><td> BD Biosciences </td><td> 352098 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><strong&gt; Attrezzatura </td></tr><tr><td> Amaxa Nuceleofector II </td><td> Lonza </td><td> AAB-1001 </td><td></td></tr><tr><td> Cellometer </td><td> Bioscience Nexcelom </td><td> Vision Cellometer </td><td></td></tr><tr><td> Sorvall Legenda RT Centrifuga </td><td> Sorvall </td><td> 75004377 </td><td></td></tr><tr><td> BD FACS Calibur </td><td> BD Biosciences </td><td> 342975 </td><td></td></tr><tr><td> Tasso congelatore controllata </td><td> Pialla </td><td> Kryo 750 </td><td></td></tr><tr><td> Irradiator </td><td> CIS bio internazionale </td><td> IBL-437 C # 09433 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> L&#39;espressione di molecole (endogena e Introdotto) </td></tr><tr><td> Linea cellulare </td> &lt;td&gt; Nome comune </td><td> Tipo di cella </td><td> Molecole espresse </td></tr><tr><td> CJKT64.86.41BBL.GFP-IL15.CD19 </td><td> Clone 4 </td><td> K562 </td><td> CD86, CD64, CD137L, CD19, GFP co-espresso con membrana legato IL-15 </td></tr></tbody></table> Terreni di coltura completi (CCM) (conservati a 4 ° C per un massimo di 30 giorni) HyQ RPMI-1640/Phenol-free RPMI-1640 10% FBS 1% glutamax Flusso Buffer Citometria (conservati a 4 ° C per un massimo di 30 giorni) PBS 2% FBS 0,1% sodio azide </td></tr></tbody></table>

clinical application of sleeping beauty and artificial antigen presenting cells to genetically modify t cells from peripheral and umbilical cord blood

La potenza della clinica-grade cellule T può essere migliorata combinando la terapia genica con immunoterapia per ingegnerizzare un prodotto biologico con il potenziale per superiore (i) riconoscimento di antigeni tumore-associati (TAA), (ii) dopo infusione persistenza, (iii) possibilità di migrazione ai siti tumorali, e (iv) capacità di riciclare le funzioni effettrici nel microambiente tumorale. Maggior approcci alla manipolazione genetica di cellule T ingegnerizzate all&#39;applicazione umana hanno usato retrovirus e lentivirus per l&#39;espressione stabile di CAR 1-3. Questo approccio, anche se compatibile con le attuali buone prassi di fabbricazione (GMP), può essere costoso in quanto si basa sulla produzione e il rilascio di clinica-grade virus ricombinante da un numero limitato di impianti di produzione. L&#39;elettro-trasferimento di plasmidi virali è un&#39;alternativa interessante per trasduzione poiché specie di DNA possono essere prodotti a grado clinico a circa 1/10 di costo di recombinant GMP-grade virus. Per migliorare l&#39;efficienza di integrazione abbiamo adattato Sleeping Beauty (SB) trasposone e trasposasi per l&#39;uomo 4-8 applicazioni. Il nostro sistema SB utilizza due plasmidi che consistono di un trasposone codificante per un gene di interesse (ad esempio, 2 nd generazione CD19-specifico transgene CAR, designato CD19RCD28) e una trasposasi (es. SB11) che inserisce il transgene nel dinucleotide TA ripete 9-11 . Per generare numeri clinicamente sufficiente di cellule T geneticamente modificate usiamo K562 cellule derivate artificiali presentanti antigene (AAPC) (clone # 4) modificate per esprimere una TAA (es. CD19) nonché le cellule T molecole costimolatorie CD86, CD137L, un legato alla membrana versione di interleuchina (IL) -15 (peptide fuso modified IgG4 regione Fc) e CD64 (recettore Fc γ-1) per il caricamento di anticorpi monoclonali (mAb) 12. In questo rapporto, dimostriamo le procedure che possono essere intraprese in compliance con cGMP per generare CD19-specifica CAR + cellule T adatto per l&#39;applicazione sull&#39;uomo. Questo è stato ottenuto il sincrono elettro-trasferimento di due plasmidi, un trasposone SB (CD19RCD28) e una trasposasi SB (SB11) seguite da recupero di integranti stabili dai ogni-7-giorni aggiunte (ciclo di stimolazione) di γ-irradiati AAPC (clone # 4) in presenza di solubile IL-2 ricombinante umana e IL-21 13. Tipicamente 4 cicli (28 giorni di coltura continua) sono impegnati a generare numeri clinicamente interessanti di cellule T che esprimono stabilmente il CAR. Questa metodologia di produzione clinico-grado CD19-specifiche cellule T possono essere applicati a cellule T derivate da sangue periferico (PB) o sangue del cordone ombelicale (UCB). Inoltre, questo approccio può essere sfruttata per generare cellule T per diversi tipi di tumore con l&#39;associazione la specificità del CAR introdotto con l&#39;espressione del TAA, riconosciuto dal CAR, sulla AAPC.

