Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NCI R00 CA132784) a KT

1. Isolamento di cellule mononucleate da sangue del cordone ombelicale <ol><li> Preparare EDTA-tampone PBS-aggiungere 5 ml di albumina di siero bovino (BSA) soluzione madre a 95 ml di tampone di lavaggio (diluizione 1:20). Degas il buffer e mantenere il buffer su ghiaccio. IMPORTANTE: La mancata degassare il buffer può causare risultati non ottimali quando isolare CD19 + cellule B perché le bolle possono bloccare la colonna di isolamento. </li><li> Preparare 50 ml provette coniche per la centrifugazione in gradiente di densità. Determinare il numero di tubi necessari per l&#39;elaborazione del sangue del cordone ombelicale (1 tubo in grado di elaborare 8 ml di sangue) e aggiungere 15 ml di Ficoll-Paque PLUS ad ogni provetta. </li><li> Diluire 8 ml di sangue di cordone con 24 ml di DPBS (1X) e accuratamente la miscela diluita strato sangue del cordone sopra il Ficoll-Paque PLUS in ciascuno dei 50 ml provette coniche. Non mescolare il sangue e Ficoll-Paque PLUS. IMPORTANTE: Per evitare la miscelazione del sangue del cordone ombelicale e Ficoll-Paque PLUS, tenere il tubo ad angolo di 45 gradi estrato della miscela sangue lentamente. </li><li> Centrifugare a 400 xg per 40 min a 20 ° C. Cellule mononucleate (MNC) rimarrà al plasma-Ficoll-Paque PLUS interfaccia che granulociti ed eritrociti sedimenti grazie alla maggiore densità alla pressione osmotica di Ficoll-Paque PLUS. Etichetta sette 5 ml a fondo tondo tubi da utilizzare nella parte 3 con il campione ID, la data e il seguente: </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Tubo </td><td> Etichetta </td><td> Scopo </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Senza macchia </td><td> Cellule non colorati per la normalizzazione durante citometria a flusso </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7AAD </td><td> Per determinare la vitalità durante la citometria a flusso </td></tr><tr><td> 3 </td><td> + + + </td><td> Contiene le cellule che verrà ordinata </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 34 + </td><td> Per raccogliere CD34 + / CD19 +(Fine pro-B - inizio pre-BI), le cellule </td></tr><tr><td> 5 </td><td> Bassa 45 </td><td> Per raccogliere CD34 - / CD19 + / CD45 bassa (pre-BI), le cellule </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 45 med </td><td> Per raccogliere CD34 - / CD19 + / CD45 med (pre-BII), le cellule </td></tr><tr><td> 7 </td><td> Alta 45 </td><td> Per raccogliere CD34 - / CD19 + / CD45 alta (B) le cellule immature </td></tr></tbody></table> Coat tubi 4, 5, 6, e 7 con 2% FBS e collocare tutte le provette in ghiaccio. <ol start="5"><li> Aspirare lo strato superiore di plasma con attenzione ed evitare il contatto con lo strato di cellule mononucleate. Usando una pipetta di vetro da 10 ml, trasferire accuratamente lo strato di cellule mononucleate a un nuovo tubo da 50 ml. Unire le cellule mononucleate da tre tubi insieme in un unico tubo da 50 ml. </li><li> Riempire il tubo con PBS, mescolare delicatamente e centrifugare a 300 xg per 10 min a20 ° C. Aspirare accuratamente il sopranatante senza disturbare il pellet di cellule. Ripetere 1x. Dopo il primo lavaggio, risospendere il pellet e trasferire in un unico tubo da 50 ml. </li><li> Risospendere delicatamente il pellet di cellule in 200 microlitri di PBS. Rimuovere 1 ml di sospensione cellulare, aggiungere e 1 ml di PBS in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e ritirate conteggio (conteggio celle dopo l&#39;immissione 50 ml di sospensione cellulare nella centrifuga). Riempire la provetta con PBS e centrifugare a 200 xg per 15 minuti per rimuovere le piastrine. Rimuovere il surnatante completamente senza disturbare il pellet. </li></ol> 2. Modificato B-cella di isolamento da cellule mononucleate mediante separazione MACS <ol><li> Risospendere il pellet dal punto 1.7 con 160 microlitri freddo (4 ° C)-EDTA PBS. </li><li> Aggiungere 40 microlitri B-CLL cocktail di anticorpi biotina. Pipettare per amalgamare bene e incubare per 10 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule - aggiungere 1 ml a freddo (4 ° C)-EDTA PBS per 10 milioni di cellule (cellule number determinata nella fase 1.7) e centrifugare a 300 xg per 10 min. Aspirare il supernatante completamente e risospendere il pellet cellulare in 320 microlitri freddo (4 ° C)-EDTA