Desideriamo ringraziare Monte Westerfield, Makoto Kobayashi e Jacek Topczewski per i doni di plasmidi per l&#39;ibridazione in situ e microiniezioni di mRNA. Siamo grati a Steph Erhard per apparire nel video. Desideriamo inoltre riconoscere l&#39;aiuto di William Goossens con la microscopia confocale mostrato nel video. Tyler Schwend fornito le immagini utilizzate nel video, e il Rodney Dale assistito con la preparazione per il video. Abbiamo anche riconoscere il personale CMRC la cura degli animali per il loro lavoro con l&#39;allevamento zebrafish. Questo lavoro è stato finanziato dalla sovvenzione del NIH R21 AA13596 di SCA.

1. Trattamento etanolo di embrioni <ol><li> Embrioni di zebrafish derivati ​​da wild-type accoppiamenti sono state sollevate a 28 ° C in 5 ml di acqua dell&#39;embrione. (Milli-Q acqua con 60 mg / L istantaneo Ocean). Diversi ceppi wild-type embrioni hanno tolleranze leggermente diverse con etanolo esposizione 9. </li><li> L&#39;esposizione di etanolo è stata avviata nella fase cupola (~ 4,3 ore dopo la fecondazione, HPF) per il tempo desiderato, fino ad un impulso di 24 ore. Questa fase di partenza è più o meno equivalente alla fase di impianto di embrioni di mammifero, appena prima della gastrulazione. Concentrazioni di etanolo utilizzato da 0,2% -2,5%, volume / volume. I test hanno dimostrato che tra il 25-50% della soluzione nell&#39;acqua finisce negli embrioni 10, 11. Gli embrioni vengono mantenuti a 28 ° C per la durata desiderata. Dopo la lunghezza desiderata di etanolo esposizione, l&#39;etanolo-acqua soluzione viene rimosso e sostituito con tre lavaggi di acqua zebrafish regolare e mantenuto FOr la durata desiderata. La specificità del difetto dipende dal tempo di insorgenza, la dose, e la lunghezza dell&#39;impulso di etanolo. </li></ol> 2. Raccolta di embrioni per la RNA, ibridazione in situ, Anticorpi, e la colorazione cartilagine <ol><li> Per raccogliere mRNA per qPCR, età embrioni trovati sono raccolti in provette Eppendorf. Dopo la rimozione dell&#39;acqua zebrafish, tampone di lisi con TCEP viene aggiunto. Un polverizzatore motorizzato viene utilizzato per dissociare fisicamente gli embrioni nella soluzione di lisi. Questo viene poi fatto passare attraverso una colonna preclear, che elimina eventuali pezzi di grandi dimensioni dissociato. La soluzione risultante contiene tutte le macromolecole rilasciati dal processo di lisi. RNA viene poi estratta eseguendo questa soluzione su una colonna, seguita da lavaggio e trattamento DNAsi. L&#39;eluizione viene quindi effettuata utilizzando acqua o una soluzione di eluizione fornito dal produttore (5&#39;-Prime). L&#39;RNA può essere convertito in cDNA usando tecniche standard per qPCR o utilizzati in micromatrice analisi. </li><li> Per ibridazione in situ e la colorazione anticorpale, embrioni da 6 a 24 hpf sono stati fissati in paraformaldeide al 4% notte a 4 ° C. Questo è seguito da 3 lavaggi in PBS + 0,1% Tween (PBT), per mantenere gli embrioni aderiscano l&#39;uno all&#39;altro. Gli embrioni vengono poi trasferite attraverso una serie di metanolo 3: PBT lava in metanolo 100%, al punto che essi possono essere conservati a -20 ° C. Questi embrioni possono essere utilizzati per ibridazione in situ o colorazione anticorpale. Alcuni anticorpi non funzionano dopo il trattamento metanolo, quindi questo avvertimento deve essere presa in considerazione e la anticorpi specifici test per determinare se funzionerà dopo il trattamento metanolo. </li><li> Per la colorazione della cartilagine, gli embrioni devono essere innalzati a 5 o 6 giorni dopo la fecondazione (DPF). Essi vengono poi fissati in paraformaldeide al 4% notte a 4 ° C, seguito da 3 lavaggi in PBT. </li></ol> 3. Valutare etanolo-indotti cambiamenti di espressione genica e conseguenze dello sviluppo <ol><li&gt; Per determinare quali siano i livelli di espressione genica sono cambiati, i geni mirati vengono esaminati sia qPCR e ibridazione in situ. qPCR si ottiene utilizzando primer disegnati con Integrated DNA Technologies (IDT) del software, poi convalidato mediante 3 distinti campioni biologici. Una volta primer sono stati convalidati, qPCR viene eseguita su cDNA creata dal raccolto campioni di RNA. Ogni campione viene eseguito in triplice copia. Le reazioni di PCR sono gestiti Platinum SYBR Green qPCR Super mix (Invitrogen) su un Chroma-4 macchina PCR (BioRad) o similare macchina PCR con un sistema di rilevamento multicolor. Oltre ai geni essere interrogato, è fondamentale che un insieme di controllo di primer viene usata per equilibrare piccole differenze nella preparazione di cDNA o RNA. Per i nostri embrioni di zebrafish, usiamo GAPDH: 5&#39;GAAGGTGGGAAACTGGTCAT3 &#39;e 5&#39;TTGCACCACCCTTAATGTGA3&#39;. Geni essere analizzati vengono poi normalizzati a livelli GAPDH uno la quantificazione relativa dell&#39;espressione genica è calcolato utilizzando la variazione Pfaffl metodo 2 <sup&gt; - Ct, la visualizzazione dei dati come differenza volte in sperimentali relative al tipo di selvatico 12. Il calcolo normale presuppone che tutti i geni sono duplicando il DNA due volte per ogni ciclo, e quindi i dati esprime come rapporto tra la variazione nel gene sperimentale sulla variazione del gene di riferimento, espressa come calcoli di potenza sulla intero &quot;2&quot;, che è l&#39;efficienza di raddoppio di DNA per ciclo visto in una reazione PCR perfetta. Il metodo Pfaffl sostituisce il generico &quot;2&quot; con lo sperimentatore generato vera efficienza per il primer PCR scelto. Essa riflette una riflessione più accurata della differenza nelle reazioni PCR. La formula è completo: <table border="0"><tbody><tr><td> (Efficienza del gene sperimentale) (Ct del controllo Ct campione del campione trattato) </td></tr><tr><td> -------------------------------------------------- ----------------------------------- </td></tr><tr><td> (Efficienza del gene di riferimento) (Ct delcampione di controllo - Ct del