Questo lavoro è stato sostenuto dal l&#39;Università di Basilea, Dipartimento di Biomedicina, e il Fondo nazionale svizzero (31003A-116624).

1. Impostazione organotipiche Culture Slice cerebellari Culture fetta cerebellari sono preparati sin dal primo giorno dopo la nascita 8 p (8) cuccioli di topo usando il metodo statico di incubazione 10. Nel nostro laboratorio, usiamo B6CF1 topi. In alcuni esperimenti topi transgenici sono stati usati anche che esprimono EGFP selettivamente nelle cellule di Purkinje. La preparazione delle culture fetta dura circa 30 minuti per il mouse cucciolo, vale a dire 3 ore per una cucciolata di 6 cuccioli di topo. Tutte le fasi vengono eseguite in condizioni sterili in un banco di lavoro a flusso laminare con strumenti chirurgici sterilizzati. <ol><li> Il cervelletto di P8 cuccioli di topo si scolla dal cervello di ghiaccio freddo medio di preparazione (MEM (Gibco Catalog No. 11012) con glutamax 1:100, pH 7,3) utilizzando uno stereomicroscopio. </li><li> Il cervelletto è tagliato in fette 350 micron di spessore con l&#39;orientamento sagittale con un elicottero McIlwain tessuto. </li><li> Le fette sono immessi sul inserti Millipore colture cellulari (approssimativamente 6 slices per inserto, PICM03050 Millipore) e vengono incubati in piastre da 6 pozzetti con 0,75 ml per pozzetto di terreno di incubazione (48,35 ml MEM, 25 ml Medio Aquila, 25 ml di siero di cavallo, 1ml glutamax I, 0,65 ml di glucosio sterile 10% soluzione, pH 7,3) in atmosfera umidificata con 5% di CO 2 a 37 ° C. Tutti i reagenti sono stati coltura tissutale da Gibco, Invitrogen. </li><li> Trattamenti farmacologici in genere vengono avviate a 3 giorni in vitro (DIV3) aggiungendo il farmaco alla concentrazione desiderata al mezzo di coltura. Forbolo 12-miristato 13-acetato (PMA) e (RS) -3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG) erano da Tocris, UK. Poiché molti farmaci richiedono l&#39;uso di DMSO o etanolo per preparare una soluzione madre (ad es PMA) occorre considerare che la quantità totale di solvente aggiunto al mezzo di coltura non supera 1% (7,5 microlitri per pozzetto). I farmaci vengono rinnovati insieme al cambiamento del mezzo di coltura ogni 2 ° o 3 ° giorno. </li></ol> 2. Fissazione e Immunoscontenente di organotipiche Culture Slice cerebellari Un importante vantaggio del cervelletto è che gli anticorpi che specificamente sono disponibili e brillantemente macchiare i neuroni cerebellari principali, cioè cellule di Purkinje e granuli. La morfologia dendritica delle cellule di Purkinje può essere rivelato mediante immunocolorazione con anti-calbindina D28K. <ol><li> Per il fissaggio delle colture, il terreno di coltura viene rimosso e 3 ml di freddo paraformaldeide 4% in tampone fosfato 0,1 M (pH 7,4) vengono aggiunti attentamente per pozzetto contenente l&#39;inserto Millicell con le fettine cerebellari attaccate alla membrana. Culture sono fissati notte, poi il fissativo viene rimosso e le colture sono sciacquate con tampone fosfato. </li><li> Per immunocolorazione gli anticorpi vengono utilizzati i seguenti: coniglio anti-calbindina D-28K (Swant, Bellinzona, Svizzera) a 1:1000 per visualizzare selettivamente le cellule di Purkinje e anticorpo monoclonale anti-neun (Chemicon, Millipore) a 1:500 per visualizzare selettivamente GranuLe 12 celle. Coniglio anti-GFP era da Abcam, Regno Unito. Anticorpi secondari fluorescenti Alexa erano di Molecular Probes, Invitrogen. </li><li> Le colture vengono permeabilizzate e bloccati aggiungendo 3% di siero di capra normale + 0,3% TritonX100 in tampone fosfato 0,1 M (soluzione di blocco). Anti-calbindin D28K e anti-NeuN sono diluiti in soluzione di blocco e le colture vengono incubate con la soluzione bloccante contenente gli anticorpi notte a 4 ° C sotto agitazione leggera. Tutte le diluizioni vengono indicate come% (v / v), Triton X100 è preso da una soluzione stock 10% per facilitare pipettamento. </li><li> Le colture sono sciacquate 3x con tampone fosfato 0,1 M e vengono poi incubate con appropriati anticorpi secondo, per esempio capra anti-coniglio Alexa 568 e di capra anti-topo Alexa 488 diluito 1:500 in tampone fosfato 0,1 M + 0,1% TritonX100 per 2 ore a temperatura ambiente. Le colture vengono quindi risciacquati 3x con tampone fosfato 0.1M. </li><li> Le fette colorate vengono rimossi dalla colturabene con un pennello e sono montati su vetrini SuperFrost Plus e coperti con un mezzo di montaggio appropriata, ad esempio Mowiol. Le colture possono essere visualizzati su un microscopio normale con attrezzature epifluorescenza o con un microscopio confocale. </li></ol> 3. Visualizzazione delle cellule di Purkinje individuali in Culture Slice organotipiche <ol><li> Dopo immunocolorazione con Calbindin D28k il citoplasma completa delle cellule del Purkinje è vivacemente colorato compresi i dendriti e l&#39;assone. Dovuta all&#39;allineamento densa di Purkinje cellule nello strato delle cellule di Purkinje, i pergolati dendritiche della maggior parte delle cellule di Purkinje sono sovrapposte rendendo difficile studiare il pergolato completo di una singola cella. Tuttavia, a causa della morte cellulare di alcune cellule di Purkinje durante il processo di preparazione, in molte culture alcune zone sono presenti con una ridotta densità di cellule di Purkinje. In tali aree si possono trovare cellule di Purkinje con un pergolato dendritica completo che non si sovrappongono con altri cells. In queste cellule, la pergola dendritico possono essere visualizzati e analizzati in qualità comparabile a una colorazione di Golgi. Perché nel cervelletto le cellule di Purkinje sono il tipo cellulare solo esprimendo Calbindin D28K le celle sono anche identificate come cellule di Purkinje. </li><li> Un metodo alternativo è quello di utilizzare colture derivate da B6; FVB-Tg (Pcp2-EGFP) 146.244Yuza / J mice (qui chiamato Pcp2-EGFP topi, disponibile da Jackson laboratori) che esprimono EGFP sotto la cellula di Purkinje promotore specifico L7 11. Nelle culture fetta di vita tali cellule di Purkinje può essere visualizzato espressione di EGFP. È anche possibile seguire la morfologia dendritica di una singola cella nel tempo. In alternativa, dopo la fissazione, che esprimono EGFP-cellule di Purkinje può essere immunostained con un anticorpo anti-GFP. Entrambi i metodi sono adatti per la colorazione, dendriti e degli assoni corpi cellulari di cellule di Purkinje nel colture organotipiche. Poiché il promotore L7 nei Pcp2-EGFP topi non è espresso in tutte le cellule di Purkinje e ci sono variations nella frequenza di esprimere cellule di Purkinje tra topo (Kapfhammer, dati non mostrati) fetta colture derivate da questi topi rendere più facile visualizzare e misurare le cellule di Purkinje che hanno gli alberi dendritiche che si sovrappongono ad altri alberi dendritiche delle cellule di Purkinje. Tali alberi dendritiche possono essere viste individualmente quando le cellule di Purkinje vicini con sovrapposizione alberi dendritiche non esprimono GFP (Figura 1A, B). </li></ol> 4. Misurazione della Dimensione cella albero dendritiche Purkinje e punti di diramazione <ol><li> Albero di dimensioni dendritiche. Con la marcatura fluorescente di cellule di Purkinje la dimensione dell&#39;albero dendritico di una data cellula può essere facilmente misurata se l&#39;albero non si sovrappone con altre cellule. Poiché le etichette Calbindin immunostaining tutte le cellule di Purkinje, può essere difficile identificare con cellule non sovrapposte alberi dendritiche. In questo caso l&#39;uso del Pcp2-EGFP è raccomandato per semplificare l&#39;identificazione di cellule di Purkinje sufficientes con non sovrapposti alberi dendritiche. Una volta che una cellula di Purkinje con un non-sovrapposizione albero dendritico viene identificato, viene visualizzato con la lente 20x e un&#39;immagine viene registrata con una fotocamera digitale. L&#39;immagine può quindi essere analizzati con un programma di analisi di immagine. Usiamo Image Pro Plus, che permette di delineare la struttura dendritica della cellula con un solo clic del mouse con lo strumento bacchetta magica nel modo di misura (Figura 2A). Il programma calcola quindi l&#39;area coperta dalla dell&#39;albero dendritico e lo esporta in MS Excel. L&#39;analisi statistica dei dati è effettuata con il software GraphPad Prism (vedi sotto). </li><li> Numero di punti di ramificazione. A causa della morfologia altamente ramificata e fine dei punti di albero di Purkinje cellule dendritiche ramo devono essere contati manualmente. Il 20x file di immagine delle cellule di Purkinje è ingrandita in modo