PBS. </li><li> Aggiungere 80 ul anti-biotina microsfere, mescolare bene e incubare per 15 minuti a 4 ° C. </li><li> Lavare le cellule - aggiungere 1 ml a freddo (4 ° C)-EDTA PBS per 10 milioni di cellule e centrifugare a 300 xg per 10 min. Risospendere fino a 100 milioni di cellule in 500 microlitri di freddo (4 ° C)-EDTA PBS. Tampone del volume Scala in base al numero delle cellule. </li><li> Preparare colonne MACS e separatori MACS durante la centrifugazione (fase 2.5). Posizionare una colonna LS nel campo magnetico del separatore MACS, aggiungere 3 ml di freddo (4 ° C)-EDTA PBS sulla colonna e permettono il buffer di gocciolare attraverso la colonna. Utilizzare un contenitore per catturare il flusso attraverso. Eliminare il flusso attraverso. </li><li> Posizionare un tubo da 50 ml sotto la colonna e pipettare la sospensione cellulare sulla colonna. Lasciare le cellule senza etichetta a gocciolare through la colonna e nel tubo da 50 ml. IMPORTANTE: Queste sono le cellule che verranno utilizzate per l&#39;etichettatura degli anticorpi e cell sorting. Non gettare il flusso attraverso. Per recuperare tutte le celle da 2,5 passo, aggiungere un 1 ml di freddo (4 ° C)-EDTA PBS alle pareti del tubo conico. Mescolare delicatamente e pipettare la sospensione rimanente cella sulla colonna. Ripetere 1x. Procedere al passo 2,8 usando le cellule senza etichetta raccolto nel tubo conico dopo il passaggio attraverso la colonna. </li><li> Riempire il tubo conico contenente cellule non marcate con PBS e centrifugare a 300 xg per 10 min. Rimuovere con attenzione il sopranatante senza disturbare il pellet di cellule. Aggiungere 200 pl di tampone PBS-EDTA e Risospendere delicatamente le cellule. </li></ol> 3. Anticorpo etichettatura e la preparazione per la selezione delle cellule <ol><li> Aspirare 1 ml di sospensione cellulare e riporre in provetta &quot;senza macchia&quot; (Passo 1.4). Aggiungere 500 microlitri tampone PBS-EDTA e memorizzare la provetta in ghiaccio. </li><li> Aggiungere 20pl di ciascun anticorpo (CD19, CD34 e CD45) per milione di cellule nella sospensione cellulare rimanente. Mescolare bene e porre il tubo al buio per 30 minuti a RT. Anticorpi CD sono sensibili alla luce, eseguire i passaggi da 2-4 con le luci spente. </li><li> Dopo 30 minuti di incubazione con gli anticorpi, aspirare 40 ml di sospensione cellulare e inserirlo nel tubo etichetta &quot;7AAD&quot;. Aggiungere 1 ml di PBS nella provetta e centrifugare a 500 xg per 2 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 100 pl di tampone di legame. Aggiungere 7 ml di 7AAD (7-Aminoactinomycin D) e incubare al buio per 10 minuti a RT. Durante la fase di incubazione 10 min completa 3,4. </li><li> Aggiungere PBS alla sommità del tubo contenente le cellule rimanenti marcate con anticorpi CD. Centrifugare la provetta a 500 xg per 3 min. Rimuovere il surnatante, aggiungere 500 microlitri EDTA PBS e risospendere il pellet cellulare. Trasferire l&#39;intero volume della sospensione cellulare nella provetta &quot;+ + +&quot;. Per recuperare tutti della sospensione cellulare add un ulteriore 1 ml di EDTA PBS al tubo da 50 ml e il trasferimento nel tubo con &quot;+ + +&quot;. </li><li> Dopo l&#39;incubazione (Passo 3.3), aggiungere 300 microlitri di buffer vincolante nel tubo 7AAD. La &quot;macchia&quot;, &quot;7AAD&quot; e &quot;+ + +&quot; campioni e il &quot;34 +&quot;, &quot;45 basso&quot;, &quot;45 med&quot; e &quot;45&quot; ad alta tubi sono pronti per la citometria a flusso. </li></ol> 4. Di separazione delle cellule utilizzando il flusso MoFlo XDP Citometro <ol><li> Set-up MoFlo per l&#39;ordinamento: Allineare laser; stabilizzare flusso goccia; determinare ritardo goccia. </li><li> Preparare singoli controlli compensazione del colore utilizzando Invitrogen AbC mouse tallone kit (o simile), secondo le istruzioni del produttore. Eseguire controlli a singolo colore, regolando le tensioni dei canali di fluorescenza per la separazione ottimale delle popolazioni positive e negative. Impostare coefficienti di compensazione e di applicare il parametro compensata protocollo di raccolta. Ristabilire coefficienti di compensazione ogni volta che si ottiene un nuovo lotto di anticorpi. </li><li> Creare protocollo incluso il grafico come mostrato in Figura 2. </li><li> Esegui campione senza macchia, impostare la tensione e guadagno per lo scatter in avanti e