Questo lavoro è supportato in parte dal NIH / NCATS Science Awards clinica e traslazionale alla University of Florida TL1 TR000066 e UL1 TR000064, un supplemento diversità dal padre di Grant R01AI056152 dal National Institute of Health, una borsa di reagente BD Biosciences, e l&#39;Università della Florida.

Tutte uso animale è stato condotto in conformità con i protocolli approvati dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso. 1. Preparazione di miscele e media <ol><li> Sterile PBS pH: 7,3 (1 L) 0.23 g NaH 2 PO 4 1.15 g Na 2 HPO 4 9.0 g NaCl Raccogliere volume con acqua deionizzata. Sterilizzare con autoclave. </li><li> Cellulari Media Cultura (100 ml) 89 ml RPMI 10 ml 10% FBS 1 ml di antibiotico antimicotico (ABAM) 100 mcg 50 mM 2-mercaptoetanolo (3,5 mg magazzino 2-mercaptoetanolo in 96,5 mcg PBS) </li><li> FACS Buffer (Fluorescent Attivazione cellulare Ordinamento) (Per essere usato durante la citometria a flusso) 2% FBS in PBS sterile </li><li> iTh17 Mix (Basato sul numero di campioni, determinare il volume necessario per tutte le miscele e media) 1,5 mg / ml di anti-CD28 20 ng / ml di IL-6 5 ng / mlTGF-β </li></ol> 2. Le cellule saranno piastrate in Triplicate sotto le seguenti condizioni di <ol><li> Piatto vincolato anti-CD3, anti-CD28 (è questo il mix di controllo di attivazione). </li><li> iTH17: Piastra vincolato anti-CD3, anti-CD28, IL-6, TGF-β. </li></ol> 3. Plate-bound anti-CD3 (10 mg / ml) Si raccomanda che la preparazione di piastra piastre con associazione anti-CD3 viene fatto almeno 4 ore prima dell&#39;ora cellule saranno aggiunti alle piastre. <ol><li> Aggiungere 30 microlitri anti-CD3 per pozzetti (anti-CD3 viene diluito in PBS sterile) di un nuovo 96 ben U inferiore Microtest piastra di coltura tissutale, e toccare i lati della piastra di garantire una copertura uniforme dei pozzetti. Incubare a 37 ° C per 4 ore, e poi in frigorifero fino al momento di aggiungere le miscele e le cellule alla piastra. </li></ol> 4. Topo Dissection <ol><li> Questo protocollo è basato sull&#39;impiego di C57BL / 6 mice, 3-8 mesi di età, e acquistati dal Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). </li><li> Sacrifica mouse utilizzando CO 2 asfissia, e confermare la morte con conseguente dislocazione cervicale. </li><li> Sterilizzare topi strumenti di dissezione e la zona di incisione con il 70% di etanolo e iniziare la dissezione. </li><li> Dalla vista ventrale, afferrare la pelle che è anteriore alla apertura uretrale e iniziare il taglio con le forbici la linea mediana ventrale fino a raggiungere la zona del mento. Prendere precauzioni per non strappare o tagliare nel rivestimento della parete peritoneale. </li><li> Tirare indietro la pelle e fissare per consentire un comodo accesso ai linfonodi durante la rimozione. </li><li> I linfonodi e milza raccolti saranno tutti rimossi con una pinza, e collocato in una capsula di Petri sterile contenente 5 ml di autoMACS tampone di corsa acquistato da Miltenyi Biotec (fare riferimento alle figure 2 e 3 per linfonodo e diagrammi di rimozione della milza). <ol><li> Rimuovere i linfonodi ascellari che sonotrovato vicino al cavo ascellare (ascelle) dietro i muscoli pettorali di ogni mouse. </li><li> Rimuovere i linfonodi brachiale che si trovano nei tessuti connettivi situati vicino a ciascuna ascella. </li><li> Rimuovere le superficiali linfonodi cervicali presenti nel collo di ciascun topo. </li><li> Rimuovere i linfonodi inguinali che si trovano nella regione dell&#39;anca alla congiunzione dei tre vasi sanguigni. </li><li> Per accedere ai linfonodi mesenterici, tagliare il rivestimento peritoneale la linea mediana ventrale. Linfonodi mesenterici si trovano nel tessuto connettivo che tiene insieme l&#39;intestino. Essi si trovano generalmente in una serie di 4-8 nodi, e può apparire come un &quot;filo di perle&quot;. Assicurati di tirare fuori l&#39;intera stringa. </li><li> La milza si trova nella zona addominale, dietro lo stomaco e l&#39;intestino. Rimuoverlo tirando e staccandolo dal pancreas. </li></ol></li><li> Grind organi sotto una cappa sterile utilizzando due vetrini da microscopio smerigliato. Posizionare linfonodi o milza suil lato opaco di un vetrino da microscopio, e strofinare con il lato glassato della seconda slitta fino disintegrato. Ripetere l&#39;operazione finché non sono stati a terra tutti i linfonodi e la milza. </li></ol> Nota: Si consiglia di iniziare con linfonodi e finire con la milza, come il sangue renderà difficile vedere i linfonodi rimanenti nel buffer autoMACS. <ol start="9"><li> Per filtrare organi terra in una sospensione di cellule singole, iniziare piegando un pezzo di 40 micron nylon materiale più volte, e ponendo in cima ad una provetta da centrifuga da 15 ml. Il materiale di nylon dovrebbe essere di circa 3 x 3 pollici </li><li> Utilizzare una siringa da 5 ml e 21 G ago per aspirare il 5 ml di autoMACS tampone di corsa e di terra organi. Versare lentamente nel materiale di nylon ripiegato. Fare attenzione a non bucare il materiale con l&#39;ago. </li></ol> Nota: Una volta che la sospensione singola cella è raggiunto, la soluzione deve apparire come una soluzione coerente pallido senza visibLe parti di tessuto solido. Se rimangono solidi, ri-aspirare e dispensare attraverso un nuovo pezzo piegato di nylon collocato in un nuovo tubo da centrifuga da 15 ml. <ol start="11"><li> Tenere sempre cellule in ghiaccio quando non in uso. </li></ol> 5. Separazione cellulare <ol><li> Per ottenere risultati ottimali, ottenere almeno un puro CD4 + 80% della popolazione CD25-cellulare attraverso autoMACS separatore cellulare Pro utilizzando il MACS CD4 + CD25 + T regolatorie isolamento delle cellule kit, mouse. Il protocollo per la conservazione negativa della popolazione CD25 delle cellule CD4 + è ottenuta attraverso Miltenyi Biotec. </li></ol> 6. Th17 Differenziazione <ol><li> Raccogliere la popolazione CD25 delle cellule CD4 + dopo la separazione con il separatore cellulare autoMACS Pro. </li><li> Contare le cellule diluite in un rapporto 1:1000 con trypan