tale che copre la maggior parte dello schermo utilizzando Adobe Photoshop. Allora ogni punto di diramazione viene contato e contrassegnato con un puntino luminoso (Figura 2B). </li></ol> Monitorare lo sviluppo dell&#39;albero dendritico delle cellule di Purkinje durante il periodo di coltura Culture fetta organotipiche derivate da Pcp2-EGFP topi che esprimono EGFP specificamente in cellule di Purkinje permettono di studiare la morfologia delle singole cellule per parecchi giorni in coltura. In questo modo la crescita e lo sviluppo dell&#39;albero dendritico durante il periodo di coltura può essere ben documentato. Living celle identificate Purkinje sono stati fotografati ogni 2 ° o 3 ° giorno durante il periodo di coltura con l&#39;obiettivo 10x. Questo obiettivo a basso è stato scelto al fine di evitare e ridurre al minimo i danni fototossica per le cellule a causa della illuminazione con luce fluorescente. Figura 3 mostra due esempi di cellule di Purkinje fotografati nelle culture viventi. La prima cella è stata seguita da 2 giorni in vitro fino a 7 giorni in vitro (Figura 3, AC). È evidente che il dendritialbero c di questo cellulare durante questo periodo di tempo si sviluppa diverse nuove filiali e si espande in dimensioni. Nel secondo esempio, una cellula di Purkinje venne seguito da 4 a 11 giorni in vitro (Figura 3, DF). L&#39;albero dendritico piccolo presente a DIV4 espande notevolmente durante questo periodo di tempo. Entrambi gli esempi mostrano che la maggior parte dell&#39;albero dendritico delle cellule di Purkinje presentare alla fine del periodo di coltura ha effettivamente sviluppano nella cultura. Sviluppo della struttura ad albero di Purkinje cellule dendritiche è inibita da PKC o mGluR1 stimolazione Organotipiche culture fetta cerebellari sono state coltivate per 11 giorni. Partendo dal giorno 2 ° in vitro, alcune delle colture sono stati trattati con PMA (50 nM), un estere del forbolo stimolare PKC o DHPG (10 pM), un agonista mGluR1, fino a quando le colture sono state fissate. Entrambi i composti sono stati precedentemente dimostrato di inibire la crescita cellulare e limitare Purkinje dendritica 7, 8, 9, 5.Nel controllo non trattato fette cellule di Purkinje sviluppato un tipico grande albero e altamente ramificato dendritica che è stata visualizzata mediante anti-Calbindin immunostaining (Figura 4A) o in colture con cellule che esprimono EGFP Purkinje, mediante immunocolorazione con anti-GFP (Figura 4D). In colture trattate con PMA la morfologia dell&#39;albero dendritico profondamente rimaneggiato. I dendriti apparso ispessita e aveva solo pochi rami laterali corti. Cellule di Purkinje molti, a differenza nelle colture di controllo, non erano più unipolare, con un dendrite primaria proveniente dal corpo cellulare, ma sviluppato due o anche più dendriti primarie (Figura 4B, E). Il territorio interessato dai dell&#39;albero dendritico è stato notevolmente ridotto (vedi sotto). Una situazione simile era presente in DHPG trattati culture. L&#39;albero dendritico delle cellule di Purkinje stata notevolmente ridotte e la ramificazione era marcatamente ridotta (Figura 4C, F). Tuttavia, ci sono stati anche alcuni qualitative differenze rispetto al PMA trattati culture. Non c&#39;era ispessimento dei rami dendritici, e dendriti primarie effettuati molti dendriti molto brevi secondari (Figura 4C, F), suggerendo che gli eventi di segnalazione in corso in PMA e DHPG cellule trattate Purkinje possono essere simili, ma non identici. Valutazione quantitativa della dimensione cellulare dell&#39;albero dendritico Purkinje e punti di diramazione per la valutazione quantitativa, la dimensione dell&#39;albero dendritico delle cellule di Purkinje e il numero di punti di ramificazione per cella Purkinje è misurata come descritto sopra. Risultati di almeno tre esperimenti indipendenti sono raggruppate, e un minimo di 20 celle devono essere analizzati. La media della superficie coperta dagli alberi dendritiche per gli esperimenti di controllo viene determinata e impostata come 100%, ed i valori per gli altri esperimenti sono espressi come valori percentuali di conseguenza. L&#39;analisi statistica dei dati è effettuata con il software GraphPad Prism. Perché non lo facciamoassumere che tutti i valori determinati sono parte di una distribuzione gaussiana, usiamo test statistici che non assumono una tale distribuzione dei valori misurati. Per confrontare più condizioni e test per la significatività statistica, usiamo Kruskal-Wallis seguito da una procedura adeguata per il test post hoc per rango statistiche basate, come, ad esempio, realizzato in post-test del Dunn in Prism GraphPad. I risultati sono in genere presentati come grafici a barre. Un esempio di una tale valutazione statistica è data in Figura 5. Sia l&#39;analisi delle dimensioni dell&#39;albero dendritico (Figura 5A) e il numero di punti di ramificazione per cella Purkinje (Figura 5B) mostrano chiare differenze tra la condizione di controllo e trattamento DHPG o PMA. Entrambi i parametri erano differenti con una significatività statistica di p &lt;0,001 secondo il test di Kruskal-Wallis. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig1.jpg" /> Figure 1. EGFP marcato delle cellule di Purkinje. In Pcp2-EGFP topi non tutte le cellule di Purkinje esprimono EGFP. Pertanto, alberi dendritiche di alcune cellule di Purkinje possono essere viste individualmente quando esprimono EGFP (EGFP canale in A) e le cellule di Purkinje confinanti con sovrapposti alberi dendritiche non (negativo nel canale EGFP mostrato in A, positivo anti-Calbindin colorazione mostrato nel canale rosso in B). Barra della scala = 50 micron. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig2.jpg" /> Figura 2. Misurazione di parametri dendritiche delle cellule di Purkinje. (A). La dimensione dell&#39;albero dendritico può essere facilmente misurata tracciando il contorno della cellula di Purkinje con un singolo click del mouse nella Pro Immagine software di analisi più con lo strumento bacchetta magica. Lo strumento bacchetta magica viene utilizzata in modo tale che l&#39;albero dendritico intero compreso il soma cellulare e tutti i rami dendritici sono completamente circondata dalla linea. (B). Il numero di punti di ramificazione è counted manualmente in immagini di cellule di Purkinje. Ogni punto di diramazione è contrassegnata da un punto giallo. Barra della scala = 50 micron. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig3.jpg" /> Figura 3. Controllo sviluppo dell&#39;albero Purkinje cellule dendritiche. Identificati Purkinje cellule sono state fotografate ripetutamente per monitorare la crescita dell&#39;albero dendritico. (AC): albero dendritiche di una cellula di Purkinje cresce e si sviluppa di giorno in vitro (DIV) 2 fino DIV7. Vi è una crescita continua e la ramificazione dei dendriti durante questo periodo la cultura. (DF): albero dendritiche di una cellula di Purkinje cresce e si sviluppa da DIV4 fino DIV11. L&#39;albero dendritico si espande notevolmente in questo periodo la cultura. Barra della scala = 50 micron. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig4.jpg" /> Figura 4. Sviluppo della struttura ad albero di Purkinje cellule dendritiche è inibita da PKC o mGluR1 stimulatia (A), (D):. cellule di controllo non trattate con un albero dendritico ben sviluppato. (B), (E): Dopo 9 giorni di trattamento con PMA dendriti appare ispessita e dell&#39;albero dendritico è molto ridotto in dimensioni. Le cellule spesso perdono la loro polarizzazione e diventare bipolare (E). (C), (F): Dopo 9 giorni di trattamento DHPG dell&#39;albero dendritico è molto ridotte. Differenza nel trattamento PMA, molti rami laterali molto sottili e corti sono presenti sui dendriti primarie e secondarie. Cellule spesso perdono la loro polarizzazione e diventare bipolare (F). Cellule di Purkinje sono stati visualizzati da anti-Calbindin immunocolorazione in (A - C) e da EGFP-espressione in colture derivate da Pcp2-EGFP topi in (D - F). Barra della scala = 50 micron. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3637/3637fig5.jpg" /> Figura 5. Valutazione quantitativa delle dimensioni cellulari albero dendritiche Purkinje e la ramificazione. Misurazioni quantitative mostrano che sia la dimensione dell&#39;albero dendritico (grafico a barre in alto) e il number di nodi (grafico a barre inferiore) vengono notevolmente ridotti dopo il trattamento PMA o DHPG. Le differenze tra gli alberi dendritiche di controllo e alberi dendritiche delle cellule di Purkinje da colture trattate sono state significative con p &lt;0,001.