Si segnala che elettro-trasferimento di plasmidi di DNA e propagazione di cellule T su γ-irradiati AAPC può essere utilizzato per generare numeri clinicamente interessanti di cellule T derivate da PB e UCB per applicazioni umane. Queste cellule geneticamente modificate T esprimere un CAR introdotto che riconosce il TAA CD19, indipendente complesso maggiore di istocompatibilità. L&#39;SB-derivati ​​plasmidi DNA per esprimere il (i) trasposone, un CAR generazione 2 ° (CD19RCD28) che i segnali attraverso CD28 e CD3-ε 14, e (ii) trasposasi, SB11 15, sono stati descritti in precedenza 13, 16,17 . I plasmidi utilizzati in questo studio sono stati prodotti commercialmente da Fondo Biomanufacturing Waisman Clinica (Madison, WI). Il AAPC (clone # 4), derivato da cellule K562 (linea parentale ottenuto da American Type Culture Collection), co-esprimono desiderato cellule T molecole co-stimolatorie (ogni molecola introdotta 3 90% sulla superficie cellulare di AAPC),come precedentemente descritto 12. Qui mostriamo che CD19-specifiche cellule T possono essere generati da cellule mononucleate (MNC) derivati ​​da PB o UCB utilizzando trasposizione SB per introdurre il CAR seguita da aggiunta di AAPC numericamente per espandere le cellule T in un modo dipendente CAR (figure 1 , 4) 13,18. Dieci cuvette (2x10 7 MNC / cuvetta) sono elettroporata per ciascun destinatario usando 15 pg di DNA plasmidico (CD19RCD28/pSBSO) codificante per trasposoni (CAR) e 5 mg di DNA plasmidico (pCMV-SB11) codificante per transposasi (SB11). Il numero di cuvette può essere ridotto se MNC stanno limitando o ridimensionato per il lavoro di laboratorio. Il giorno di elettroporazione è definito come &quot;0 Day&quot; del ciclo di stimolazione # 1. Come controlli per citometria di flusso e condizioni di coltura, cellule T autologhe sono finto elettroporata (senza DNA plasmidico) e numericamente esteso su γ-irradiati AAPC (clone # 4) che erano stati pre-caricato con OKT3 per reticolare CD3 per sostenere cellule T proliferazione. We routinely valutare l&#39;efficienza di electrotransfer e la vitalità delle cellule T il giorno dopo l&#39;elettroporazione (Figura 2B). L&#39;espressione di EGFP dal DNA plasmide di controllo (designato pmaxGFP) e CAR, a questo punto tempo iniziale riflette l&#39;espressione della proteina dal plasmide integrato e episomale. In genere, il giorno dopo l&#39;elettroporazione si misura l&#39;espressione EGFP a ~ espressione 60% ​​e CAR al ~ 40% (Figura 2A) con la vitalità delle cellule T tra il 40-50%. Aggiunte ricorsive di γ-irradiati AAPC in presenza di solubile IL-2 ricombinante umana e IL-21 recuperare le cellule T che esprimono stabilmente CAR (CD19RCD28). CD3 neg CD56 + cellule NK sono esaurite dalla coltura mediante CD56-specifici perline paramagnetiche se la percentuale di queste cellule NK è ≥ 10% e soprattutto se la percentuale di CAR espresso sulle cellule T è bassa. Questo impedisce l&#39;esaurimento rapida crescita eccessiva di cellule NK che interferisce con la capacità di sostenere il AAPC proliferation di CAR + cellule T. In occasione, deplezione delle cellule NK da auto + cellule T è effettuato nel corso degli ultimi due cicli di stimolazione, ma questo introduce una perdita di cellule desiderate a causa di co-espressione di CD56 su alcuni CAR + cellule T. Le cellule T sono state coltivate in un sistema funzionalmente chiuso con Vue borse cultura della vita passata Giorno 14. Un sottoinsieme delle cellule geneticamente modificate e propagato T sono in genere crioconservati al giorno 14 o il giorno 21 (fine dei cicli di stimolazione # 2 o # 3) di co-coltura su AAPC per servire come fonte di materiale d&#39;archivio per future analisi e di essere scongelati in caso di problemi imprevisti in seguito si verificano durante il processo di fabbricazione. Le cellule T sono in genere raccolti il o intorno al giorno 28 di cultura (Figura 3) che normalmente