blu con un emocitometro. </li><li> Una concentrazione è stata determinata dalla conta delle cellule, diluire sospensione cellulare a 1 x 10 6 cellule / ml in cellule di coltura. </li><li> Estrarre piastre da 96 pozzetti con piastra vincolato anti-CD3 dopo 4 ore. </li><li> Lavare i pozzetti anti-CD3-rivestiti con 200 ml di PBS. Ripetere 2 volte. <ol><li> Per lavare aggiungere 200 ml di PBS sterile per pozzi anti-CD3-rivestite e rimuovere PBS in un contenitore per rifiuti. </li></ol></li><li> Aggiungere 100 ml di mix iTh17 o mix comando di attivazione (vedi punto # 2) per i pozzi in triplice copia. </li><li> Aggiungere 100 ml di cellule in ciascun pozzetto in cui sia il mix Th17 o il mix di controllo di attivazione sia stato inserito. </li><li> Incubare le cellule per almeno 72 ore o fino a 5 giorni (differenziazione Th17 può essere ottenuta dopo 72 ore o dopo 5 giorni.) </li><li> Differenziazione Th17 può essere valutata intracellulare di colorazione e analisi di citometria a flusso, ELISA, o qPCR </li></ol> 7. L&#39;attivazione delle cellule (necessario solo per la colorazione intracellulare) <ol><li> Rimuovere piastre da 96 pozzetti da incubatrice alla fine di una delle 72 ore o 5 giorni <ol><li> Ricordiamo che Th17 differentiation può essere raggiunto dopo due 72 ore o 5 giorni. </li></ol></li><li> Per ciascuna condizione (ad esempio controlli di attivazione o iTh17), trasferire le cellule che sono in triplice copia in un pozzetto di una piastra 24 ben coltura cellulare. Le celle di una condizione ora sono stati raggruppati in un unico pozzetto della piastra da 24 cultura e, invece di essere in triplicato in piastra di coltura ben U inferiore 96. </li><li> Il volume totale di ciascun pozzetto nella piastra di coltura cellulare da 24 pozzetti è ora 600 microlitri. Aumentare il volume di ciascun pozzetto a 1 ml con mezzo di coltura cellulare. </li><li> Aggiungere PMA (forbolo miristato acetato) (50 ng / ml), ionomicina (1 mM), e BFA (brefeldina-A) (10 mg / ml) a ciascun pozzetto della piastra 24 e coltura cellulare alle concentrazioni elencate. </li><li> Incubare a 37 ° C per 4 ore. </li></ol> 8. Colorazione intracellulare <ol><li> Cellule macchia con i marcatori extracellulari e intracellulari desiderate per l&#39;analisi di citometria di flusso. Per rilevare la presenza of IL-17, la colorazione intracellulare è fatto con anticorpi anti-IL-17A. Marcatori consigliati superficie extracellulari includono CD4, CD8 e CD25. <ol><li> Utilizzare il intracellulare di citochine colorazione Starter Kit-Mouse da BD Bioscience per IL-17 intracellulare colorazione. </li><li> Per ciascun campione, cellule pellet, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 200 microlitri tampone FACS (2% FBS in PBS). </li><li> Trasferire le cellule in sospensione al 96 citometria di flusso cella piatto. </li><li> Spin celle in basso per 5 min a 1200 rpm e scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere 200 microlitri tampone FACS PBS, centrifugare per 5 minuti a 1200 rpm, e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 100 ml di FACS buffer e valgono 100 ml di anticorpi extracellulare (Ab) miscela (miscela extracellulare Ab è realizzato in tampone FACS). Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente, coperto con pellicola. </li><li> Ripetere passo 8.1.4. </li><li> Ripetere il punto 8.1.5 2x. </li><li> Risospendere le cellule in 100 ml di BD Cytofix / Cytoperm Buffer. Incubmangiato per 20 minuti a temperatura ambiente, coperto con pellicola. </li><li> Aggiungere 100 ml di 1x tampone BD Perm / Wash, centrifugare per 5 min a 1.200 giri al minuto, e scartare il surnatante. Ripeti. </li><li> Aggiungere 50 ml di miscela intracellulare Ab. (Miscela intracellulare Ab è fatta in 1x BD Perm / Wash) Incubare per 15 minuti a RT, coperto con un foglio. </li><li> Ripetere passo 8.1.10. </li><li> Risospendere le cellule in 200 ml di BD colorazione Buffer. </li><li> Posizionare cellule risospese in citometria a flusso provette contenenti 200 microlitri BD colorazione Buffer (volume finale è di 400 ml). </li><li> Conservare a 4 ° C fino a quando i campioni sono pronti per essere letti. </li></ol></li></ol> 9. Analisi citofluorimetrica <ol><li> Porta popolazione cellulare dal vivo. </li><li> Dalla popolazione delle cellule vive, cancello CD4 + CD8-popolazione. </li><li> Dal CD8 popolazione CD4 +, cancello IL-17A + popolazione. <ol><li> Sulla base dei nostri risultati sperimentali precedenti, il 100% della IL-17A + popolazione sarà CD25 +. </li></ol></li></ol> * Totale conta delle cellule assoluti sono stati ottenuti dopo la messa in comune delle triplicati campione ** Numero assoluto di + IL-17A + CD4 + CD25 è stato determinato moltiplicando il numero totale di cellule per la percentuale cancello vivo e la percentuale di cellule totali recanti i marcatori specifici lignaggio, CD4, CD25, e IL-17A, come determinata mediante citometria di flusso. 10. qPCR ed ELISA <ol><li> Cellule posto non utilizzati per l&#39;analisi di citometria di flusso in una provetta da 1,5 ml Eppendorf e centrifugare a 13.000 rpm per 5-10 min. Le cellule trovate nel pellet cellulare dopo centrifugazione saranno utilizzati per l&#39;analisi qPCR. analisi qPCR è stata effettuata utilizzando PTC-200 Peltier Thermal cycler (Biorad). </li><li> Raccogliere il surnatante dai tubi centrifugati per ELISA. IL-17A ELISA sono state eseguite usando la coppia di anticorpi TC11-18H10 (cattura, numero di catalogo 555068) e TC11-8H4 biotina (rilevamento, numero di catalogo 555067) acquistato da BD Biosciences. IL-17A ELISA standards sono stati ottenuti da eBioscience (numero di catalogo 14-8171-80). </li><li> Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere le cellule rimanenti da utilizzare per qPCR in 175 microlitri di buffer RNA lisi (utilizzare immediatamente per l&#39;estrazione di RNA, sintesi di cDNA, e qPCR, o conservare a -80 ° C per un uso successivo). <ol><li> Fare riferimento alla Tabella II per le sequenze di primer per IL-17A e actina (house-keeping gene) </li></ol></li></ol>