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	<li>Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+of+TrkB+for+synapse+elimination+in+developing+cerebellar+Purkinje+cells.">Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells.</a> Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).</li><li>Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retinoid-related+orphan+receptor+alpha+controls+the+early+steps+of+Purkinje+cell+dendritic+differentiation.">Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation.</a> J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).</li><li>Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+control+of+dendritic+growth+and+development+of+cerebellar+Purkinje+cells.">Cellular and molecular control of dendritic growth and development of cerebellar Purkinje cells.</a> Prog. Histochem. Cytochem. 39, 131-182 (2004).</li><li>Kapfhammer, L. C., Doering, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+slice+cultures.">Cerebellar slice cultures.</a> Protocols for Neural cell culture. , 285-298 (2010).</li><li>Gugger, O. S., Kapfhammer, J. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+C+activity+modulates+dendritic+differentiation+of+rat+Purkinje+cells+in+cerebellar+slice+cultures.">Protein kinase C activity modulates dendritic differentiation of rat Purkinje cells in cerebellar slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 12, 1993-2005 (2000).</li><li>Schrenk, K., Kapfhammer, J. P., Metzger, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+dendritic+development+of+cerebellar+Purkinje+cells+in+slice+cultures+from+protein+kinase+C?-deficient+mice.">Altered dendritic development of cerebellar Purkinje cells in slice cultures from protein kinase C?-deficient mice.</a> Neuroscience. 110, 675-689 (2002).</li><li>Sirzen-Zelenskaya, A., Zeyse, J., Kapfhammer, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+class+I+metabotropic+glutamate+receptors+limits+dendritic+growth+of+Purkinje+cells+in+organotypic+slice+cultures.">Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures.</a> Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Purkinje+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting+from+transgenic+mice+that+express+green+fluorescent+protein.">Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein.</a> Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).</li><li>Weyer, A., Schilling, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+and+cell+type-specific+expression+of+the+neuronal+marker+NeuN+in+the+murine+cerebellum.">Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum.</a> J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).</li></ol>

Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti in conformità alla Direttiva Europea Comunità del Consiglio, del 24 novembre 1986 (86/609/CEE) e sono stati rivisti e consentito dalle autorità svizzere. Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I metodi qui presentati permettono di studiare lo sviluppo delle cellule di Purkinje dendritiche in colture organotipiche cerebellari fetta e valutare quantitativamente espansione Purkinje cellule dendritiche misurando dimensioni dendritiche albero e il numero di punti di ramificazione dendritiche. Naturalmente, un&#39;analisi più ampia e sofisticata quantitativa dei dendriti delle cellule di Purkinje è possibile, ad esempio determinando lunghezza totale dendritiche, l&#39;esecuzione di un&#39;analisi Sholl o determin...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti (opzionale) </td></tr><tr><td> Inserti di coltura </td><td> Millipore </td><td> PICM 03050 PICM ORG50 </td><td> I PICMORG50 inserti hanno un bordo basso e consentire la visualizzazione di fermenti vivi al microscopio </td></tr><tr><td> MEM </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 11012044 </td><td></td></tr><tr><td> Glutamax 1 </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 35050038 </td><td></td></tr><tr><td> Basale Medum Aquila </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 41010026 </td><td></td></tr><tr><td> Siero di cavallo </td><td> Gibco, Invitrogen </td><td> 26050070 </td><td></td></tr><tr><td> Forbolo 12-myristaTE 13-acetato (PMA) </td><td> Tocris </td><td> 1201 </td><td></td></tr><tr><td> (RS) -3,5-diidrossi-fenilglicina (DHPG) </td><td> Tocris </td><td> 0342 </td><td></td></tr><tr><td> Coniglio anti-calbindina D-28K </td><td> Swant </td><td> CB38 </td><td></td></tr><tr><td> Anti NeuN, clone A60 </td><td> Chemicon, Millipore </td><td> MAB377 </td><td></td></tr><tr><td> Coniglio anti-GFP </td><td> Abcam </td><td> Ab290 </td><td></td></tr></tbody></table>