laterale, e di identificare le popolazioni negative fluorescenza. Poiché recupero del DNA è l&#39;obiettivo del genere, la soglia dovrebbe essere impostata bassa (≤ 1%) in modo che il DNA contenente detriti non contaminare i campioni recuperati. * Verificare che il sistema di evacuazione Aerosol è in esecuzione in ogni momento che vivono le cellule umane sono in corso sul MoFlo. </li><li> Eseguire una piccola aliquota di + + + di esempio (~ 50.000 eventi) per impostare la strategia di gating (Figura 2). Poiché B-cellule progenitori non disperdono in modo identico a maturare cellule B, il backgate ungated CD19 + / CD34 + popolazione sulla trama SSC vs FSC per garantire il gate linfocitario include potenziali Pro-B cellule. Da questo esempio impostare anche la popolazione negativa fluorescenza per 7AAD. </li><li> Eseguire l&#39;esempio 7AAD per determinare la vitalità del campione. Solo le celle di ordinamento di un campione con alta vitalità aldall&#39;inizio (≥ 95%), come le cellule morte si macchia indiscriminatamente e può contaminare le popolazioni di ordinamento. </li><li> Impostare le decisioni in ordine di raccogliere quattro popolazioni: CD19 + / CD34 +, CD19 + / CD34 - / CD45 basso; CD19 + / CD34 - / med CD45 e CD19 + / CD34 - / alta CD45. Includere il linfociti e cancelli discriminazione doppietto nelle decisioni di ordinamento di tutte le popolazioni. </li><li> Per impedire inceppamenti nella punta di ordinamento, filtro + + + campione attraverso un filtro a 40 micron cella immediatamente prima selezione e ri-filtro eventuale aggregazione avviene nel campione durante l&#39;ordinamento. </li><li> Ordinare le cellule in provette di raccolta (Punto 1.4) rivestiti con 2% FBS in PBS in un supporto tubo di raffreddamento o ghiaccio ricco. </li><li> Subito dopo ordinamento è completato, estrarre il DNA. </li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+human+B-cell+precursors.">Fates of human B-cell precursors.</a> Blood. 96 (1), 9-23 (2000).</li><li>Schmid, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+society+for+analytical+cytology+biosafety+standard+for+sorting+of+unfixed+cells.">International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells.</a> Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).</li><li>Malaspina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+of+immature/transitional+B+cells+in+HIV-infected+individuals+with+advanced+disease:+correlation+with+increased+IL-7.">Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7.</a> PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il fattore con il maggiore impatto sul successo del protocollo è la presenza di contaminanti residui. Se la richiesta di sangue da una banca di sangue del cordone è importante avere il sangue spediti appena dopo la raccolta possibile. Inoltre, i campioni che sono classificati come linfocitosi più alto numero di linfociti, tuttavia, questi campioni non hanno un numero sufficiente di cellule B precursori e non deve essere utilizzato. Per aumentare la probabilità di ottenere un numero sufficiente di cellule per ciascuno dei sottoinsiemi precursori si consiglia iniziando con almeno 85 ml di sangue del cordone ombelicale. È importante notare che, a differenza degli adulti separazioni sangue periferico, quando frazionamento cordone ombelicale lo strato mononucleare è spesso contaminata con globuli rossi 12. Questo protocollo include un ulteriore passaggio di lavaggio per rimuovere le piastrine contaminanti. Protocolli che descrivono separazioni mononucleate da sangue del cordone ombelicale suggeriscono di inserire una t fase di lisio rimuovere le indesiderate globuli rossi. Si sconsiglia di questo passo perché produce residui inquinanti e ha un impatto negativo sul successo del genere cella. Al fine di ridurre il numero di cellule che devono essere distinti mediante citometria di flusso è necessario eseguire una B-cell arricchimento prima selezione cellulare. Il protocollo fornito da Miltenyi Biotec, che accompagna il B-Cell Isolation Kit (B-CLL), è stato ottimizzato per il sangue periferico e raccomanda l&#39;utilizzo di 10 microlitri B-CLL cocktail di anticorpi biotina per 10 milioni di cellule. Questo passaggio utilizza anticorpi contro CD2 (cellule T, cellule NK), CD4 (cellule T), CD11b (granulociti, monociti, macrofagi), CD16 (cellule NK, macrofagi, mastociti), CD36 (piastrine), CD235a (cellule eritroidi) ad esaurire non-B cellule del sangue del cordone ombelicale. È importante utilizzare il kit descritto e non le cellule B Kit di isolamento II perché il kit primo contiene un anticorpo contro CD43, presente su cellule pro-B. Durante il nostro optimization di questo protocollo, abbiamo scoperto che un totale di 40 ml di B-CLL cocktail di anticorpi biotina è sufficiente a produrre un risultato positivo sorta cella. Inoltre abbiamo trovato che l&#39;uso di non più di 5 pl più delle B-CLL cocktail di anticorpi biotina ha avuto effetti negativi per l&#39;ordinamento delle cellule. Pertanto, si consiglia di utilizzare 40 ml di B-CLL cocktail di anticorpi biotina per un totale di numero di cellule mononucleate tra 175-250000000. Se si inizia con numeri inferiori o superiori di cellule può essere necessario per scalare i reagenti di conseguenza. Ci sono numerose pubblicazioni contrastanti descrivono i marcatori che possono essere utilizzati per distinguere sottopopolazioni di cellule B. La maggior parte del discrepanza può essere spiegata dal fatto che la differenziazione è un processo continuo e che la presenza o l&#39;assenza di marcatori di superficie cellulare avviene in modo graduale anziché in modo tutto o niente. In questo protocollo CD34 - / CD19 + e il livello di intensità di CD45 + (bassa, espressione media, alta) è stato utilizzato per distinguere pre-BI, pre-BII e immature cellule B con un aumento del livello di espressione di CD45 corrispondente alla progressione della differenziazione 6. Pro-cellule B sono stati descritti da alcuni come CD19 + / CD34 + 13 mentre altri hanno dimostrato che pro-B sono cellule CD19 - / CD34 + e pre-BI cellule CD19 + / CD34 + 9,10. Sulla base di queste discrepanze che hanno designato le CD19 + / CD34 + cellule più tardi pro-cellule B / primi pre-BI cellule. È importante notare che questa strategia è stata sviluppata per isolare sottoinsiemi di precursore cellule B che corrispondono alle cellule colpite dalla malattia leucemia linfoblastica acuta. Tuttavia, ci sono molteplici strategie di ordinamento che possono essere impiegati a seconda del sottotipo cella di interesse. Anticorpo-fluorocromi combinazioni dovrebbero essere scelti in base alle capacità del cell sorter disponibili. Come generil regola, la più brillante fluorocromo nel vostro gruppo dovrebbe essere usato per etichettare l&#39;antigene meno popoloso e viceversa. Nel rilevamento doppio macchiato popolazioni, in particolare gli eventi rari come questi, la discriminazione doppietto (Figura 2B) è una parte di vitale importanza della strategia di gating. Questo assicura che i due eventi positivi sono veramente singole cellule colorate con anticorpi sia e non solo due singole cellule colorate aderenti l&#39;uno all&#39;altro. Ad alta velocità, a 4 vie separazione delle cellule crea necessariamente un ambiente controllato aerosol. Pertanto, dal vivo l&#39;ordinamento delle cellule umane deve essere eseguita con grande cura. Pubblicato le linee guida di sicurezza e di decontaminazione sono disponibili e devono essere verificate e attuate prima del genere 14. Approvazione da comitati istituzionali biosicurezza o loro equivalenti può essere richiesta prima di ordinamento. Per disinfettarli dopo la cernita, candeggina dovrebbe essere aggiunto al contenitore rifiuti ad una concentrazione finale del 10%. Similarly, tutti i tubi di campioni così come tutte le superfici nelle immediate vicinanze devono essere accuratamente decontaminate con una soluzione appena fatto candeggina al 10%. In sintesi, questo protocollo prevede una strategia per ottenere popolazioni rare di precursori delle cellule B e può essere modificato per isolare qualsiasi popolazione rare presenti nel sangue del cordone incluse le cellule staminali ematopoietiche e cellule T immature. Recentemente, cellule B immature sono stati identificati nel sangue periferico di individui con HIV avanzata 15. Pertanto, l&#39;utilità di questo metodo si estende oltre lo studio di tumori del sangue. Infine, non abbiamo ancora eseguito isolamenti RNA sulle celle di flusso ordinati, tuttavia, questo metodo dovrebbe essere adattabile con l&#39;avvertenza che, nel corso di separazione delle cellule le cellule devono essere ordinati direttamente in Trizol o una soluzione equivalente RNA compatibili come RLT dal kit RNeasy disponibile attraverso Qiagen.