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Qui abbiamo descritto il protocollo per raggiungere la differenziazione Th17 in vitro. Lo studio di Th17 differenziazione è importante, la differenziazione dei linfociti T nel sottoinsieme Th17 è fondamentale per l&#39;efficace eliminazione di agenti patogeni umani 13. Al contrario, la produzione di IL17 è stato associato a progressione della malattia autoimmune 13. Il metodo di Th17 differenziazione è applicabile a molti ambiti di ricerca in quanto può essere applicata a numerosi mod...

Linfociti T CD4 + (cellule T) giocano un ruolo fondamentale nella difesa del sistema immunitario mediata contro i microrganismi infettivi. Viceversa, le cellule T sono intimamente associati con l&#39;insorgenza e la progressione di malattie autoimmuni come il diabete di tipo 1, il lupus eritematoso sistemico e artrite reumatoide. CD4 + linfociti T si attivano attraverso una combinazione di recettore delle cellule T (TCR) interazioni con antigene cognate / complesso maggiore di istocompatibilità II (MHCII) molecole e le interazioni recettore CD28 con B7.1/B7.2 ligandi 15. In aggiunta alla disposizione di stimolazione TCR e CD28 co-stimolazione, le cellule presentanti l&#39;antigene forniscono inoltre un ambiente di citochine, che determina lo stato di differenziazione del linfocita T, indirizzando così la risposta del linfocita T all&#39;antigene dato. Interazioni patogeno Distinto cellulari / presentanti l&#39;antigene creare ambienti di citochine distinte, che Skew T linfociti giù distinti percorsi incentrati sulla eliminazione del patogeno avvio. Purtroppo, T percorsi linfociti effettori, originariamente progettato per sradicare invasori patogeni, possono essere erroneamente diretti contro auto-tessuti 15. Pertanto, una migliore comprensione dello stato di differenziazione ciascun distinto di subset di cellule CD4 + T è fondamentale per la nostra comprensione di come modulare l&#39;equilibrio tra eliminazione degli agenti patogeni e la tolleranza di sé. Oltre al Th1, Th2, e inducibili T regolatori percorsi di differenziazione cellulare, naive linfociti T possono essere causati anche dalle citochine lungo la via Th17. Mentre le cellule Th1 combattimento patogeni intracellulari, cellule Th2 eliminano i patogeni extracellulari, e le cellule T regolatorie (Tregs) minimizzano risposte infiammatorie 1, 16; cellule Th17 svolgono un ruolo importante nella eliminazione dei batteri extracellulari e funghi. Cellule Th17 sono generalmente indicati con l&#39;espressione del fattore di trascrizione specifico lineage RORγT e la produzione di IL-17A, che promuove l&#39;attivazione di macrofagi e neutrofili 1, 7. Cellule Th17 sono stati implicati in diverse malattie autoimmuni, e loro modelli di roditori associati. Ad esempio, è stato dimostrato che l&#39;IL-23 (che è necessario per sostenere il fenotipo Th17), ma non IL-12, sia il principale responsabile in encefalite autoimmune sperimentale (EAE), il modello di malattia roditore per MS. In seguito è stato dimostrato che la riduzione della produzione di IL-17 sono correlati alla prevenzione EAE 2, 6, 17. Inoltre, le cellule Th17 sono stati associati con altre malattie autoimmuni tra cui l&#39;artrite e lupus eritematoso sistemico (SLE) 10, 16. IL-23 p19 deficienti - / - topi hanno mostrato di avere numeri molto bassi di cellule Th17, e sono resistenti allo sviluppo non solo EAE, ma anche artrite indotta da collagene, un modello per l&#39;artrite reumatoide 10, 18. Inoltre, i topi trattati con anticorpi neutralizzanti IL-17A poppaer l&#39;insorgenza di artrite collagene-indotta sono stati anche trovati ad avere la risoluzione del danno articolare 18. Va notato che il ruolo delle cellule Th17 nella progressione della malattia autoimmune rimane ad essere caratterizzato come recenti ricerche hanno anche dimostrato un ruolo protettivo delle cellule Th17 nel diabete di tipo 1 9, 11 e infiammazione intestinale 14. Questi studi confermano l&#39;importanza di Th17 differenziazione in autoimmunità. In vitro la differenziazione Th17 è un metodo necessario nella ricerca sulle cellule T, perché ci sono almeno due domande imbarazzanti che richiedono ulteriori indagini: 1) Come funziona esattamente IL-6 regolano l&#39;equilibrio tra Treg e Th17 differenziazione, e 2) quali sono i meccanismi esatti dietro IL-17 indotta da malattie infiammatorie? Il nostro metodo impiega cellule CD4 + CD25-T dalle milze e linfonodi del topo C57BL / 6. È importante notare che, sebbene sia possibile indurre differenziazione Th17 utilizzando un impurola popolazione, l&#39;acquisizione di almeno un puro CD4 + 80% popolazione di cellule CD25-T nega qualsiasi preoccupazione di contaminazione e garantisce risultati