campione trattato) </td></tr></tbody></table></li><li> Per ibridazione in situ, digossigenina (DIG)-marcati ribosonde sono costruiti plasmidi contenenti porzioni del gene di interesse. Pari età embrioni sono esposti a ribosonde utilizzando condizioni standard 13 e rilevato usando anti-DIG anticorpi accoppiati a fosfatasi alcalina che consente la localizzazione delle ribosonde marcato utilizzando una reazione di colorazione (NBT / BCIP). Gli embrioni vengono poi visualizzati con un microscopio Leica dissezione (Figura 1B-G). </li><li> Per valutare lo sviluppo morfogenetico, gli embrioni vengono raccolti al momento desiderato ed esaminate al microscopio da dissezione. Per la forma somite, embrioni vivi vengono esposte 14. Per la distanza tra l&#39;oculare e lunghezza del corpo, gli embrioni sono fissati in PFA. In tutti i casi, le immagini della regione desiderata vengono catturate su un microscopio da dissezione a un ingrandimento fisso e misurazioni effettuate con Adobe Photoshop software 10,14. </li><li> Per esaminare gli effetti del trattamento sulle strutture cartilagine in via di sviluppo larvale del pesce zebra, usiamo Alcian colorazione blu. Larve di zebrafish fisso vengono trattate con soluzione blu Alcian sciolto in etanolo all&#39;80%: 20% di acido acetico glaciale (alcool acido) per diverse ore o durante la notte. Le larve sono decolorato in alcuni lavaggi di alcol acido prima di essere trasferito ad un 1% KOH: 3% di soluzione di perossido di idrogeno per la compensazione ulteriore cellule pigmentate. Zebrafish devono essere almeno 4 giorni vecchie mostrano strutture cartilaginee, e questi sono meglio definite nei pesci che sono 5 o 6 giorni. </li><li> La morte cellulare in embrioni di vita è valutata sulla base arancio di acridina (AO). AO non è la cellula permeabile alle cellule viventi, e si lega al DNA in cellule con membrane compromessi, compresi quelli in fase di apoptosi e necrosi. Embrioni viventi sono incubati con 5 mg / ml AO in PBS per 1 ora, seguito da 3 lavaggi in PBS. Gli embrioni vengono poi ripresi utilizzando il microscopio confocale. Digital Z-serimmagini IE sono combinati per creare compositi. </li></ol> 4. Manipolare l&#39;embrione Zebrafish <ol><li> Dopo l&#39;identificazione di geni che sono diminuiti esposizione etanolo, è possibile tentare di sostituirli con iniezione di mRNA progettato per sostituire il gene mancante. MRNA Capped è trascritto da plasmidi di DNA linearizzato utilizzando RNA polimerasi in kit di trascrizione in vitro, secondo le istruzioni del produttore (mMessage Macchina, Applied Biosystems). Tra 25-200 pg / nl di RNA viene iniettata 1-2 uova fase cellule zebrafish, in una soluzione di 0,1 M KCl. Gli embrioni vengono poi consentito di recuperare prima di essere trattata con etanolo come descritto in precedenza (Figura 5). </li><li> Per qualsiasi trascritti genici vengono aumentate di etanolo esposizione, possono essere ridotti, o &quot;knock-down&quot; utilizzando una tecnologia antisenso morfolino. Antisenso Morpholinos (Amos), sono stati progettati da Gene Tools societari, e bloccare la traduzione di RNA in proteine, o block la maturazione e splicing di RNA, a seconda della necessità sperimentale. Questa azione di Morpholinos limitare la quantità di proteina attiva per il gene obiettivo, un deficit che può essere misurata usando anitibodies se sono disponibili. L&#39;efficienza di Morpholinos splicing dell&#39;RNA può essere misurata usando RT-PCR per rilevare le quantità relative di trascritti giuntate e unspliced. Titolazione dei morfolino può provocare dose-dipendente l&#39;attività 15. AMOS vengono diluiti a concentrazioni di lavoro (titolato pg a concentrazione ng) Danieau in soluzione (58 mM NaCl, 0,7 mM KCl, 0,4 mM MgSO 4, 0,6 mM Ca (NO 3) 2, 5 mM di HEPES, pH 7,6). L&#39;iniezione avviene in 1-2-cella fase, quindi gli embrioni sono permesso di sviluppare prima di essere sottoposto a trattamento di etanolo come sopra. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi L&#39;esposizione dell&#39;embrione Zebrafish ai risultati di etanolo in un certo numero di difetti di sviluppo e genetici che sono legati ai fenotipi trovato in altri vertebrati. Abbiamo documentato sviluppo anormale di tessuti assiali, compresa la notocorda (dati non mostrati 14). Il ritardo dello sviluppo prodotto da etanolo porta apparentemente per rottura di un adeguato allungamento notocorda, portando ad una abbreviata e di tanto in tanto interrotto notocorda (dati non riportati 14). Questo ritardo iniziale e difetti notocorda conduce con ogni probabilità in parte alle successive anomalie nei somiti (Figura 2), che hanno perso la loro forma forte chevron come si vede nei controlli non trattati, e sono più vicini ai somiti caratteristiche dei fenotipi a forma di U visto quando sonic segnalazione è ridotta 14. L&#39;angolo dei somiti può essere misurata usando software standard, e l&#39;angolo aumenta da 92,1 ± 4,6 ° nei controlli non trattati a 122,6 ± 6,6 ° negli embrioni di etanolo trattati (p &lt;0,001). Un&#39;altra conseguenza di etanolo esposizione che potrebbe essere downstream del primo ritardo di sviluppo e successive difetti notocorda è una lunghezza ridotta di un embrione (Figura 3). Anche misurazione embrioni per tener conto della curvatura prodotta da esposizione etanolo, etanolo esposizione porta ad un tronco accorciata che dipende dalla dose di etanolo è stato esposto per l&#39;embrione (Figura 3E 14). Questo risultato è simile alla persistenza di statura prepubertà short trovato in bambini esposti all&#39;etanolo durante lo sviluppo del 16, 17, suggerendo che il modello di zebrafish è rilevante per la comprensione del difetto nascita umana. Una delle caratteristiche classiche della FAS è una facies classici, tra cui una mandibola ridotta, apertura piccolo occhio, e un philtrum liscia. Gran parte di queste caratteristiche sono correlata ad una riduzione nei tessuti della linea mediana. È stato