Al fine di identificare aberrazioni che sono presenti nella malattia, è di fondamentale importanza che usiamo tessuti sani o cellule che corrispondono al tipo di tessuto o cellule colpite dalla malattia. Una ragione di ciò è che la variazione epigenetica tra tipi di tessuto è responsabile della regolazione dell&#39;espressione genica ed è fondamentale per la differenziazione cellulare durante il normale 1,2 sviluppo umano. Una seconda ragione è che aberrante regolazione genica tessuto specifica può avere conseguenze disastrose sullo sviluppo normale ed è noto per contribuire a una moltitudine di stati patologici tra cui il cancro. Pertanto, una migliore comprensione di una malattia che coinvolge le cellule ematopoietiche richiede la conoscenza delle cellule ematopoietiche sane. Lo sviluppo di cellule ematopoietiche in procede midollo osseo attraverso un ordine sistematico di eventi caratterizzati da cambiamenti nell&#39;espressione di marcatori di superficie cellulare 3. Gli studi che coinvolgono i partecipanti adulti hannodimostrato che il midollo osseo contiene di solito un basso numero di cellule B precursori 4,5; che coinvolgono studi pediatrici partecipanti hanno mostrato che la percentuale di precursore cellule B è relativamente alta in individui meno di 5 anni di età 6. Il sangue del cordone ombelicale viene utilizzato come fonte di cellule staminali ematopoietiche nel trattamento di malattie del sangue e tumori correlati, è disponibile attraverso banche del sangue del cordone e si arricchisce di B e cellule T immature 7, che sono le cellule bersaglio di disturbi multipli compresa leucemia e linfomi. Precursore cellule B nel midollo osseo sono stati ampiamente fenotipizzati 8,9 e può essere definita dalla presenza di marcatori specifici della superficie cellulare che possono essere utilizzati per ordinare queste cellule in sottoinsiemi distinti. Normali cellule B differenziazione procede attraverso una serie di fasi nel midollo osseo a partire con le prime pro-B cellule e che si conclude con immaturi o ingenuo B-cellule. Secondoa van Zelm e colleghi 10, pro-cellule B sono caratterizzate dalla presenza di CD34 e nel passaggio alla fase 2 (Pre-BI) CD19 viene acquisita. Cellule Fase 3 (Pre-BII) non è più espresso CD34 e cominciare a esprimere IgM citoplasmatica. Infine, una caratteristica della fase 4 (immature cellule B) è l&#39;espressione di IgM di superficie. La strategia di ordinamento descritto in questo protocollo è stato descritto da Caldwell e colleghi 6 e include l&#39;uso di marcatori cellulari soli 3 superficie che riduce notevolmente la complessità e il costo di esecuzione di esperimenti selezione cellulare. Nel loro lavoro, una relazione tra CD45 e le fasi di B-differenziazione delle cellule è stato stabilito. Essi hanno osservato che cellule B nel midollo osseo visualizzare diversi livelli di espressione di CD45. Specificamente, le cellule che esprimono alti livelli di CD45 corrispondeva a cellule che esprimono IgM superficie immature (cellule B), quelli che esprime un livello intermedio di CD45 corrispondeva a cellule che esprimevano cytoplasmic IgM (pre-BII cellule), e quelli che esprimono livelli bassi di CD45 corrispondeva a cellule che non esprimono IgM citoplasmatica (pre-cellule BI). Questo protocollo utilizza la strategia sviluppata da Caldwell e colleghi 6 isolare sottoinsiemi di precursori delle cellule B di sangue del cordone ombelicale (Figura 1) che possono essere utilizzati in saggi a valle richiedono elevate qualità acidi nucleici come il CpG metilata-assay isola recupero (MIRA ) 11 e quantitative real time PCR. Il metodo impiega una separazione iniziale con biglie magnetiche ad esaurire tutti i non-B cellule da sangue del cordone ombelicale e richiede solo 3 colorazione con anticorpi (CD34, CD19 e CD45). Le cellule che sono state recuperate rappresentano 4 stadi di B-differenziazione delle cellule: 1) CD34 +, CD19 + (fine) pro-B e l&#39;inizio del pre-BI, 2) CD34 -, CD19 +, CD45 bassa (fine pre-BI); 3) CD34 -, CD19 +, CD45 med (pre-BII) e 4) CD34 -; CD19 +, CD45 alta (immature cellule B).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multi Stand</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-Cell Isolation Kit (B CLL)</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-660</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATLANTA Biologicals</td>
			<td>S11195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 ml)</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>SS1500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559763</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555415</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560941</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347463</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352058</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PuraFlow Sheath Fluid, 8X</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CY30230</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck Alignment beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605359</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Rainbow Alignment beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>URFP-30-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViroSafe Aerosol Evacuation Filter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>ML01330</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Mouse bead kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10344</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &mu;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Scientific Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-516</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>ML99030</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Evacuation Unit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of precursor b-cell subsets from umbilical cord blood