più efficaci differenziazione Th17. Al fine di conseguire un&#39;adeguata differenziazione Th17, cellule CD4 + CD25-T vengono incubati in presenza di anti-CD3 e anti-CD28, che forniscono segnali di attivazione, 1 e 2, rispettivamente, e IL-6 e TGF-β. Sebbene sia stato riportato che IL-23 da sola può essere usato per raggiungere la differenziazione Th17, successivamente è stato dimostrato che l&#39;IL-23 è necessario per la stabilità della popolazione di cellule Th17, ma IL-6 e TGF-β sono essenziali per Th17 differenziazione 3, 18, ​​19. Studi murini hanno dimostrato che il recettore di IL-23 è espresso sulle cellule T CD4 + solo dopo che sono state stimolate con IL-6 e TGF-β 13, 18. Inoltre, le cellule Th17 svilupperanno correttamente in presenza di anticorpi IL-23-bloccante finché IL-6 e TGF-β sono presenti 18, 19. Come tale, questa differenziazione Th17 protocollo provIDES le condizioni appropriate per indurre successo Th17 differenziazione. Sviluppo di una migliore comprensione dei meccanismi alla base Th17 differenziazione e IL-17 presenta l&#39;opportunità per lo sviluppo di migliori terapie volte a disturbi autoimmuni 13.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagent/Material&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sterile Polyestrene Petri Dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>0875713A</td><td>60 mm x 15 mm</td></tr><tr><td>autoMACS Running Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Premium Microscope Slides, Frosted</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3</td><td>3&quot; x 1&quot;1 mm</td></tr><tr><td>5 ml 21G1 Latex Free Syringe and Needle</td><td>BD Biosciences</td><td>309632</td><td></td></tr><tr><td>Corning 15 ml Centrifuge Tubes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>Nylon 40 microns</td><td>Miami Aquaculture</td><td>Nylon 40/26</td><td></td></tr><tr><td>Microtest tissue culture plate 96 well U bottom </td><td>BD Biosciences</td><td>35-3077</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 24 well cell culture plates</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CL3524</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes 1.5 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD3e</td><td>BD Biosciences</td><td>553057</td><td></td></tr><tr><td>Purified NA/LE Hamster Anti-Mouse CD28</td><td>BD Biosciences</td><td>553294</td><td></td></tr><tr><td>Mouse IL-6 Recombinant Protein</td><td>eBioscience</td><td>14-8061-62</td><td></td></tr><tr><td>TGFbeta</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>240-B-002</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue solution 0.4 %</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>66H2364</td><td></td></tr><tr><td>Pac Blue Rat Anti-Mouse CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>558107</td><td></td></tr><tr><td>APC Rat Anti-Mouse CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>553035</td><td></td></tr><tr><td>PE Conjugated Anti-mouse CD25</td><td>eBioscience</td><td>E01155-516</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700 Rat Anti-mouse IL-17</td><td>BD Biosciences</td><td>560820</td><td></td></tr><tr><td>Intracellular Cytokine Staining Starter Kit-Mouse</td><td>BD Biosciences</td><td>51-2041AK (559311)</td><td></td></tr><tr><td>MACS CD4+CD25+ regulatory T cell isolation kit, mouse</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>ABAM </td><td>Cellgro</td><td>30-004-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Corning, Cellgro</td><td>10-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>B 2-Mercapt&amp;#8211;thanol</td><td>MP Biomedical</td><td>194834</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin Calcium Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13909-1ML</td><td>Hazardous</td></tr><tr><td>Brefeldin A (BFA)</td><td>MP Biomedicals</td><td>159027</td><td></td></tr><tr><td>ELISA IL-17A Capture mAb </td><td>BD Biosciences</td><td>555068</td><td></td></tr><tr><td>ELISA IL-17A Detection mAb </td><td>BD Biosciences</td><td>555067</td><td></td></tr><tr><td>ELISA IL-17A Standard</td><td>eBioscience</td><td>14-8171-80</td><td></td></tr><tr><td>IL-2 ELISA Kit</td><td>BD Biosciences</td><td>555148</td><td></td></tr><tr><td>TMB Substrate Reagent Set </td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment &lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>autoMACS Pro Cell Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall Legend RT+ Centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Napco series 8000 WJ CO2 Incubator</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PTC-200 Peltier Thermal Cycler</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and th17 differentiation of na&iuml;ve cd4 t lymphocytes