dimostrato in modelli animali che etanolo esposizione grave porta a fenotipi ancor più pronunciati, compresi synopthalmia e ciclopia. Quando expocantare embrioni di zebrafish a dosi maggiori di etanolo, la distanza intraoculare (IOD) riduce in modo dose-dipendente (Figura 4) coerente con la natura del difetto nascita umana. Cyclopia si trova solo con dosi molto elevate, ma dosi inferiori producono una significativa riduzione del IOD (figura 4), ​​suggerendo che questo modello animale ha un difetto simile in linea mediana dello sviluppo facciale 10. Al fine di comprendere il meccanismo alla base dei difetti sia nel corpo e del viso prodotto da etanolo esposizione, abbiamo cercato di determinare le variazioni di espressione genica che si verificano all&#39;inizio di sviluppo e che possono essere ragionevolmente dovrebbe contribuire a difetti dello sviluppo successivo. Facciamo questo in due modi, l&#39;estrazione di mRNA da embrioni permette una valutazione quantitativa dei livelli di espressione genica in embrioni di etanolo trattati rispetto ai controlli (Figura 1A). Inoltre, si può eseguire in situibridazione di guardare il modello di geni, indipendentemente dal fatto che il segnale viene diminuita (Figura 1B G-18). In questo esempio, due geni la cui espressione è diminuita dopo l&#39;esposizione a etanolo sono mostrati, e gli1 six3b. Quando abbiamo esaminato il modello in situ per six3b, abbiamo trovato una riduzione della estensione spaziale del espressione di questo gene (Figura 1 EG) in embrioni esposti a etanolo. Una riduzione simile è stato trovato nel gene GSC (Figura BD). Sia six3b e gsc sono espressi in tessuti destinati a contribuire alla cranio-facciali tessuti della linea mediana. Quindi, la riduzione di questi geni a 8 hpf è coerente con la riduzione IOD trovato seguito come mostrato nella Figura 4. Una volta che i geni che sono affetti da etanolo sono identificati, vi sono meccanismi mediante i quali l&#39;espressione di essi può essere aumentato o diminuito. In questo particolare EXAesempio, nell&#39;ambito abbiamo dimostrato 2 geni che sono diminuiti (gli1 e six3b) da qPCR. Abbiamo scelto di iniettare mRNA per determinare se l&#39;inversione di tali cambiamenti genetici possono migliorare i risultati. Per questo esperimento, invece di iniettare gli1, abbiamo scelto di iniettare shh, un ligando che aumenta gli1 livelli. Per six3b, siamo stati in grado di iniettare six3b stesso. Non abbiamo trovato cambia quando abbiamo iniettato six3b (dati non riportati), ma sono stati in grado di salvare fondamentalmente i difetti lordi in embrioni di zebrafish con iniezioni supplementari shh (Figura 5). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig1.jpg" /> Figura 1. Esposizione etanolo cambia il modello precoce e livelli di espressione genica di geni dello sviluppo selezionati. A) i risultati qPCR per gli embrioni a 8hpf. I risultati di due geni vengono visualizzati: six3b e gli1. I risultati mostrati come media di tre esperimenti separati,e la dose di etanolo mostrato è del 2,5%. Entrambi i geni sono ridotti in maniera significativa dal controllo (t-test, p &lt;0,05). BG) L&#39;ibridazione in situ di 8 embrioni di zebrafish HPF. Sia la GSC e modelli six3b sono alterati a questo punto tempo rispetto ai controlli. (Modificata con il permesso di Loucks et al. 2007). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig2.jpg" /> Figura 2. Sviluppo somite è alterata in embrioni trattati. Somite struttura e gli angoli vengono esaminati a 48 HPF. In embrioni di controllo (A), hanno una forma somiti chevron e un angolo acuto. Zebrafish Etanolo esposti hanno più angoli di I o U somiti, e meno tagliente. (Modificata con il permesso di Loucks e Ahlgren 2009). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig3.jpg" /> Figura 3. Trattamento etanolo diminuisce significativamente lunghezza del corpo in zebrafish.La lunghezza di embrioni non trattati e etanolo-esposti sono stati misurati a 5 postfertilization giorni. Una riduzione significativa lunghezza è stata osservata in tutti gli embrioni trattati (ANOVA, p &lt;0,001). BD. C&#39;è stata una leggera riduzione ma significativa nella lunghezza totale di embrioni trattati con 1,0% e 1,5% etanolo, mentre una maggiore riduzione è stata osservata in embrioni dosate con 2,0% e 2,5% di etanolo. E. Per controllare le differenze di dimensioni in ogni frizione, gli embrioni di controllo per ciascun esperimento sono stati normalizzati a 100, e gli embrioni di pari livello trattati espressa come percentuale di 100. (Modificata con il permesso di Loucks e Ahlgren 2009). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig4.jpg" /> Figura 4. Risultati etanolo esposizione in una riduzione della distanza intraoculare (IOD) in embrioni di zebrafish. A) viste frontali di embrioni dimostrano fenotipi occhi normali e fusa. B) Distinguere le dosi di etanolo somministrata per 3 ore durante res gastrulazioneULT è diminuito in iod quando i pesci sono esaminati dopo 24 ore. Occhi fusi e ciclopia si vedono solo alla massima dose testata (2,4%). * Denota una significativa riduzione iod rispetto ai controlli. (Modificato con il permesso di Ahlgren, 2004). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3704/3704fig5.jpg" /> Figura 5. Shh-N iniezione di mRNA salva i difetti lordi prodotti da esposizione etanolo di zebrafish. Uno-due embrioni di cellule sono state iniettate con 100 pg / nl shh-N mRNA e la metà degli embrioni iniettati sono stati esposti a dosi standard di etanolo 4,3-24 HPF. Gli embrioni sono stati analizzati a 5 dpf. Gli embrioni trattati con 2,0% di etanolo esibiscono sul dorso curvo code più corte, I-forma somiti, e difetti agli occhi, compresa ciclopia. Salvataggio di questi fenotipi è visto in 71/76 di embrioni iniettati (93%). In questi embrioni, il corpo è dritto, i somiti sono chevron forma, e gli occhi sono completamente separati.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