Il sangue del cordone ombelicale è altamente arricchito per le cellule progenitrici ematopoietiche in fasi diverse di impegno lignaggio. Abbiamo sviluppato un protocollo per isolare precursori delle cellule B in quattro diversi stadi di differenziazione. Poiché i geni sono espressi e modificazioni epigenetiche verificarsi in modo tessuto-specifico, è fondamentale per discriminare tra tessuti e tipi di cellule, al fine di essere in grado di identificare le alterazioni nel genoma e dell&#39;epigenoma che può portare allo sviluppo della malattia. Questo metodo può essere adattata a qualsiasi tipo di cellula presente nel sangue del cordone ombelicale in qualsiasi fase di differenziazione. Questo metodo si compone di 4 fasi principali. Primo, le cellule mononucleari sono separate mediante centrifugazione densità. Secondo, le cellule B sono arricchiti con anticorpi coniugati biotina che riconoscono e rimuovere le cellule B non dalle cellule mononucleari. Terzo le cellule B sono fluorescenti marcate con anticorpi di superficie cellulare di proteine ​​specifiche per singole fasidi sviluppo delle cellule B. Infine, le cellule sono ordinati contrassegnati in modo fluorescente e singole popolazioni sono recuperati. Le cellule recuperate sono in quantità e qualità sufficiente per essere utilizzato in saggi di acido nucleico a valle.