Cellule Th17 sono un sottoinsieme distinto di cellule T che sono stati trovati per produrre interleuchina 17 (IL-17), e si differenziano in funzione degli altri sottogruppi di cellule T compreso Th1, Th2, e linfociti T regolatori. Cellule Th17 sono emersi come un colpevole centrale nelle risposte immunitarie infiammatorie troppo zelanti associati a molte malattie autoimmuni. In questo metodo purifichiamo linfociti T dalla milza e nei linfonodi di topi C57BL / 6, e stimolare le cellule T CD4 + purificati sotto controllo e ambienti Th17 inducono. L&#39;ambiente-Th17 indurre comprende stimolazione in presenza di anti-CD3 e anti-CD28 anticorpi, IL-6 e TGF-β. Dopo incubazione per almeno 72 ore e fino a cinque giorni a 37 ° C, le cellule vengono successivamente analizzati per la capacità di produrre IL-17 mediante citometria a flusso, qPCR, ed ELISA. Th17 differenziate cellule CD4 + CD25-T possono essere utilizzati per chiarire ulteriormente il ruolo che le cellule Th17 giocano nella insorgenza e la progressione di autoimmunità e ospite defense. Inoltre, Th17 differenziazione dei CD4 + CD25-linfociti da diversi modelli knockout / malattia murini può contribuire alla nostra comprensione del destino delle cellule plasticità.

Questo protocollo differenziazione Th17 inizia con la rimozione della milza e ascellare, brachiale, mesenterica, cervicale, e linfonodi inguinali. Una rappresentazione delle posizioni di ciascun possono essere trovate nelle figure 2 e 3. Figure 1 e 5 entrambi forniscono una rappresentazione visiva dei metodi descritti in questo protocollo. Questo protocollo Th17 concentra sulla differenziazione dalla popolazione linfocitaria CD4 + CD25-T. È...

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Isolation and Th17 Differentiation of Na&#239;ve CD4 T Lymphocytes

Con le funzioni effettrici distinto da altri sottoinsiemi di cellule T, le cellule Th17 sono stati implicati nel centro di autoimmunità infiammatoria. Questo protocollo vitro la differenziazione in Th17 fornisce un mezzo per determinare se naïve linfociti T CD4 + in grado di differenziarsi in cellule Th17, e di esaminare ulteriormente il loro ruolo nella autoimmunità e risposta dell&#39;ospite.

Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

Th17 cells are a distinct subset of T cells that have been found to produce interleukin 17 (IL-17), and differ in function from the other T cell subsets ...

isolation-and-th17-differentiation-of-nave-cd4-t-lymphocytes

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Th17 Differentiation of Na&iuml;ve CD4 T Lymphocytes

34.3K Views.  The University of Florida.  Con le funzioni effettrici distinto da altri sottoinsiemi di cellule T, le cellule Th17 sono stati implicati nel centro di autoimmunità infiammatoria. Questo protocollo vitro la differenziazione in Th17 fornisce un mezzo per determinare se naïve linfociti T CD4 + in grado di differenziarsi in cellule Th17, e di esaminare ulteriormente il loro ruolo nella autoimmunità e risposta dell'ospite. 

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Methods to Assess Beta Cell Death Mediated by Cytotoxic T Lymphocytes