I metodi qui descritti e mostrati i risultati dimostrano che la punta di zebrafish come può essere utilizzato per interrogare difetti di sviluppo. A causa della accessibilità dell&#39;embrione, elevato numero di uova deposte per ogni frizione e alta riproducibilità dei risultati, questi vertebrati sono ideali per gli studi teratogeni. Pesci possono essere manipolati per contenere molecole fluorescenti da utilizzare come reporter visivo per un gene particolare o percorso di interesse 19. Negli studi di etanolo, le dosi utilizzate appaiono piuttosto elevato rispetto ai livelli di alcool nel sangue dei mammiferi. Tuttavia, questi livelli riflettono ciò che è presente nell&#39;acqua, e non tutto l&#39;etanolo è consegnato l&#39;embrione. Nel loro insieme, i metodi descritti e riportati sopra suggeriscono che embrioni di zebrafish sono molto utili a modellare difetti di nascita umani derivanti da un&#39;esposizione etanolo. Inoltre, i cambiamenti di espressione genica si trovano nel pesce zebra sono stati confermati da altrinei sistemi modello mammiferi 20, suggerendo che gli effetti sviluppo di etanolo sono mantenuti in vertebrati. Molte delle tecniche dimostrate sopra può essere utilizzato con altri insulti ambientali o farmaceutica per rilevare rapidamente e facilmente potenziali teratogeni e determinare i meccanismi che contribuiscono alla teratogenesi di una particolare sostanza.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Tissue RNA kit: 5-Prime PerfectPure </td><td> Fisher Scientific </td><td> FP2302410 </td></tr><tr><td> Platinum SYBR green qPCR Supermix-UDG </td><td> Invitrogen </td><td> 11733038 </td></tr><tr><td> mMessage mmachine alto rendimento limitato kit di trascrizione RNA </td><td> Applied Biosystems </td><td> Dipende dalla RNA polimerasi nel plasmide </td></tr></tbody></table>