the analysis of purkinje cell dendritic morphology in organotypic slice cultures

Cellule di Purkinje sono un sistema modello attraente per studiare lo sviluppo dendritico, perché hanno un albero impressionante dendritica strettamente orientato nel piano sagittale e si sviluppa prevalentemente nel periodo postnatale nei piccoli roditori 3. Inoltre, gli anticorpi sono disponibili diverse etichette che le cellule di Purkinje selettivamente e intensamente tra cui tutti i processi, con anti-Calbindin D28K essere il più utilizzato. Per la visualizzazione dei dendriti nelle cellule viventi, topi che esprimono EGFP selettivamente nelle cellule di Purkinje 11 sono disponibili attraverso laboratori Jackson. Organotipiche cerebellari culture fetta cellule permettono con facilità di manipolazione sperimentale di sviluppo dendritiche delle cellule di Purkinje perché la maggior parte dell&#39;espansione dendritica della struttura dendritica delle cellule di Purkinje è effettivamente in atto durante il periodo di coltura 4. Vi presentiamo qui una breve, protocollo affidabile e semplice per la visualizzazione e l&#39;analisi della morfologia dendritica delle cellule del Purkinje coltivate in organotypic culture fetta cerebellari. Per molti scopi, una valutazione quantitativa dell&#39;albero dendritico delle cellule di Purkinje è auspicabile. Ci concentriamo qui su due parametri, le dimensioni dell&#39;albero dendritico e numeri in virgola filiali, che possono essere rapidamente e facilmente determinabili da colture tinte anti-calbindina fetta cerebellari. Questi due parametri danno una misura affidabile e sensibile dei cambiamenti della struttura di Purkinje cellule dendritiche. Utilizzando l&#39;esempio di trattamenti con la proteina chinasi C (PKC) attivatore PMA e il recettore metabotropici del glutammato 1 (mGluR1) si dimostra come le differenze nello sviluppo dendritico sono visualizzati e valutati quantitativamente. La combinazione della presenza di un albero dendritico ampio, metodi immunostaining selettivi ed intenso, culture fetta organotipiche che coprono il periodo di crescita dendritica e un modello di topo con cellule EGFP Purkinje espressione specifica marca cellule di Purkinje un sistema modello potente per rivelare i meccanismi di dendritico sviluppo.