Tra campione variazione gioca un ruolo nel successo del genere cella (Tabella 1). I campioni con buone percentuali di successo hanno bassi livelli di contaminazione detriti (Figura 3A) ed i campioni con tassi di successo povere hanno livelli elevati di contaminazione detriti (Figura 3B). Tra campione variazione può essere in qualche modo controllato se il campione di sangue del cordone è stato raccolto entro 24 ore d&#39;imbarco (O / N priorità). Le cellule di flusso filtrate da ciascun sottogruppo dei precursori delle cellule B sono in quantità e qualità sufficienti per eseguire isolamenti di acido nucleico. Il DNA isolato è di alta qualità e può essere utilizzato nelle analisi a valle. Abbiamo regolarmente utilizzare questo DNA in MIRA 11 per arricchire per DNA metilato (Figura 4). <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> Cord Blood Data Facility </td><td> Ordina Scarso </td><td><strong&gt; Ordina Buono </td></tr><tr><td> Il sangue del volume Lavorare con anticoagulante (ml) </td><td> 110 </td><td> 104 </td></tr><tr><td> Globuli bianchi [10 3 / pl] </td><td> 8,68 </td><td> 11,19 </td></tr><tr><td> Linfociti [10 3 / pl] </td><td> 3,88 </td><td> 3,76 </td></tr><tr><td> Linfociti (%) </td><td> 44,70 </td><td> 33,6 </td></tr><tr><td> Globuli rossi [10 6 / ul] </td><td> 3,65 </td><td> 3,05 </td></tr><tr><td colspan="3"> In-house dei dati </td></tr><tr><td> Numero cellulare dopo Ficoll-Paque </td><td> 206 M </td><td> 309 M </td></tr><tr><td> Numero cellulare dopo la separazione MACS </td><td> 22 M </td><td> 16,5 M </td></tr><tr><td> Totale Eventi Count (MoFlo XDP) </td><td> 30,57 M </td><td> 19,97 M </td></tr><tr><td> La vitalità (%) </td><td> 98,00 </td><td> 98,00 </td></tr><tr><td> Le cellule in gate linfocitario (%) </td&gt; <td> 17,00 </td><td> 50,00 </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 + </td></tr><tr><td> Cella Numero totale </td><td> 10959 </td><td> 48316 </td></tr><tr><td> % Degli eventi totali </td><td> 0,04 </td><td> 0,24 </td></tr><tr><td> Efficienza </td><td> 88% </td><td> 88% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / basso CD45 </td></tr><tr><td> Cella Numero totale </td><td> 16619 </td><td> 26941 </td></tr><tr><td> % Degli eventi totali </td><td> 0,05 </td><td> 0,13 </td></tr><tr><td> Efficienza </td><td> 89% </td><td> 87% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 med </td></tr><tr><td> Cella Numero totale </td><td> 469745 </td><td> 507540 </td></tr><tr><td> % Degli eventi totali </td><td> 1,54 </td><td> 2,54 </td></tr><tr><td> Efficienza </td><td> 89% </td><td> 89% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / alta CD45 </td></tr><tr><td> Cella Numero totale </td><td> 1896062 </td><td> 2047142 </td></tr><tr><td> % Degli eventi totali </td><td> 6,2 </td><td> 10,25 </td></tr><tr><td> Efficienza </td><td> 91% </td><td> 90% </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Rappresentante statistiche di ordinamento delle celle. Righe 1-5 sono conteggi forniti dalla struttura di sangue del cordone ombelicale. Le righe rimanenti sono dati raccolti nel nostro laboratorio. L&#39;ordinamento poveri conteneva alti livelli di detriti e una bassa percentuale di cellule nel gate linfocitario. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig1.jpg" /> Figure 1. Diagramma di flusso della procedura. Sangue del cordone ombelicale viene elaborato e cellule mononucleate sono isolate utilizzando Ficoll-Paque plus. Una ulteriore fase di lavaggio è incluso per rimuovere le piastrine contaminanti. Cellule B vengono isolati da cellule mononucleate mediante l&#39;umano MACS cellule B kit di isolamento (B-CLL). Questo passo utilizza anticorpi monoclonali coniugati con biotina (CD2, CD4, CD11b, CD36, anti-IgE e CD235a) per rimuovere tutti i non-B cellule. Le recuperati cellule B sono contrassegnati con CD19-APC, CD34-PE e CD45-FITC anticorpi quindi ordinati utilizzando il flusso MoFlo XDP citometro di recuperare precursori delle cellule B sottoinsiemi: CD19 + / CD34 +, CD19 + / CD34 - / CD45 bassa , CD19 + / CD34 - / med CD45 e CD19 + / CD34 - / alta CD45. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig2.jpg" /> Figura 2. Strategia di gating per l&#39;identificazione e l&#39;ordinamento popmentari. frecce rosse indicano la porta che viene applicato al grafico successivo. Cancelli R4, R5, R6 e R7 indicano popolazioni ordinati. A) Forward scatter plot vs laterale che mostra popolazione linfocitaria arricchito. R1, gate linfocitario. B) Altezza vs larghezza del grafico a dispersione in avanti per identificare singole cellule contro doppiette. R2, porta singola cella. C) CD19-APC cellule positive rientrano nella popolazione CD34-PE negativi e positivi. R3, CD19 + / CD34 - cancello, R4, CD19 + / CD34 + popolazione cancello indica ordinare i canali d) CD19 + / CD34 - le cellule si dividono in tre in qualche modo distinti CD45-FITC popolazioni.. R5 e R6, CD19 + / CD34 - / CD45 e CD19 bassa + / CD34 - / CD45 popolazioni med, rispettivamente. R7, a causa del numero di cellule alte nel CD19 + / CD34 - / CD45 di popolazione, questa porta genere comprende solouna porzione della popolazione. Tutte le cellule di questa popolazione non hanno bisogno di essere raccolti per analisi a valle. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig3.jpg" /> Figura 3. A) Bassi livelli di contaminanti residui dopo arricchimento colonna. R1, gate linfocitario. B) alti livelli di contaminanti residui dopo arricchimento colonna. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig4.jpg" /> Figura 4. Arricchimento di DNA metilato da parti di precursori cellule B. A) DNA sonicato isolato da precursori delle cellule B sottoinsiemi è di alta qualità. Per DNA biblioteca costruzione è sonicata a una media di 200-600 bp. Corsia 1: Promega 100 bp ladder (catalogo # G2101), Corsia 2: DNA totale isolato da CD19 + / CD34 + cellule; Corsia 3: DNA totale isolato da CD19 + </sup&gt; / CD34 - / CD45 delle cellule basse; Lane 4: 100 ng di DNA isolato da CD19 + / CD34 - / CD45 delle cellule med; Lane 5: 100 ng di DNA isolato da CD19 + / CD34 - CD45 / celle ad alta efficienza. DNA è stato sonicato utilizzando il Bioruptor Diagenode in alto per un totale di 9 min (30 sec ON; 30 sec OFF). DNA è stato purificato colonna e visualizzati su un gel di agarosio 1% con SYBR gel verde acido nucleico macchia. B) Dopo MIRA utilizzando il ActivMotif MethylCollector Ultra kit, PCR con SLC25A37 (1-6) e APC1 (7-12) viene effettuata per confermare arricchimento di DNA metilato. 1 e 7: DNA genomico con ultrasuoni (non MIRA), 2 e 8: MIRA-CD19 + / CD34 + DNA, 3 e 9: MIRA-CD19 + / CD34 - DNA / CD45 basso; 4 &amp; 10: MIRA-CD19 + / CD34 - / CD45 med DNA, 5 e 11: MIRA -CD19 + / CD34 - / CD45 DNA alta, 6 e 12: Controllo delle acque. Maggiore amplificazione del SLC25A37 conferma l&#39;arricchimento del DNA metilatonei sottoinsiemi di cellule B precursori.