assessing teratogenic changes in a zebrafish model of fetal alcohol exposure

Sindrome alcolica fetale (FAS) è una manifestazione grave di esposizione embrionale in etanolo. Si presenta con difetti caratteristici al viso e gli organi, tra cui ritardo mentale dovuto allo sviluppo del cervello disordinato e danneggiati. Disturbo dello spettro fetale alcolico (FASD) è un termine usato per coprire un continuum di difetti di nascita che si verificano a causa di consumo di alcol materno, e si verifica in circa il 4% dei bambini nati negli Stati Uniti. Con il 50% delle donne in età fertile età segnalazione consumo di alcol, e la metà di tutte le gravidanze non pianificate essere, l&#39;esposizione non intenzionale è un problema costante 2. Al fine di comprendere al meglio il danno prodotto da etanolo, oltre a produrre un modello con cui testare possibili interventi, abbiamo sviluppato un modello di esposizione etanolo di sviluppo utilizzando l&#39;embrione zebrafish. Zebrafish sono ideali per questo tipo di studio teratogeno 3-8. Ogni coppia dispone di centinaia di uova, che possono poi essere raccolti senza danneggiare l&#39;adultopesce. L&#39;embrione zebrafish è trasparente e può essere facilmente ripreso con qualsiasi numero di macchie. L&#39;analisi di questi embrioni dopo esposizione a etanolo a dosi differenti e tempi di durata e mostra l&#39;applicazione che i difetti gravi sviluppo prodotte da etanolo sono coerenti con il difetto nascita umana. Qui descritte sono le tecniche di base utilizzate per studiare e manipolare il modello zebrafish FAS.

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Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Al fine di comprendere i meccanismi molecolari del danno indotto da etanolo di sviluppo, abbiamo sviluppato un modello di esposizione zebrafish etanolo e stanno esplorando le caratteristiche fisiche, alterazioni cellulari e genetiche che si verificano dopo l&#39;esposizione etanolo<sup&gt; 1</sup&gt;. Abbiamo poi cercare di trovare possibili interventi e consentirne una rapida prova in questo modello animale.

Valutare i cambiamenti teratogeni in un modello di Zebrafish di esposizione alcolica fetale

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

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26.1K Views.  Children's Memorial Research Center. Al fine di comprendere i meccanismi molecolari del danno indotto da etanolo di sviluppo, abbiamo sviluppato un modello di esposizione zebrafish etanolo e stanno esplorando le caratteristiche fisiche, alterazioni cellulari e genetiche che si verificano dopo l'esposizione etanolo 1. Abbiamo poi cercare di trovare possibili interventi e consentirne una rapida prova in questo modello animale.

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The Polyvinyl Alcohol Sponge Model Implantation

Wound healing is a complicated, multistep process involving many cell types, growth factors and compounds1-3. Because of this complexity, wound healing studies are most comprehensive when carried out in vivo. There are many in vivo models available to study acute wound healing, including incisional, excisional, dead space, and burns. Dead space models are artificial, porous implants which are used to study tissue formation and the effects of substances on the wound. Some of the commonly used dead space models include polyvinyl alcohol (PVA) sponges, steel wire mesh cylinders, expanded polytetrafluoroethylene (ePTFE) material, and the Cellstick1,2.
Each dead space model has its own limitations based on its material's composition and implantation methods. The steel wire mesh cylinder model has a lag phase of infiltration after implantation and requires a long amount of time before granulation tissue formation begins1. Later stages of wound healing are best analyzed using the ePTFE model1,4. The Cellstick is a cellulose sponge inside a silicon tube model which is typically used for studying human surgery wounds and wound fluid2. The PVA sponge is limited to acute studies because with time it begins to provoke a foreign body response which causes a giant cell reaction in the animal5. Unlike other materials, PVA sponges are easy to insert and remove, made of inert and non-biodegradable materials and yet are soft enough to be sectioned for histological analysis2,5.
In wound healing the PVA sponge is very useful for analyzing granulation tissue formation, collagen deposition, wound fluid composition, and the effects of substances on the healing process1,2,5. In addition to its use in studying a wide array of attributes of wound healing, the PVA sponge has also been used in many other types of studies. It has been utilized to investigate tumor angiogenesis, drug delivery and stem cell survival and engraftment1,2,6,7. With its great alterability, prior extensive use, and reproducible results, the PVA sponge is an ideal model for many studies1,2.
Here, we will describe the preparation, implantation and retrieval of PVA sponge disks (Figure 1) in a mouse model of wound healing.

A useful tool to analyze the effects of drugs, growth factors, and/or manipulated cells in an animal model of wound repair is described. This technique utilizes the properties of a polyvinyl alcohol (PVA) sponge to deliver and contain the desired treatment and also provide a platform to be excised and analyzed.