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease. During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin production is lost, presumably this results from the destruction of pancreatic beta cells by T cells. Understanding the mechanisms of beta cell death during 
the development of T1D will provide insights to generate an effective cure for this disease. Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays have historically used the 
radionuclide Chromium 51 (51Cr) to label target cells. These targets are then exposed to effector cells and the release of 51Cr from target 
cells is read as an indication of lymphocyte-mediated cell death. Inhibitors of cell death result in decreased release of 51Cr.
 As effector cells, we used an activated autoreactive clonal population of CD8+ Cytotoxic T lymphocytes (CTL) isolated from a mouse stock transgenic for both the alpha and beta chains of the AI4 T cell receptor (TCR). Activated AI4 T cells were co-cultured with 51Cr labeled target NIT cells for 16 hours, release of 51Cr was recorded to calculate specific lysis 
Mitochondria participate in many important physiological events, such as energy production, regulation of signaling transduction, and apoptosis. The study of beta cell mitochondrial functional changes during the development of T1D is a novel area of research. Using the mitochondrial membrane potential dye Tetramethyl Rhodamine Methyl Ester (TMRM) and confocal microscopic live cell imaging, we monitored mitochondrial membrane potential over time in the beta cell line NIT-1. For imaging studies, effector AI4 T cells were labeled with the fluorescent nuclear staining dye Picogreen. NIT-1 cells and T cells were co-cultured in chambered coverglass and mounted on the microscope stage equipped with a live cell chamber, controlled at 37&deg;C, with 5% CO2, and humidified. During these experiments images were taken of each cluster every 3 minutes for 400 minutes.
Over a course of 400 minutes, we observed the dissipation of mitochondrial membrane potential in NIT-1 cell clusters where AI4 T cells were attached. In the simultaneous control experiment where NIT-1 cells were co-cultured with MHC mis-matched human lymphocyte Jurkat cells, mitochondrial membrane potential remained intact. This technique can be used to observe real-time changes in mitochondrial membrane potential in cells under attack of cytotoxic lymphocytes, cytokines, or other cytotoxic reagents.

Cell-mediated lymphocytotoxicity (CML) assays can be used to test autoreactive responses and study mechanisms of cell death in vitro. However, using live-cell confocal microscopic imaging techniques with fluorescent dyes, the type and kinetics of cell death as well as the pathways utilized can be studied in greater detail.

Metodi per valutare la morte delle cellule beta Mediata da linfociti T citotossici

Type 1 diabetes (T1D) is a T cell mediated autoimmune disease.  During the pathogenesis, patients become progressively more insulinopenic as 
insulin ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&iuml;ve and Memory T Cells

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in immunologic homeostasis with the vast amount of self and commensal antigens in and on the human body. Perturbations in the balance between Tregs and inflammatory conventional T cells can result in immunopathology or cancer. Although therapeutic injection of Tregs has been shown to be efficacious in murine models of colitis1 , type I diabetes2 , rheumatoid arthritis and graft versus host disease,4 several fundamental differences in human versus mouse Treg biology5 has thus far precluded clinical use. The lack of sufficient number, purity, stability and homing specificity of therapeutic Tregs necessitated a dynamic platform of human Treg development on which to optimize conditions for their ex vivo expansion6.
Here we describe a method for the differentiation of induced Tregs (iTregs) from a single human peripheral blood donor which can be broken down into four stages: isolation of peripheral blood mononuclear cells, magnetic selection of CD4+ T cells, in vitro cell culture and fluorescence activated cell sorting (FACS) of T cell subsets. Since the Treg signature transcription factor forkhead box P3 (FoxP3) is an activation-induced transcription factor in humans7 and no other unique marker exists, a combinatorial panel of markers must be used to identify T cells with suppressor activity. After six days in culture, cells in our system can be demarcated into na&iuml;ve T cells, memory T cells or iTregs based on their relative expression of CD25 and CD45RA. As memory and na&iuml;ve T cells have different reported polarization requirements and plasticities8 , pre-sorting of the initial T cell population into CD45RA+ and CD45RO+ subsets can be used to examine these discrepancies. Consistent with others, our CD25HiCD45RA- iTregs express high levels of FoxP39 , GITR and CTLA-411 and low levels of CD12712 . Following FACS of each population, resultant cells can be used in a suppressor assay which evaluates the relative ability to retard the proliferation of carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-labeled autologous T cells.

Generation of Induced Regulatory T Cells from Primary Human Na&#239;ve and Memory T Cells

We describe a method for generating regulatory, memory and na&#239;ve T cells from a single human blood donor. Polarized Tregs can be then compared to other subsets in a variety of genetic and functional applications with genetic homogeneity, including a suppression assay also detailed here.

Generazione di cellule T regolatrici indotte da cellule primarie umane T naive e memoria

The development and maintenance of immunosuppressive CD4+ regulatory T cells (Tregs) contribute to the peripheral tolerance needed to remain in ...

Directed Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells towards T Lymphocytes

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of malignancies 1. CTLs can recognize malignant cells by interacting tumor antigens with the T cell receptors (TCR), and release cytotoxins as well as cytokines to kill malignant cells. It is known that less-differentiated and central-memory-like (termed highly reactive) CTLs are the optimal population for ACT-based immunotherapy, because these CTLs have a high proliferative potential, are less prone to apoptosis than more differentiated cells and have a higher ability to respond to homeostatic cytokines 2-7. However, due to difficulties in obtaining a high number of such CTLs from patients, there is an urgent need to find a new approach to generate highly reactive Ag-specific CTLs for successful ACT-based therapies.
TCR transduction of the self-renewable stem cells for immune reconstitution has a therapeutic potential for the treatment of diseases 8-10. However, the approach to obtain embryonic stem cells (ESCs) from patients is not feasible. Although the use of hematopoietic stem cells (HSCs) for therapeutic purposes has been widely applied in clinic 11-13, HSCs have reduced differentiation and proliferative capacities, and HSCs are difficult to expand in in vitro cell culture 14-16. Recent iPS cell technology and the development of an in vitro system for gene delivery are capable of generating iPS cells from patients without any surgical approach. In addition, like ESCs, iPS cells possess indefinite proliferative capacity in vitro, and have been shown to differentiate into hematopoietic cells. Thus, iPS cells have greater potential to be used in ACT-based immunotherapy compared to ESCs or HSCs.
Here, we present methods for the generation of T lymphocytes from iPS cells in vitro, and in vivo programming of antigen-specific CTLs from iPS cells for promoting cancer immune surveillance. Stimulation in vitro with a Notch ligand drives T cell differentiation from iPS cells, and TCR gene transduction results in iPS cells differentiating into antigen-specific T cells in vivo, which prevents tumor growth. Thus, we demonstrate antigen-specific T cell differentiation from iPS cells. Our studies provide a potentially more efficient approach for generating antigen-specific CTLs for ACT-based therapies and facilitate the development of therapeutic strategies for diseases.