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The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Presentiamo un protocollo che permette di visualizzare e valutare quantitativamente la morfologia dell&#39;albero dendritico delle cellule di Purkinje singole coltivate in culture fetta organotipiche cerebellari. Questo protocollo ha lo scopo di promuovere gli studi sui meccanismi di sviluppo dendritiche delle cellule di Purkinje.

L&#39;analisi di morfologia dendritica delle cellule di Purkinje in Culture Slice organotipiche

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

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18.4K Views.  University of Basel. Presentiamo un protocollo che permette di visualizzare e valutare quantitativamente la morfologia dell'albero dendritico delle cellule di Purkinje singole coltivate in culture fetta organotipiche cerebellari. Questo protocollo ha lo scopo di promuovere gli studi sui meccanismi di sviluppo dendritiche delle cellule di Purkinje.

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Automated Sholl Analysis of Digitized Neuronal Morphology at Multiple Scales

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3. Specifically, it affects the ability of neurons to receive inputs from other cells2 and contributes to the propagation of action potentials4,5. The morphology of the neurites also affects how information is processed. The diversity of dendrite morphologies facilitate local and long range signaling and allow individual neurons or groups of neurons to carry out specialized functions within the neuronal network6,7. Alterations in dendrite morphology, including fragmentation of dendrites and changes in branching patterns, have been observed in a number of disease states, including Alzheimer's disease8, schizophrenia9,10, and mental retardation11. The ability to both understand the factors that shape dendrite morphologies and to identify changes in dendrite morphologies is essential in the understanding of nervous system function and dysfunction.
Neurite morphology is often analyzed by Sholl analysis and by counting the number of neurites and the number of branch tips. This analysis is generally applied to dendrites, but it can also be applied to axons. Performing this analysis by hand is both time consuming and inevitably introduces variability due to experimenter bias and inconsistency. The Bonfire program is a semi-automated approach to the analysis of dendrite and axon morphology that builds upon available open-source morphological analysis tools. Our program enables the detection of local changes in dendrite and axon branching behaviors by performing Sholl analysis on subregions of the neuritic arbor. For example, Sholl analysis is performed on both the neuron as a whole as well as on each subset of processes (primary, secondary, terminal, root, etc.) Dendrite and axon patterning is influenced by a number of intracellular and extracellular factors, many acting locally. Thus, the resulting arbor morphology is a result of specific processes acting on specific neurites, making it necessary to perform morphological analysis on a smaller scale in order to observe these local variations12.
The Bonfire program requires the use of two open-source analysis tools, the NeuronJ plugin to ImageJ and NeuronStudio. Neurons are traced in ImageJ, and NeuronStudio is used to define the connectivity between neurites. Bonfire contains a number of custom scripts written in MATLAB (MathWorks) that are used to convert the data into the appropriate format for further analysis, check for user errors, and ultimately perform Sholl analysis. Finally, data are exported into Excel for statistical analysis. A flow chart of the Bonfire program is shown in Figure 1.

We have developed a computer program to analyze neuronal morphology. In combination with two existing open source analysis tools, our program performs Sholl analysis and determines the number of neurites, branch points, and neurite tips. The analyses are performed so that local changes in neurite morphology can be observed.

Analisi automatizzata Sholl di Digitized morfologia neuronale a scale multiple

Neuronal morphology plays a significant role in determining how neurons function and communicate1-3.  Specifically, it affects the ability of neurons to ...