esprimono AUTO&gt; 90% e sono&gt; 80% vitali (Figura 2C, D). Abbiamo precedentemente dimostrato che, dopo quattro settimane di co-coltura in AAPC media piega-espansione delle cellule T CD3 + è 19.800 ± 11.313 con CA<html> R espressione + essendo il 90% ± 7.5 13. Queste cellule T vengono crioconservati e sottoposti in-process e il rilascio di prodotti che informa sulla sicurezza e l&#39;efficacia terapeutica del prodotto finito. Test di rilascio è effettuato in conformità alle modifiche Clinical Laboratory Improvement (CLIA) per generare un certificato di analisi prima dell&#39;infusione in riceventi sulle sperimentazioni cliniche. <img alt="Figura 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig1.jpg" /> Figura 1. Passaggi che delineano il processo di electroporate e propagare CAR + cellule T da PB e UCB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . upload/50070/50070fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50070/50070fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2. Caratterizzazione delle cellule T geneticamente modificate da PB. (A) Espressione di EGFP al giorno 0 del ciclo di stimolazione primi a valutare l&#39;efficienza di trasferimento genico. L&#39;espressione di CD19-specifica CAR (CD19RCD28) valutata mediante citometria a flusso su CD3 +, CD8 + e cellule T CD4 + a (B) circa 24 ore dopo l&#39;elettroporazione e (C) 28 giorni dopo la co-coltura su AAPC. Espressione simile di CAR è stato osservato con UCB cellule derivate T. (D) Cinetica di espressione CAR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig3.jpg" /> Figura 3. Propagazione della PB-derivato CAR+ T cellule. Tasso di espansione numerica di CD3 + e + CAR cellule T derivate da PB da ripetute co-coltura su γ-irradiati AAPC in presenza di ricombinante umano solubile IL-2 e IL-21. Le frecce verso l&#39;alto indicano le aggiunte di γ-irradiati AAPC che segnano l&#39;inizio di ogni ciclo di stimolazione. UCB di derivazione CAR + cellule T mostrano tassi simili di espansione numerica. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50070/50070fig4.jpg" /> Figura 4. Schema del processo di fabbricazione con SB e sistemi AAPC di modificare geneticamente e propagare CAR + cellule T derivate da PB e UCB. CD19-specifica CAR + cellule T sono state generate da elettro-trasferimento di SB-derivati ​​plasmidi DNA superavvolto e successive co-coltura il K562-derived AAPC (clone # 4) in presenza of IL-2 ricombinante umana solubile e IL-21. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50070/50070fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <table border="1"><tbody><tr><td width="5"> Cella sorgente T </td><td width="9"> Trasposone * </td><td width="9"> Trasposasi </td><td width="26"> Cellule T infusione </td><td width="1"> IRB # </td><td width="1"> NIH-OBA # </td><td width="1"> IND # </td></tr><tr><td> Autologo (paziente-derivato) ** </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Dopo il trapianto autologo di cellule staminali ematopoietiche trapianto </td><td> 2007-0635 </td><td> 0804-922 </td><td> 14193 </td></tr><tr><td> Allogenico (donatore-derivati) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Dopo il trapianto allogenico di cellule staminali ematopoietiche trapianto </td><td> 2009-0525 </td><td> 0910-1003 </td><td&gt; 14577 </td></tr><tr><td> Allogenico (donatore-derivati) </td><td> CD19RCD28 </td><td> SB11 </td><td> Dopo il trapianto allogenico di sangue del cordone ombelicale </td><td> 2010-0835 </td><td> 1001-1022 </td><td> 14739 </td></tr></tbody></table> * Tabella 1. Gli studi clinici sotto l&#39;egida della FDA a MDACC di infondere CD19-cellule T specifiche CAR + propagate su AAPC. Le cellule T sono resi specifici per CD19 attraverso l&#39;espressione forzata di SB trasposone che codifica per una CAR 2 ° generazione, CD19RCD28 designato, che i segnali attraverso il CD28 e CD3-ε. ** Prova descritto in riferimento 5.

