L'obiettivo generale di questa procedura è preparare fette acute sane dalla regione intermedia dorsale dell'ippocampo per registrazioni a lungo termine e ricostruzione di neuroni nei topi adulti. Molti laboratori come il nostro, studiando l'ippocampo dorsale per il suo ruolo nell'apprendimento speciale e nella navigazione. Le tecniche comuni utilizzate a questo scopo sono esperimenti comportamentali, tracciamento anatomico e manipolazioni specifiche regionali.
Abbiamo sviluppato un metodo di affezione cerebrale per combinare l'elettrofisiologia con queste tecniche per consentire la correlazione diretta degli invivodati all'interno delle registrazioni video. Il vantaggio di questo protocollo è che combina una semplice procedura per ottenere fette trasversali con l'uso di soluzioni protettive per migliorare la vitalità del tessuto cerebrale. Questo approccio è particolarmente adatto quando gli animali maturi vengono utilizzati come negli esperimenti comportamentali.
Per iniziare questa procedura, preparare accanto al lavandino l'attrezzatura necessaria per questa sezione. Preparare sul ghiaccio un bicchiere da 150 millilitri e due piastre di Petri in vetro di 10 centimetri di diametro ciascuna. Disegnare tre parti delle linee fino a quando il fondo di una piastra di Petri di plastica e posizionare questo piatto vicino al vassoio di ghiaccio.
Avrai anche bisogno di colla e del porta campioni per il vibratomo. Quindi equipaggia il banco di chirurgia con grandi forbici, piccole forbici, pinzette a punta arrotondata, pinzette a punta fine, una sottile spatola metallica, una grande spatola metallica e pipette di trasferimento. Sbucciare le piastre di Petri con una soluzione di taglio.
Un piatto per eseguire la dissezione della testa e l'altro per la dissezione del cervello. In quest'ultimo, posizionare anche un pezzo di carta da filtro. Riempire anche il becher con una soluzione di taglio da 30 millilitri.
Ciò sarà necessario per la perfusione trascardica. Riempire il vassoio del vibratomo con una soluzione di taglio a freddo ghiacciato e mantenere tutta la soluzione ossigenata con un dispositivo di gorgogliamento carbogeno. Aggiungere il ghiaccio tritato prodotto dal lotto congelato di soluzione di taglio alla soluzione di taglio fresco freddo per mantenere bassa la temperatura.
Prestare attenzione, per tenere il ghiaccio dalla lama durante l'affettamento. Quasi tutti i passaggi dopo la capitazione vengono eseguiti all'interno delle soluzioni. Questo aiuta a ridurre al minimo la privazione di ossigeno nel metabolismo.
Preparare una camera di incubazione riempita con una soluzione di taglio sotto ossigenazione costante. Posizionare la camera in un bagno d'acqua pre-riscaldato a 35 gradi Celsius. Preparare una camera di stoccaggio a fette con diversi pozzi indipendenti e riempirla con una soluzione di stoccaggio.
Tenerlo sotto ossigenazione costante a temperatura ambiente. Nel caso in cui il tessuto esprima una proteina fluorescente o una luce attivata opsonina. Si consiglia di tenere la camera al buio.
Ad esempio, all'interno della scatola. Dopo aver eseguito la perfusione transcardica, posizionare la testa del mouse nella piastra di Petri con la soluzione di taglio freddo del ghiaccio. Apri la pelle con una forbice fine per esporre il cranio.
Partendo dal forame magnum, tagliare lungo la sutura sagittale fino a raggiungere la sutura nasofrontale. Fare attenzione a tirare leggermente su le forbici per evitare danni al cervello. Fai due incisioni laterali nella base del cranio.
Utilizzare le pinzette arrotondate per tirare su le ossa parietali. Fai attenzione anche a rimuovere le meningi. Se lasciati possono danneggiare il cervello durante l'estrazione.
Usa la piccola spatola per allentare delicatamente il cervello dalla base del cranio. Con una piccola spatola, staccare il cervello dai nervi cranici e trasferire il cervello su un piccolo pezzo di carta da filtro nella seconda piastra di Petri. Tagliare il cervello a metà lungo la fessura longitudinale usando una lama pre-refrigerata.