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Neuroscienze

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the strength of their connections after brief periods of strong activation. This phenomenon, known as long-term potentiation (LTP) can last for hours or days and has become the best candidate mechanism for learning and memory 2. In addition, the well defined anatomy and connectivity of the hippocampus 3 has made it a classical model system to study synaptic transmission and synaptic plasticity4.
As our understanding of the physiology of hippocampal synapses grew and molecular players became identified, a need to manipulate synaptic proteins became imperative. Organotypic hippocampal cultures offer the possibility for easy gene manipulation and precise pharmacological intervention but maintain synaptic organization that is critical to understanding synapse function in a more naturalistic context than routine culture dissociated neurons methods.
Here we present a method to prepare and culture hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. This method allows easy access to the slices for genetic manipulation using different approaches like viral infection 5,6 or biolistics 7. In addition, slices can be easily recovered for biochemical assays 8, or transferred to microscopes for imaging 9 or electrophysiological experiments 10.

We describe a method to prepare organotypic hippocampal slices that can be easily adapted to other brain regions. Brain slices are laid on porous membranes and culture media is allowed to form an interface. This method preserves the gross architecture of the hippocampus for up to 2 weeks in culture.

Organotipica Culture Slice ippocampale

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Organotipica Culture cerebellare: sfide apoptotiche e rilevamento

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex. Because of the lack of specific pharmacological agents for these channels, we have taken a genetic approach to manipulating channel expression. We use an organotypic culture preparation (16) in order to maintain cell morphology and the laminar pattern of cortex. We typically isolate acute neocortical slices at postnatal days 8-10 and maintain the slices in culture for 3-7 days. This allows us to study neurons at a similar age to those in our work with acute slices and minimizes the development of exuberant excitatory connections in the slice. We record from visually-identified pyramidal neurons in layers II/III or V using infrared illumination (IR-) and differential interference contrast microscopy (DIC) with whole cell patch clamp in current- or voltage-clamp. We use biolistic (Gene gun) transfection of wild type or mutant potassium channel DNA to manipulate expression of the channels to study their function. The transfected cells are easily identified by epifluorescence microscopy after co-transfection with cDNA for green fluorescent protein (GFP). We compare recordings of transfected cells to adjacent, untransfected neurons in the same layer from the same slice.

This is a protocol to prepare and maintain a neocortical slice preparation in organotypic culture for the purpose of making electrical recordings from pyramidal neurons.

Registrazione intera cella da un Preparazione Tagliare organotipica della neocorteccia

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

Analisi di Morfologia spine dendritiche in colture di neuroni del SNC

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

The mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due to the abundance of molecular and genetic data. However, the developing mouse brain is not suitable for easy manipulation and imaging in vivo since the mouse embryo is inaccessible and opaque. Organotypic slice cultures of embryonic brains are therefore widely used to study murine brain development in vitro. Ex-vivo manipulation or the use of transgenic mice allows the modification of gene expression so that subpopulations of neuronal or glial cells can be labeled with fluorescent proteins. The behavior of labeled cells can then be observed using time-lapse imaging. Time-lapse imaging has been particularly successful for studying cell behaviors that underlie the development of the cerebral cortex at late embryonic stages 1-2. Embryonic organotypic slice culture systems in brain regions outside of the forebrain are less well established. Therefore, the wealth of time-lapse imaging data describing neuronal cell migration is restricted to the forebrain 3,4. It is still not known, whether the principles discovered for the dorsal brain hold true for ventral brain areas. In the ventral brain, neurons are organized in neuronal clusters rather than layers and they often have to undergo complicated migratory trajectories to reach their final position. The ventral midbrain is not only a good model system for ventral brain development, but also contains neuronal populations such as dopaminergic neurons that are relevant in disease processes. While the function and degeneration of dopaminergic neurons has been investigated in great detail in the adult and ageing brain, little is known about the behavior of these neurons during their differentiation and migration phase 5. We describe here the generation of slice cultures from the embryonic day (E) 12.5 mouse ventral midbrain. These slice cultures are potentially suitable for monitoring dopaminergic neuron development over several days in vitro. We highlight the critical steps in generating brain slices at these early stages of embryonic development and discuss the conditions necessary for maintaining normal development of dopaminergic neurons in vitro. We also present results from time lapse imaging experiments. In these experiments, ventral midbrain precursors (including dopaminergic precursors) and their descendants were labeled in a mosaic manner using a Cre/loxP based inducible fate mapping system 6.

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

A method to generate organotypic slices from the E12.5 murine embryonic midbrain is described. The organotypic slice cultures can be used to observe the behavior of dopaminergic neurons or other ventral midbrain neurons.