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Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

Cellule T CD19-che esprimono un recettore chimerico specifico antigene (CAR) sono infusi come trattamento sperimentale di tumori maligni delle cellule B nelle nostre prove gene first-in-umani terapia. Descriviamo modificazione genetica delle cellule T con il<em&gt; Bella Addormentata</em&gt; (SB) sistema per introdurre CD19-specifica CAR e la propagazione selettiva su cellule antigene CD19 Designer + artificiali che presentano.

Applicazione clinica della<em&gt; Bella Addormentata</em&gt; Artificiale e cellule presentanti l&#39;antigene per modificare geneticamente le cellule T da sangue del cordone ombelicale e periferico

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

clinical-application-sleeping-beauty-artificial-antigen-presenting

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

18.2K Views.  U.T. MD Anderson Cancer Center. Cellule T CD19-che esprimono un recettore chimerico specifico antigene (CAR) sono infusi come trattamento sperimentale di tumori maligni delle cellule B nelle nostre prove gene first-in-umani terapia. Descriviamo modificazione genetica delle cellule T con il Bella Addormentata (SB) sistema per introdurre CD19-specifica CAR e la propagazione selettiva su cellule antigene CD19 Designer + artificiali che presentano.

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HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA-Ig celle in base Antigen Presenting artificiale per Efficiente Ex vivo Estensione dei diritti dell&#39;uomo e CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &amp;#947;&amp;#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

Espansione del sangue periferico umano γδ cellule T con Zoledronato

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

Espansione linfociti T citotossici da sangue del cordone ombelicale che Target Citomegalovirus, virus di Epstein-Barr virus, e Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

Antigen Presenting artificiale cellulare (AAPC) Attivazione mediata ed espansione delle cellule Natural Killer T

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for isolating precursor B-cells at four different stages of differentiation. Because genes are expressed and epigenetic modifications occur in a tissue specific manner, it is vital to discriminate between tissues and cell types in order to be able to identify alterations in the genome and the epigenome that may lead to the development of disease. This method can be adapted to any type of cell present in umbilical cord blood at any stage of differentiation.	
This method comprises 4 main steps. First, mononuclear cells are separated by density centrifugation. Second, B-cells are enriched using biotin conjugated antibodies that recognize and remove non B-cells from the mononuclear cells. Third the B-cells are fluorescently labeled with cell surface protein antibodies specific to individual stages of B-cell development. Finally, the fluorescently labeled cells are sorted and individual populations are recovered. The recovered cells are of sufficient quantity and quality to be utilized in downstream nucleic acid assays.

Here we describe a protocol for isolating subsets of precursor B-cells from umbilical cord blood. A sufficient quantity and quality of nucleic acids may be extracted from the cells and used in subsequent assays utilizing DNA or RNA.

Isolamento di precursori delle cellule B di sottoinsiemi di sangue del cordone ombelicale

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied by adverse side effects such as a reduced ability to control infections or malignancies. Therefore, new approaches need to be developed that target only the disease mediating cells and leave the remaining immune system intact. Over the past decade a variety of cell based immunotherapy strategies to modulate T cell mediated immune responses have been developed. Most of these approaches rely on tolerance-inducing antigen presenting cells (APC). However, in addition to being technically difficult and cumbersome, such cell-based approaches are highly sensitive to cytotoxic T cell responses, which limits their therapeutic capacity. Here we present a protocol for the generation of non-cellular killer artificial antigen presenting cells (KaAPC), which allows for the depletion of pathologic T cells while leaving the remaining immune system untouched and functional. KaAPC is an alternative solution to cellular immunotherapy which has potential for treating autoimmune diseases and allograft rejections by regulating undesirable T cell responses in an antigen specific fashion.

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Guidelines are presented for the generation of killer artificial antigen presenting cells, KaAPC, an efficient tool for in vitro depletion of human antigen-specific T cells and an alternative solution to cellular immunotherapy for the treatment of T cell-mediated autoimmune diseases in an antigen-specific fashion without compromising the remaining immune system.

