Questo protocollo è significativo perché aiuta a comprendere la farmacocinetica dell'etanolo nello sviluppo di embrioni di zebrafish e questo aiuterà a standardizzare i regimi di esposizione all'etanolo negli studi sul pesce zebra. Il vantaggio principale della nostra tecnica è che consente ai ricercatori di misurare rapidamente e riproducibilmente i livelli di etanolo durante lo sviluppo embrionale, in particolare negli embrioni in cui l'apporto di sangue non è disponibile. Questo metodo può essere facilmente applicato ad altri sistemi di modelli e ad altri fattori ambientali assumendo una corretta configurazione della tecnica e delle attrezzature.
Mi aspetto che le persone che eseguono questo protocollo per la prima volta lottino con la velocità necessaria per prevenire l'evaporazione dell'etanolo durante la lavorazione degli embrioni. Inizia trasferendo 10 embrioni con liquido embrionale extra in tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri contrassegnati da una linea con un volume di 250 microlitri. Aggiungere acqua alla linea di riempimento.
Preparare ulteriori tubi di microcentrifugo per campioni dechorionati. Per rimuovere il corone, incubare gli embrioni in una piastra di Petri di 100 millimetri con due milligrammi per millilitro di cocktail di proteasi nei mezzi embrionale per 10 minuti. Ruotare delicatamente il piatto ogni pochi minuti per rompere il chorion.
Una volta che tutti gli embrioni sono liberi dal chorion, rimuoverli dal cocktail proteasi e lavarli due volte con mezzi freschi. Quindi trasferire gli embrioni in un piatto fresco da 100 millimetri. Quando tutti i campioni sono pronti per la misurazione del volume, utilizzare una micropipetta P200 con la punta più piccola possibile per rimuovere con cura tutto il liquido da intorno agli embrioni.
Pesare l'acqua con una scala con una precisione inferiore a 0,1 milligrammi, quindi determinare il volume dei 10 embrioni sottraendo il peso dell'acqua rimossa da 250 microlitri. Per determinare il volume di un singolo embrione, dividere la differenza per 10. Raccogliere gli embrioni dai serbatoi di accoppiamento e metterli in una piastra di Petri standard da 100 millimetri, quindi incubare il piatto a 28,5 gradi Celsius.
A sei ore dalla fecondazione, trasferire fino a 100 embrioni in un nuovo piatto con mezzi embrionale e 1%etanolo o solo media. Coprire ma non sigillare le piastre di Petri e posizionarle in un'incubatrice di 28,5 gradi Celsius per 18 ore o fino a raggiungere le 24 ore dopo la fecondazione. Utilizzare due micropipette P200 impostate su 50 microlitri e aspirare la soluzione di cocktail proteasi in uno e acqua nel secondo.
Quindi posizionare rapidamente 10 embrioni in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri usando una pipetta di vetro e chiudere il cappuccio. Ripetere questo processo per tutti i campioni da testare, i controlli e gli embrioni trattati con etanolo. Lavorando con un campione alla volta, aprire rapidamente il tappo e aspirare tutti i mezzi embrionale residui con una micropipetta P200 impostata su 200 microlitri.
Aggiungere e rimuovere rapidamente ma delicatamente i 50 microlitri di acqua, quindi aggiungere i 50 microlitri del cocktail proteasi e chiudere il tappo del tubo. Lasciare riposare il campione per 10 minuti a temperatura ambiente, quindi aggiungere rapidamente 450 microlitri di cinque cloruro di sodio molare e chiudere il tappo del tubo. Omogeneizzare il campione vortice per 10 minuti e trasferire due microlitri di supernatante in una fiala gascromatografica.
Sigillare la fiala con un cappuccio in politetrafluoroetilene. Dopo aver completato il metodo di avvio, caricare l'etanolo SPME corrente da due a cinque minuti. meth dal menu dei metodi nel software di analisi per ogni campione nell'elenco di esempio.