Generation of T lymphocytes from induced pluripotent stem (iPS) cells gives an alternative approach of using embryonic stem cells for T cell-based immunotherapy. The method shows that by utilizing either in vitro or in vivo induction system, iPS cells are able to differentiate into both conventional and antigen-specific T lymphocytes.

Differenziazione Regia di cellule staminali pluripotenti indotte verso Linfociti T

Adoptive cell transfer (ACT) of antigen-specific CD8+  cytotoxic T lymphocytes (CTLs) is a promising treatment for a variety of  malignancies 1. CTLs can  ...

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable cytokine-secreting cells. In order to label IL-17-secreting cells, a single cell suspension of mouse splenocytes is prepared and stimulated at 37&deg;C with PMA/ionomycin to induce cytokine secretion. To stop secretion cells are then placed on ice and are exposed to the IL-17 Catch Reagent   a bi-specific antibody that binds to CD45 on the cell surface of leukocytes and to IL-17 as it is secreted and caught near the cell surface. Secretion is then re-started by increasing the temperature to 37&deg;C and IL-17 is trapped by the Catch Reagent. Secretion is then stopped again, by placing cells on ice. To detect the trapped IL-17, cells are incubated with a second IL-17-specific antibody conjugated to biotin and an Anti-Biotin-PE antibody. Cells can now be directly analyzed by flow cytometry or prepared for isolation and enrichment by subsequent labeling with Anti-PE conjugated MicroBeads.

This procedure describes the detection and isolation of mouse TH17 leukocytes that actively secrete IL-17 upon stimulation.

Rilevazione e isolamento delle vitali del mouse IL-17-cellule che secernono T

The MACS Cytokine Secretion Assay technology allows detection of secreted cytokines on the single cell level and sensitive isolation of viable ...

Biologia

Adenoviral Transduction of Naive CD4 T Cells to Study Treg Differentiation

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 T cells in vitro with TCR- and co-stimulation in the presence of TGF&beta; and IL-2. This bears enormous potential for future therapies, however, the molecules and signaling pathways that control differentiation are largely unknown.
Primary T cells can be manipulated through ectopic gene expression, but common methods fail to target the most important naive state of the T cell prior to primary antigen recognition. Here, we provide a protocol to express ectopic genes in naive CD4 T cells in vitro before inducing Treg differentiation. It applies transduction with the replication-deficient adenovirus and explains its generation and production. The adenovirus can take up large inserts (up to 7 kb) and can be equipped with promoters to achieve high and transient overexpression in T cells. It effectively transduces naive mouse T cells if they express a transgenic Coxsackie adenovirus receptor (CAR). Importantly, after infection the T cells remain naive (CD44low, CD62Lhigh) and resting (CD25-, CD69-) and can be activated and differentiated into Tregs similar to non-infected cells. Thus, this method enables manipulation of CD4 T cell differentiation from its very beginning. It ensures that ectopic gene expression is already in place when early signaling events of the initial TCR stimulation induces cellular changes that eventually lead into Treg differentiation.

Adenoviral gene transfer into naive CD4 T cells with transgenic expression of the Coxsackie adenovirus receptor enables the molecular analysis of regulatory T cell differentiation in vitro.

Trasduzione Adenoviral di CD4 T naive Cells allo Studio Differenziazione Treg

Regulatory T cells (Tregs) are essential to provide immune tolerance to self as well as to certain foreign antigens. Tregs can be generated from naive CD4 ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been considered as the only source of &#945;&#946;T cells. Yet, thymic involution begins early in life leading to a drastically reduced output of na&#239;ve &#945;&#946;T cells into the periphery. Nevertheless, even centenarians can build immunity against newly acquired pathogens. Recent research suggests extrathymic &#945;&#946;T cell development, however our understanding of pathways that may compensate for thymic loss of function are still rudimental. &#947;&#948; T cells are innate lymphocytes that constitute the main T-cell subset in the tissues. We recently ascribed a so far unappreciated outstanding function to a &#947;&#948; T cell subset by showing that the scarce entity of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells can transdifferentiate into &#945;&#946;T cells in inflammatory conditions. Here, we provide the protocol for the isolation of this progenitor from peripheral blood and its subsequent cultivation. V&#948;1 cells are positively enriched from PBMCs of healthy human donors using magnetic beads, followed by a second step wherein we target the scarce fraction of CD4+ cells with a further magnetic labeling technique. The magnetic force of the second labeling exceeds the one of the first magnetic label, and thus allows the efficient, quantitative and specific positive isolation of the population of interest. We then introduce the technique and culture condition required for cloning and efficiently expanding the cells and for identification of the generated clones by FACS analysis. Thus, we provide a detailed protocol for the purification, culture and ex vivo expansion of CD4+ V&#948;1+&#947;&#948; T cells. This knowledge is prerequisite for studies that relate to this &#945;&#946;T cell progenitor`s biology and for those who aim to identify the molecular triggers that are involved in its transdifferentiation.