L&#39;alcool polivinilico Sponge impianto modello

Wound healing is a complicated, multistep process involving many cell types, growth factors and compounds1-3. Because of this complexity, wound healing ...

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A Novel Surgical Approach for Intratracheal Administration of Bioactive Agents in a Fetal Mouse Model

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and acquired diseases. Apart from congenital or inherited abnormalities with the requirement for long-term expression of the delivered gene, several non-inherited perinatal conditions, where short-term gene expression or pharmacological intervention is sufficient to achieve therapeutic effects, are considered as potential future indications for this kind of approach. Candidate diseases for the application of short-term prenatal therapy could be the transient neonatal deficiency of surfactant protein B causing neonatal respiratory distress syndrome1,2 or hyperoxic injuries of the neonatal lung3. Candidate diseases for permanent therapeutic correction are Cystic Fibrosis (CF)4, genetic variants of surfactant deficiencies5 and &alpha;1-antitrypsin deficiency6.
Generally, an important advantage of prenatal gene therapy is the ability to start therapeutic intervention early in development, at or even prior to clinical manifestations in the patient, thus preventing irreparable damage to the individual. In addition, fetal organs have an increased cell proliferation rate as compared to adult organs, which could allow a more efficient gene or stem cell transfer into the fetus. Furthermore, in utero gene delivery is performed when the individual's immune system is not completely mature. Therefore, transplantation of heterologous cells or supplementation of a non-functional or absent protein with a correct version should not cause immune sensitization to the cell, vector or transgene product, which has recently been proven to be the case with both cellular and genetic therapies7.
In the present study, we investigated the potential to directly target the fetal trachea in a mouse model. This procedure is in use in larger animal models such as rabbits and sheep8, and even in a clinical setting9, but has to date not been performed before in a mouse model. When studying the potential of fetal gene therapy for genetic diseases such as CF, the mouse model is very useful as a first proof-of-concept because of the wide availability of different transgenic mouse strains, the well documented embryogenesis and fetal development, less stringent ethical regulations, short gestation and the large litter size.
Different access routes have been described to target the fetal rodent lung, including intra-amniotic injection10-12, (ultrasound-guided) intrapulmonary injection13,14 and intravenous administration into the yolk sac vessels15,16 or umbilical vein17. Our novel surgical procedure enables researchers to inject the agent of choice directly into the fetal mouse trachea which allows for a more efficient delivery to the airways than existing techniques18.

We developed a novel surgical approach for intratracheal administration of bioactive agents into the mouse fetus. The delivery route is more efficient in targeting the fetal mouse lungs than the commonly used intra-amniotic injection. This procedure has to date not been described in a mouse model.

Un nuovo approccio chirurgico per somministrazione endotracheale di agenti bioattivi in ​​un modello murino fetale

Prenatal pulmonary delivery of cells, genes or pharmacologic agents could provide the basis for new therapeutic strategies for a variety of genetic and ...

Screening for Melanoma Modifiers using a Zebrafish Autochthonous Tumor Model

Genomic studies of human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered in tumors1,2,3. A challenge arising from these studies is that many genes are altered, and it can be difficult to distinguish genetic alterations that drove tumorigenesis from that those arose incidentally during transformation. To draw this distinction it is beneficial to have an assay that can quantitatively measure the effect of an altered gene on tumor initiation and other processes that enable tumors to persist and disseminate. Here we present a rapid means to screen large numbers of candidate melanoma modifiers in zebrafish using an autochthonous tumor model4 that encompasses steps required for melanoma initiation and maintenance. A key reagent in this assay is the miniCoopR vector, which couples a wild-type copy of the mitfa melanocyte specification factor to a Gateway recombination cassette into which candidate melanoma genes can be recombined5. The miniCoopR vector has a mitfa rescuing minigene which contains the promoter, open reading frame and 3'-untranslated region of the wild-type mitfa gene. It allows us to make constructs using full-length open reading frames of candidate melanoma modifiers. These individual clones can then be injected into single cell Tg(mitfa:BRAFV600E);p53(lf);mitfa(lf)zebrafish embryos. The miniCoopR vector gets integrated by Tol2-mediated transgenesis6 and rescues melanocytes. Because they are physically coupled to the mitfa rescuing minigene, candidate genes are expressed in rescued melanocytes, some of which will transform and develop into tumors. The effect of a candidate gene on melanoma initiation and melanoma cell properties can be measured using melanoma-free survival curves, invasion assays, antibody staining and transplantation assays.

A rapid way to screen for melanoma modifiers using a zebrafish autochthonous tumor model is presented. It takes advantage of the miniCoopR vector which allows for expression of candidate melanoma genes in melanocytes. A method to obtain melanoma-free survival curves, an invasion assay, a protocol for antibody staining of scale melanocytes and a melanoma transplantation assay are described.

Screening per Modificatori melanoma utilizzando un modello Zebrafish Tumore autoctone

Genomic studies of  human cancers have yielded a wealth of information about genes that are altered  in tumors1,2,3. A challenge arising from these ...