Killer artificiale cellule presentanti l&#39;antigene (KaAPC) per una efficiente<em&gt; In Vitro</em&gt; L&#39;esaurimento delle Umana antigene-specifiche cellule T

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

Generazione di Human alloantigene-specifiche cellule T da sangue periferico

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

Development of an Antigen-driven Colitis Model to Study Presentation of Antigens by Antigen Presenting Cells to T Cells

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological mechanisms involved during the disease is the T cell transfer model of colitis. In this model, immunodeficient mice (RAG-/- recipients) are reconstituted with naive CD4+ T cells from healthy wild type hosts.
This model allows examination of the earliest immunological events leading to disease and chronic inflammation, when the gut inflammation perpetuates but does not depend on a defined antigen. To study the potential role of antigen presenting cells (APCs) in the disease process, it is helpful to have an antigen-driven disease model, in which a defined commensal-derived antigen leads to colitis. An antigen driven-colitis model has hence been developed. In this model OT-II CD4+ T cells, that can recognize only specific epitopes in the OVA protein, are transferred into RAG-/- hosts challenged with CFP-OVA-expressing E. coli. This model allows the examination of interactions between APCs and T cells in the lamina propria.

In this antigen-driven colitis model, OT-II CD4+ T cells expressing a red fluorescent protein were adoptively transferred into RAG-/- mice that express a green fluorescent protein in mononuclear phagocytes (MPs). The hosts were challenged with Escherichia coli (E.coli) expressing the ovalbumin protein (OVA) fused to a cyan fluorescent protein (CFP).

Sviluppo di un modello colite Antigen-driven per studiare presentazione di antigeni da cellule presentanti l&#39;antigene alle cellule T

Inflammatory bowel disease (IBD) is a chronic inflammation which affects the gastrointestinal tract (GIT). One of the best ways to study the immunological ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells differentiate to form platelet precursors called megakaryocytes, which terminally differentiate to release platelets from long cytoplasmic processes termed proplatelets. Megakaryocytes are rare cells confined to the bone marrow and are therefore difficult to harvest in sufficient numbers for laboratory use. Efficient production of human megakaryocytes can be achieved in vitro by culturing CD34+ cells under suitable conditions. The protocol detailed here describes isolation of CD34+ cells by magnetic cell sorting from umbilical cord blood samples. The necessary steps to produce highly pure, mature megakaryocytes under serum-free conditions are described. Details of phenotypic analysis of megakaryocyte differentiation and determination of proplatelet formation and platelet production are also provided. Effectors that influence megakaryocyte differentiation and/or proplatelet formation, such as anti-platelet antibodies or thrombopoietin mimetics, can be added to cultured cells to examine biological function.

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

A highly pure population of megakaryocytes can be obtained from cord blood-derived CD34+ cells. A method for CD34+ cell isolation and megakaryocyte differentiation is described here.

La differenziazione dei megacariociti e formazione delle piastrine da umani cavo emoderivati CD34 cellule+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Generation of Discriminative Human Monoclonal Antibodies from Rare Antigen-specific B Cells Circulating in Blood

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the antibody needs to distinguish between highly related structures (e.g., a normal protein and a mutated version thereof). The current way of generating such discriminative mAbs involves extensive screening of multiple Ab-producing B cells, which is both costly and time consuming. We propose here a rapid and cost-effective method for the generation of discriminative, fully human mAbs starting from human blood circulating B lymphocytes. The originality of this strategy is due to the selection of specific antigen binding B cells combined with the counter-selection of all other cells, using readily available Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMC). Once specific B cells are isolated, cDNA (complementary deoxyribonucleic acid) sequences coding for the corresponding mAb are obtained using single cell Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) technology and subsequently expressed in human cells. Within as little as 1 month, it is possible to produce milligrams of highly discriminative human mAbs directed against virtually any desired antigen naturally detected by the B cell repertoire.

We describe a method for the production of human antibodies specific for an antigen of interest, starting from rare B cells circulating in human blood. Generation of these natural antibodies is efficient and rapid, and the antibodies obtained can discriminate between highly related antigens.

Generazione di anticorpi monoclonali umani discriminante da rari B antigene-specifiche cellule circolanti nel sangue

Monoclonal antibodies (mAbs) are powerful tools useful for both fundamental research and in biomedicine. Their high specificity is indispensable when the ...