Isolation and Ex Vivo Culture of V&#948;1+CD4+&#947;&#948; T Cells, an Extrathymic &#945;&#946;T-cell Progenitor

Here, we provide an optimized protocol for the isolation and cloning of the scarce T-cell entity of peripheral V&#948;1+CD4+ T cells that is, as we showed recently, an extrathymic &#945;&#946; T-cell progenitor. This technique allows to quantitatively isolate, clone and efficiently expand these cells in ex vivo culture.

Isolamento e<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura di Vδ1<sup&gt; +</sup&gt; CD4<sup&gt; +</sup&gt; Celle γδ T, un Extrathymic αβT-cellule progenitrici

The thymus, the primary organ for the generation of &#945;&#946; T cells and backbone of the adaptive immune system in vertebrates, has long been ...

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producing T Helper (THGM) Cells

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly secretes GM-CSF without producing interferon (IFN)&#947; or interleukin (IL)-17 and is found to play an essential role in the autoimmune neuroinflammation. A method of isolation of naive CD4+ T cells from a single-cell suspension of splenocytes and THGM cell generation from naive CD4+ T cells would be a useful technique in the study of T cell-mediated immunity and autoimmune diseases. Here we describe a method that differentiates mouse naive CD4+ T cells into THGM cells promoted by IL-7. The outcome of the differentiation was assessed by the analysis of the cytokines expression using different techniques, including intracellular cytokine staining combined with flow cytometry, a quantitative real-time polymerase chain reaction (PCR), and enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA). Using the THGM differentiation protocol as described here, about 55% of the cells expressed GM-CSF with a minimal expression of IFN&#945; or IL-17. The predominant expression of GM-CSF by THGM cells was further confirmed by the analysis of the expression of GM-CSF, IFN&#945;, and IL-17 at both mRNA and protein levels. Thus, this method can be used to differentiate naive CD4+ T cells to THGM cells in vitro, which will be useful in the study of THGM cell biology.

In Vitro Differentiation of Mouse Granulocyte-macrophage-colony-stimulating Factor GM-CSF-producing T Helper THGM Cells

Here, we present a protocol to differentiate murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T helper (THGM) cells from naive CD4+ T cells, including isolation of naive CD4+ T cells, differentiation of THGM, and analysis of differentiated THGM cells. This method can be applied to studies of the regulation and function of THGM cells.

In Vitro Differenziazione dei Mouse del Granulocyte-macrofago-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producendo le cellule T Helper (THGM)

The granulocyte-macrophage-colony-stimulating factor (GM-CSF)-producing T helper (THGM) cell is a newly identified T helper cell subset that predominantly ...

<meta charset="utf8"></head><body>Differenziazione cellulare Th17 da cellule T CD4+ naive mediante citometria a flusso

In Vitro Differentiation of Naive CD4+ T Cells into Pathogenic Th17 Cells in Mouse

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have been linked to a wide range of diseases in recent times, including multiple sclerosis (MS), rheumatoid arthritis, acute respiratory distress syndrome (ARDS), sepsis, and other autoimmune disorders. However, the currently known in vitro differentiation protocols have difficulty achieving high purity of pathogenic Th17 cells, with the induction efficiency often below 50%, which is a key challenge in in vitro experiments. In this protocol, we propose an enhanced in vitro culture and differentiation protocol for pathogenic Th17 cells, which is used to directly differentiate naive CD4+ T cells isolated from mouse spleens into pathogenic Th17 cells. This protocol provides detailed instructions on splenocyte isolation, purification of naive CD4+ T cells, and differentiation of pathogenic Th17 cells. Through this protocol, we can achieve a differentiation purity of approximately 90% for pathogenic Th17 cells, which meets the basic needs of many cellular experiments.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Ottenere la differenziazione in vitro ad alta purezza delle cellule Th17 utilizzando la modulazione della concentrazione di citochine

This protocol describes the differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells into pathogenic Th17 cells in vitro. Specifically, when combined with a multi-parameter flow cytometry-based approach, 90% purity of pathogenic Th17 cells can be obtained from na&#239;ve CD4+ T cells using this differentiation method.

Differenziazione in vitro di cellule T CD4+ naive in cellule Th17 patogene nel topo

In vitro T cell differentiation techniques are essential for both functional and mechanistic investigations of CD4+ T cells. Pathogenic Th17 cells have ...

Isolamento e differenziazione di Th17 Naïve linfociti T CD4

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Metodi per valutare la morte delle cellule beta Mediata da linfociti T citotossici

Generazione di cellule T regolatrici indotte da cellule primarie umane T naive e memoria

Differenziazione Regia di cellule staminali pluripotenti indotte verso Linfociti T

Rilevazione e isolamento delle vitali del mouse IL-17-cellule che secernono T

Trasduzione Adenoviral di CD4 T naive Cells allo Studio Differenziazione Treg

Mouse Naïve CD4

Isolamento e

In Vitro Differenziazione dei Mouse del Granulocyte-macrofago-colony-stimulating Factor (GM-CSF)-producendo le cellule T Helper (T_HGM)

Differenziazione in vitro di cellule T CD4⁺ naive in cellule Th17 patogene nel topo

Differenziazione in vitro di cellule T CD4⁺ naive in cellule Th17 patogene nel topo