Culture Slice organotipica del mesencefalo ventrale embrionali: un sistema per studiare dopaminergici sviluppo neuronale In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

Post-embedding Immunogold Labeling of Synaptic Proteins in Hippocampal Slice Cultures

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as colloidal gold can reveal the localization and distribution of specific antigens in various tissues1. The two most widely used techniques are pre-embedding and post-embedding techniques. In pre-embedding immunogold-electron microscopy (EM) techniques, the tissue must be permeabilized to allow antibody penetration before it is embedded. These techniques are ideal for preserving structures but poor penetration of the antibody (often only the first few micrometers) is a considerable drawback2. The post-embedding labeling methods can avoid this problem because labeling takes place on sections of fixed tissues where antigens are more easily accessible. Over the years, a number of modifications have improved the post-embedding methods to enhance immunoreactivity and to preserve ultrastructure3-5.
Tissue fixation is a crucial part of EM studies. Fixatives chemically crosslink the macromolecules to lock the tissue structures in place. The choice of fixative affects not only structural preservation but also antigenicity and contrast. Osmium tetroxide (OsO4), formaldehyde, and glutaraldehyde have been the standard fixatives for decades, including for central nervous system (CNS) tissues that are especially prone to structural damage during chemical and physical processing. Unfortunately, OsO4 is highly reactive and has been shown to mask antigens6, resulting in poor and insufficient labeling. Alternative approaches to avoid chemical fixation include freezing the tissues. But these techniques are difficult to perform and require expensive instrumentation. To address some of these problems and to improve CNS tissue labeling, Phend et al. replaced OsO4 with uranyl acetate (UA) and tannic acid (TA), and successfully introduced additional modifications to improve the sensitivity of antigen detection and structural preservation in brain and spinal cord tissues7. We have adopted this osmium-free post-embedding method to rat brain tissue and optimized the immunogold labeling technique to detect and study synaptic proteins.
We present here a method to determine the ultrastructural localization of synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons. We use organotypic hippocampal cultured slices. These slices maintain the trisynaptic circuitry of the hippocampus, and thus are especially useful for studying synaptic plasticity, a mechanism widely thought to underlie learning and memory. Organotypic hippocampal slices from postnatal day 5 and 6 mouse/rat pups can be prepared as described previously8, and are especially useful to acutely knockdown or overexpress exogenous proteins. We have previously used this protocol to characterize neurogranin (Ng), a neuron-specific protein with a critical role in regulating synaptic function8,9 . We have also used it to characterize the ultrastructural localization of calmodulin (CaM) and Ca2+/CaM-dependent protein kinase II (CaMKII)10. As illustrated in the results, this protocol allows good ultrastructural preservation of dendritic spines and efficient labeling of Ng to help characterize its distribution in the spine8. Furthermore, the procedure described here can have wide applicability in studying many other proteins involved in neuronal functions.

The localization and distribution of proteins provide important information for understanding their cellular functions. The superior spatial resolution of electron microscopy (EM) can be used to determine the subcellular localization of a given antigen following immunohistochemistry. For tissues of the central nervous system (CNS), preserving structural integrity while maintaining antigenicity has been especially difficult in EM studies. Here, we adopt a procedure that has been used to preserve structures and antigens in the CNS to study and characterize synaptic proteins in rat hippocampal CA1 pyramidal neurons.

Post-embedding Etichettatura immuno di proteine ​​sinaptiche in Culture Slice ippocampali

Immunoelectron microscopy is a powerful tool to study biological molecules at the subcellular level. Antibodies coupled to electron-dense markers such as ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Culture Organotipica Slice per studiare Oligodendrocyte Dynamics e mielinizzazione

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional deficits in the affected patients. Despite intensive research efforts, there is still no effective treatment option available that reduces neuronal injury and protects neurons in the ischemic areas from delayed secondary death. Research in this area typically involves the use of elaborate and problematic animal models. Entorhino-hippocampal organotypic slice cultures challenged with oxygen and glucose deprivation (OGD) are established in&#160;vitro models which mimic cerebral ischemia. The novel aspect of this study is that changes of the brain blood vessels are studied in addition to neuronal changes and the reaction of both the neuronal compartment and the vascular compartment can be compared and correlated. The methods presented in this protocol substantially broaden the potential applications of the organotypic slice culture approach. The induction of OGD or hypoxia alone can be applied by rather simple means in organotypic slice cultures and leads to reliable and reproducible damage in the neural tissue. This is in stark contrast to the complicated and problematic animal experiments inducing stroke and ischemia in vivo. By broadening the analysis to include the study of the reaction of the vasculature could provide new ways on how to preserve and restore brain functions. The slice culture approach presented here might develop into an attractive and important tool for the study of ischemic brain injury and might be useful for testing potential therapeutic measures aimed at neuroprotection.

A protocol for entorhino-hippocampal organotypic slice cultures, which allows reproducing many aspects of ischemic brain injury, is presented. By studying changes of the neurovasculature in addition to changes in the neurons, this protocol is a versatile tool to study plastic changes in neural tissue after injury.

L&#39;analisi di neurovascolare ritocca in Entorhino-ippocampali Culture Organotipica Slice

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.