Fetal Echocardiography and Pulsed-wave Doppler Ultrasound in a Rabbit Model of Intrauterine Growth Restriction

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ultrasound and fetal echocardiography. Increasingly, these imaging modalities are being employed clinically to examine cardiac function and assess wellbeing in utero, thereby guiding timing of birth decisions. Here, we used a rabbit model of IUGR that allows analysis of cardiac function in a clinically relevant way. Using isoflurane induced anesthesia, IUGR is surgically created at gestational age day 25 by performing a laparotomy, exposing the bicornuate uterus and then ligating 40-50% of uteroplacental vessels supplying each gestational sac in a single uterine horn. The other horn in the rabbit bicornuate uterus serves as internal control fetuses. Then, after recovery at gestational age day 30 (full term), the same rabbit undergoes examination of fetal cardiac function. Anesthesia is induced with ketamine and xylazine intramuscularly, then maintained by a continuous intravenous infusion of ketamine and xylazine to minimize iatrogenic effects on fetal cardiac function. A repeat laparotomy is performed to expose each gestational sac and a microultrasound examination (VisualSonics VEVO 2100) of fetal cardiac function is performed. Placental insufficiency is evident by a raised pulsatility index or an absent or reversed end diastolic flow of the umbilical artery Doppler waveform. The ductus venosus and middle cerebral artery Doppler is then examined. Fetal echocardiography is performed by recording B mode, M mode and flow velocity waveforms in lateral and apical views. Offline calculations determine standard M-mode cardiac variables, tricuspid and mitral annular plane systolic excursion, speckle tracking and strain analysis, modified myocardial performance index and vascular flow velocity waveforms of interest. This small animal model of IUGR therefore affords examination of in utero cardiac function that is consistent with current clinical practice and is therefore useful in a translational research setting.

We describe examination of fetal cardiac function with contemporary functional fetal echocardiography and fetoplacental Doppler ultrasound using the VisualSonics VEVO 2100 microultrasound in a surgically induced model of intrauterine fetal growth restriction in a rabbit.

L&#39;ecocardiografia fetale e Pulsed-Doppler ad ultrasuoni in un modello di coniglio di ritardo di crescita intrauterino

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ...

Assessing Changes in Volatile General Anesthetic Sensitivity of Mice after Local or Systemic Pharmacological Intervention

One desirable endpoint of general anesthesia is the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is less straightforward than it is in human patients. A widely used behavioral surrogate for hypnosis in rodents is the loss of righting reflex (LORR), or the point at which the animal no longer responds to their innate instinct to avoid the vulnerability of dorsal recumbency. We have developed a system to assess LORR in 24 mice simultaneously while carefully controlling for potential confounds, including temperature fluctuations and varying gas flows. These chambers permit reliable assessment of anesthetic sensitivity as measured by latency to return of the righting reflex (RORR) following a fixed anesthetic exposure. Alternatively, using stepwise increases (or decreases) in anesthetic concentration, the chambers also enable determination of a population's sensitivity to induction (or emergence) as measured by EC50 and Hill slope. Finally, the controlled environmental chambers described here can be adapted for a variety of alternative uses, including inhaled delivery of other drugs, toxicology studies, and simultaneous real-time monitoring of vital signs.

Loss of the righting reflex has long served as a standard behavioral surrogate for unconsciousness, also called hypnosis, in laboratory animals. Alterations in volatile anesthetic sensitivity caused by pharmacological interventions can be detected with a carefully controlled high-throughput assessment system, which may be adapted for delivery of any inhaled therapeutic.

Valutare Variazioni Volatile generale anestetico sensibilità dei topi dopo l&#39;intervento farmacologico locale o sistemica

One desirable endpoint of general anesthesia is  the state of unconsciousness, also known as hypnosis. Defining the hypnotic state in animals is  less ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The molecular mechanisms leading to cyst formation in PKD remain somewhat unclear, but many genes are thought to be involved. Wnt5a is a non-canonical glycoprotein that regulates a wide range of developmental processes. Wnt5a works through the planar cell polarity (PCP) pathway that regulates oriented cell division during renal tubular cell elongation. Defects of the PCP pathway have been found to cause kidney cyst formation. Our paper describes a method for developing a zebrafish cystic kidney disease model by knockdown of the wnt5a gene with wnt5a antisense morpholino (MO) oligonucleotides. Tg(wt1b:GFP) transgenic zebrafish were used to visualize kidney structure and kidney cysts following wnt5a knockdown. Two distinct antisense MOs (AUG - and splice-site) were used and both resulted in curly tail down phenotype and cyst formation after wnt5a knockdown. Injection of mouse Wnt5a mRNA, resistant to the MOs due to a difference in primary base pair structure, rescued the abnormal phenotype, demonstrating that the phenotype was not due to &#8220;off-target&#8221; effects of the morpholino. This work supports the validity of using a zebrafish model to study wnt5a function in the kidney.

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

We describe a method of generating a possible zebrafish model of polycystic kidney disease. We used Tg(wt1b:GFP) fish to visualize kidney structure. Knockdown of wnt5a was by morpholino injection. Pronephric cyst formation after wnt5a knockdown was observed in this GFP transgenic zebrafish.