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Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Qui si descrive un protocollo per isolare sottoinsiemi di precursore cellule B dal sangue del cordone ombelicale. Una sufficiente quantità e qualità di acidi nucleici può essere estratto dalle cellule e utilizzati in saggi successivi utilizzando DNA o RNA.

Isolamento di precursori delle cellule B di sottoinsiemi di sangue del cordone ombelicale

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.9K Views.  University of Missouri-Columbia. Qui si descrive un protocollo per isolare sottoinsiemi di precursore cellule B dal sangue del cordone ombelicale. Una sufficiente quantità e qualità di acidi nucleici può essere estratto dalle cellule e utilizzati in saggi successivi utilizzando DNA o RNA.

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Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

Isolamento di cellule della cavità peritoneale mouse

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required to define their phenotype and effector functions. Histochemical approaches are instrumental to determine the location of the infiltrating cells and to analyze the associated CNS pathology. However, in-situ histochemistry and immunofluorescent staining techniques are limited by the number of antibodies that can be used at a single time to characterize immune cell subtypes in a particular tissue. Therefore, histological approaches in conjunction with immune-phenotyping by flow cytometry are critical to fully characterize the composition of local CNS infiltration. This protocol is based on the separation of CNS cellular suspensions over discontinous percoll gradients. The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for identification of various immune cell populations in a single sample by flow cytometry.

The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for flow cytometric analyses.

Isolamento del cervello e cellule mononucleari del midollo spinale Uso dei gradienti Percoll

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

Espansione linfociti T citotossici da sangue del cordone ombelicale che Target Citomegalovirus, virus di Epstein-Barr virus, e Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

Applicazione clinica della<em&gt; Bella Addormentata</em&gt; Artificiale e cellule presentanti l&#39;antigene per modificare geneticamente le cellule T da sangue del cordone ombelicale e periferico

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, antiherpetic prophylaxis is administrated systematically to pediatric UCBT recipients to prevent complications associated with VZV infection, but there is no strong, evidence based consensus that defines its optimal duration. Because T cell mediated immunity is responsible for the control of VZV infection, assessing the reconstitution of VZV specific T cell responses following UCBT could provide indications as to whether prophylaxis should be maintained or can be discontinued. To this end, a VZV specific gamma interferon (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay was developed to characterize IFN-&#947; production by T lymphocytes in response to in vitro stimulation with irradiated live attenuated VZV vaccine. This assay provides a rapid, reproducible and sensitive measurement of VZV specific cell mediated immunity suitable for monitoring the reconstitution of VZV specific immunity in a clinical setting and assessing immune responsiveness to VZV antigens. &#160;

Development of an IFN-&amp;#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Novel generations of functional assays such as gamma interferon (IFN-&#947;) ELISpot, which detect cytokine production at the single cell level and provide both quantitative and qualitative characterization of T cell responses can be used to assess cell-mediated immune responses directed against varicella zoster virus (VZV).

Sviluppo di un Varicella-Zoster immunità cellulo-mediata specifica-Virus-IFN γ ELISpot test per valutare seguito cordone ombelicale trapianto di sangue

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

Un metodo del rendimento efficiente e di alta per l&#39;isolamento di mouse dendritiche sottopopolazioni cellulari

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

Destrano migliora l'efficienza di trasduzione lentivirale di cellule NK primarie Murine ed umane

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells differentiate to form platelet precursors called megakaryocytes, which terminally differentiate to release platelets from long cytoplasmic processes termed proplatelets. Megakaryocytes are rare cells confined to the bone marrow and are therefore difficult to harvest in sufficient numbers for laboratory use. Efficient production of human megakaryocytes can be achieved in vitro by culturing CD34+ cells under suitable conditions. The protocol detailed here describes isolation of CD34+ cells by magnetic cell sorting from umbilical cord blood samples. The necessary steps to produce highly pure, mature megakaryocytes under serum-free conditions are described. Details of phenotypic analysis of megakaryocyte differentiation and determination of proplatelet formation and platelet production are also provided. Effectors that influence megakaryocyte differentiation and/or proplatelet formation, such as anti-platelet antibodies or thrombopoietin mimetics, can be added to cultured cells to examine biological function.

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

A highly pure population of megakaryocytes can be obtained from cord blood-derived CD34+ cells. A method for CD34+ cell isolation and megakaryocyte differentiation is described here.

La differenziazione dei megacariociti e formazione delle piastrine da umani cavo emoderivati CD34 cellule+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Caratterizzazione dei sottoinsiemi di monociti umani da sangue intero flusso Cytometry analisi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...