Separare i due emisferi usando la spatola più piccola. Usa la spatola più grande per trasferire un emisfero alla piastra di Petri di plastica con la sua superficie mediale rivolta verso il basso. Allineare la corteccia parietale a una delle linee parallele per avere un riferimento per il secondo taglio.
Utilizzare un pezzo di carta da filtro per asciugare la soluzione in eccesso. Posizionare la lama in parallelo alle linee e tagliare la parte ventrale dell'emisfero. Questa superficie piana verrà successivamente incollata sul supporto del campione.
Riportare l'emisfero nella soluzione di cotone ossigenato della piastra di Petri in vetro ed eseguire la stessa procedura sul secondo emisfero. Posizionare una goccia di colla cianoacrilato sul supporto del campione di vibratomo e stenderla con una spatola per creare uno strato sottile. Trasferire l'emisfero sul supporto del vibratomo con il lato ventrale verso il basso utilizzando il lato arrotondato della spatola.
Iniziare questo affezione dalla corteccia parietale ridurrebbe il tempo necessario per raccogliere la regione dorsale dell'ippocampo. Aggiungere alcune gocce di soluzione di taglio a freddo per solidificare la colla. Spostare il portacampioni nel vassoio del vibratomo e, con impostazioni appropriate, tagliare il cervello fino a quando la regione dell'ippocampo dorsale è visibile.
Quindi, raccogliere le fette con l'uso di una pipetta di trasferimento in plastica. Trasferire ogni fetta nella camera di incubazione e lasciarla riposare per 12 minuti. Nel frattempo, procedere con il taglio delle fette prossime.
Dopo i 12 minuti di incubazione, trasferire le fette nella camera di stoccaggio. E lascialo riposare fino all'inizio dell'esperimento. Per dimostrare la purezza della nostra preparazione, la confrontiamo con una preparazione coronale che è comunemente usata per registrare dall'ippocampo dorsale.
Ecco, la micrografia a contrasto di interferenza differenziale acquisita dalla lama superiore del giro dentato in fette acute da topi di due mesi. Nella fetta trasversale i neuroni mostravano principalmente superfici lisce e solo probabili bordi contrastanti, indicati da frecce nere. I neuroni nelle fette coronali tuttavia spesso apparivano corso e mostravano contorni fortemente contrastanti, indicati da frecce bianche.
Ciò suggerisce una migliore vitalità dei neuroni nella fetta trasversale. In accordo con questa impressione, il tempo medio per sigillare la formazione durante il patching nelle nostre fette trasversali è stato significativamente più rapido che nelle fette coronali. Come proxy generale per l'integrità cellulare, registriamo che i potenziali della membrana a riposo delle cellule granuli e degli interneuroni positivi alla parvalbumina che dove significativamente più depolarizzano in entrambi i tipi di cellule nelle fette coronali rispetto a quelle trasversali.
Che alla fine ha portato a un numero significativamente maggiore di cellule che dovevano essere escluse nella preparazione coronale. Mentre gli assoni cellulari granuli corrono nel piano trasversale, la ricostruzione delle cellule registrate ha portato al recupero dell'arborizzazione assonale completa nella nostra preparazione. Questo non è stato il caso delle fette coronali in cui gli assoni potrebbero essere stati facilmente recisi.
Inoltre, la ricostruzione morfologica degli interneuroni positivi alla parvalbumina nelle fette trasversali ha permesso la rappresentazione di un'ampia arborizzazione assonale e dendritica, inclusa la visualizzazione di piccoli dettagli, come le spine dendritiche. Nel complesso, abbiamo presentato un metodi di affettare per ottenere fette di ippocampo trasversali ad alta vitalità neuronale per topi adulti. Questo metodo può essere utilizzato per misurare l'indagine elettrofisiologia in vitro con studi anatomici e comportamentali incentrati sulla parte dorsale intermedia dell'ippocampo.