Un possibile modello Zebrafish della malattia del rene policistico: Knockdown di<em&gt; Wnt5a</em&gt; Provoca cisti in Zebrafish Reni

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

A Mouse Fetal Skin Model of Scarless Wound Repair

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Un Mouse fetale Modello Skin of Wound Repair scarless

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs ...

Generation of a Chronic Obstructive Pulmonary Disease Model in Mice by Repeated Ozone Exposure

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high incidence in aging populations. The current conventional therapies for COPD focus mainly on symptom-modifying drugs; thus, the development of new therapies is urgently needed. Qualified animal models of COPD could help to characterize the underlying mechanisms and can be used for new drug screening. Current COPD models, such as lipopolysaccharide (LPS) or the porcine pancreatic elastase (PPE)-induced emphysema model, generate COPD-like lesions in the lungs and airways but do not otherwise resemble the pathogenesis of human COPD. A cigarette smoke (CS)-induced model remains one of the most popular because it not only simulates COPD-like lesions in the respiratory system, but it is also based on one of the main hazardous materials that causes COPD in humans. However, the time-consuming and labor-intensive aspects of the CS-induced model dramatically limit its application in new drug screening. In this study, we successfully generated a new COPD model by exposing mice to high levels of ozone. This model demonstrated the following: 1) decreased forced expiratory volume 25, 50, and 75/forced vital capacity (FEV25/FVC, FEV50/FVC, and FEV75/FVC), indicating the deterioration of lung function; 2) enlarged lung alveoli, with lung parenchymal destruction; 3) reduced fatigue time and distance; and 4) increased inflammation. Taken together, these data demonstrate that the ozone exposure (OE) model is a reliable animal model that is similar to humans because ozone overexposure is one of the etiological factors of COPD. Additionally, it only took 6 - 8 weeks, based on our previous work, to create an OE model, whereas it requires 3 - 12 months to induce the cigarette smoke model, indicating that the OE model might be a good choice for COPD research.

This study describes the successful generation of a new chronic obstructive pulmonary disease (COPD) animal model by repeatedly exposing mice to high concentrations of ozone.

Generazione di un modello di malattia polmonare ostruttiva cronica nei topi da esposizione ripetuta dell'ozono

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is characterized by persistent airflow limitation and lung parenchymal destruction. It has a very high ...

Model Surgical Training: Skills Acquisition in Fetoscopic Laser Photocoagulation of Monochorionic Diamniotic Twin Placenta Using Realistic Simulators

Fetoscopic laser coagulation of arterio-venous anastomoses (AVA) in a monochorionic placenta is the standard of care for twin-twin transfusion syndrome (TTTS), but is technically challenging and can lead to significant complications. Acquiring and maintaining the necessary surgical skills require consistent practice, a critical caseload, and time. Training on realistic surgical simulators can potentially shorten this steep learning curve and enables several proceduralists to acquire procedure-specific skills simultaneously. Here we describe realistic simulators designed to allow the user familiarity with the equipment and specific steps required in the surgical treatment of TTTS, including fetoscopic handling, approaches to anterior and posterior placenta, recognition of anastomoses, and efficient coagulation of vessels. We describe the skills that are especially important in conducting placental laser coagulation that the surgeon can practice on the model and apply in a clinical case. These models can be adapted easily depending on the availability of materials and require standard fetoscopy equipment. Such training systems are complementary to traditional surgical apprenticeships and can be useful aids for fetal medicine units that provide this clinical service.

Practicing the specific skills required for fetoscopic laser coagulation of monochorionic placental anastomoses on realistic models can aid less experienced surgeons in overcoming the steep learning curve associated with this procedure that is now regarded as the standard of care for twin-twin transfusion syndrome.

Modello di Training chirurgico: Acquisizione di competenze in photocoagulation del Laser Fetoscopic di Monochorionic Diamniotic Twin Placenta utilizzando simulatori realistici

Fetoscopic laser coagulation of arterio-venous anastomoses (AVA) in a monochorionic placenta is the standard of care for twin-twin transfusion syndrome ...

A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

The genetically accessible adult zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as a vertebrate model for understanding human diseases such as cardiomyopathy. Because of its convenience and amenability to high throughput genetic manipulations, the generation of acquired cardiomyopathy models, such as the doxorubicin-induced cardiomyopathy (DIC) model in adult zebrafish, is opening the doors to new research avenues, including discovering cardiomyopathy modifiers via forward genetic screening. Different from the embryonic zebrafish DIC model, both initial acute and later chronic phases of cardiomyopathy can be determined in the adult zebrafish DIC model, enabling the study of stage-dependent signaling mechanisms and therapeutic strategies. However, variable results can be obtained with the current model, even in the hands of experienced investigators. To facilitate future implementation of the DIC model, we present a detailed protocol on how to generate this DIC model in adult zebrafish and describe two alternative ways of intraperitoneal (IP) injection. We further discuss options on how to reduce variations to obtain reliable results and provide suggestions on how to appropriately interpret the results.

A method to generate a doxorubicin-induced cardiomyopathy model in adult zebrafish (Danio rerio) is described here. Two alternative ways of intraperitoneal injection are presented and conditions to reduce variations among different experimental groups are discussed.