Compilare l'elenco dei campioni a partire dall'aria, dall'acqua e da cinque spazi vuoti di cocktail di proteasi al cloruro di sodio molare. Quindi inserire gli standard dell'etanolo in ordine da 0,3125 a 40 millimolari. Segui gli standard con il secondo giro di spazi vuoti.
Immettere tutti i campioni omogeneizzati di embrione supernatante da testare dalla concentrazione e dalla finitura di etanolo più bassa a più alta prevista inserendo un terzo ciclo di spazi vuoti. Aggiungere le fiale gascromatografiche all'autocampionatore nell'ordine in cui sono stati inseriti i campioni e consentire loro di riscaldarsi per 10-15 minuti. Quindi avviare l'esempio eseguito utilizzando il software.
Al termine di tutte le esecuzioni, attivare il metodo di arresto aggiungendo un esempio finale nell'elenco di esempio ed eseguendo standby.meth. Eseguire il backup di tutti i dati acquisiti durante l'esecuzione dell'esempio. Una volta completato il metodo di arresto, fare clic sul cromatogramma aperto e aprire la cartella con i risultati.
Gli esempi vengono integrati automaticamente in questo programma. Nei risultati, assicurarsi che i picchi corretti siano stati integrati. Una volta che tutti i campioni sono stati confermati, stampare o esportare i risultati.
Tracciare l'altezza di picco degli standard di etanolo su un grafico, quindi calcolare la pendenza, l'intercetta y e i valori al quadrato r. Ottenere il valore dell'etanolo per ogni campione sottraendo l'altezza di picco del campione dall'intercetta y degli standard e dividendo questo valore per la pendenza degli standard. Per calcolare la concentrazione di etanolo negli embrioni, calcolare il fattore di diluizione per ciascun campione e moltiplicare il valore dell'etanolo campione per questo fattore di diluizione.
Infine, calcolare i campioni di riferimento dei supporti moltiplicando il valore dell'etanolo multimediale per un fattore di diluizione pari a 10. Per calcolare correttamente le concentrazioni embrionali di etanolo, sono stati misurati i volumi di embrioni sia nel loro corione che rimossi dal loro corione. In questa analisi, l'embrione comprendeva il 56% del volume totale all'interno del corone.
Sulla base di lavori pubblicati in precedenza, il 73,6% è stato utilizzato come contenuto di acqua embrionale per tutte le analisi presentate. Ciò ha portato ad acqua composta da 0,82 microlitri degli 1,1 microlitri di volume embrionale. Del volume totale dell'acqua, il 49% è contenuto nell'embrione e il 51% nel fluido extraembrionale.
Per l'analisi gascromatografica sono stati analizzati due gruppi di 15 campioni e i mezzi con cui sono stati trattati misurati cinque volte per gruppo. I livelli di etanolo media erano di 143,6 millimolari per il primo gruppo e di 133,6 millimolare per il secondo gruppo. Le concentrazioni di etanolo degli embrioni sono state in media di 63,5 millimolare e 53,1 millimolare rispettivamente per i gruppi uno e due.
È stato calcolato un rapporto tra concentrazione embrionale di etanolo e livelli media di etanolo per ciascun campione. Il primo gruppo aveva il 44% dei livelli di etanolo mediatico, mentre il gruppo aveva il 40% dei livelli di etanolo media. Gli embrioni di controllo non trattati sono stati misurati a concentrazione di etanolo mediale millimolare zero.
La cosa più importante da ricordare quando si tenta questa procedura è che elaborare correttamente gli embrioni per l'analisi GC è fondamentale in quanto l'etanolo è volatile e evaporerà rapidamente. Il modo migliore per eseguire questo passaggio è descritto, ma deve essere praticato per sviluppare una corretta memoria muscolare. Questa procedura aiuterà a standardizzare i regimi di trattamento dell'etanolo nel pesce zebra e consentirà ai lavori futuri di sezionare i meccanismi genetici e cellulari della teratogenicità etano.
