Questo studio è stato supportato dal National Institutes of Health (R03NS131908) e dal Dipartimento della Difesa attraverso il programma di ricerca sulla sclerosi multipla con il premio n. W81XWH-22-1-0517. Le opinioni, le interpretazioni, le conclusioni e le raccomandazioni sono quelle dell'autore e non sono necessariamente approvate dal Dipartimento della Difesa. Questo studio è stato supportato anche dai fondi per le startup della East Carolina University.

Tutte le procedure che coinvolgono i topi sono state eseguite in conformità con le linee guida sperimentali approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università della Carolina orientale. In questo studio sono stati utilizzati topi femmina Wildtype C57BL / 6J di età compresa tra 8 e 10 settimane. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali). L'EAE è stato indotto a seguito di rapporti precedentemente pubblicati 12,13,14.
1. Raccolta del siero
<ol><li>Eutanasia del topo sperimentale mediante asfissia da CO2 o sovradosaggio di isoflurano al momento richiesto (seguendo protocolli approvati istituzionalmente) dopo aver indotto l'EAE tramite immunizzazione MOG35-55. NOTA: Il numero totale di topi e i punti temporali per la raccolta del siero possono variare a seconda dell'esperimento specifico.</li>
	<li>Dopo che l'assenza di segni vitali è confermata dal pizzicamento del dito del piede o della coda, posizionare il topo in posizione sdraiata dorsale su un vassoio di dissezione e fissare gli arti in posizione con spilli o nastro adesivo. Orientare il corpo del mouse verso la sorgente luminosa a LED (vedere Tabella dei materiali) per illuminare il torace dell'animale.</li>
	<li>Spruzzare il pelo del topo con etanolo al 70% e praticare un'incisione mediana di 3-4 cm lungo l'addome dal bacino allo xifoide utilizzando le forbici di dissezione, facendo attenzione ad evitare eventuali organi e vasi principali (Figura 1A-C). Per facilitare la procedura, usa la pinza per afferrare la pelle durante il processo xifoideo.</li>
	<li>Tagliare lateralmente il diaframma e poi tagliare la gabbia toracica anteriormente su entrambi i bordi laterali usando le forbici a molla, fermandosi prima di raggiungere lo sterno sulla linea mediana (Figura 1D). Piega il lembo costale che è stato creato sopra la testa del topo per esporre il cuore (Figura 1E). NOTA: Il taglio dello sterno dovrebbe essere evitato in quanto ciò danneggerebbe le principali arterie toraciche adiacenti all'osso e ridurrebbe il volume di sangue che può essere raccolto.</li>
	<li>Inserire un ago da 25 G collegato a una siringa da 1 ml nel ventricolo sinistro e raccogliere il sangue tirando delicatamente indietro lo stantuffo (Figura 1F). Per facilitare la puntura dell'ago, appoggiare delicatamente il cuore contro un paio di pinze. NOTA: Se il sangue non appare immediatamente nella siringa, l'ago deve essere ruotato lentamente e deve essere testato un angolo diverso. Tuttavia, è necessario impegnarsi per posizionare correttamente l'ago al primo tentativo per evitare di creare fori inutili nel cuore in cui il sangue può fuoriuscire.</li>
	<li>Trasferire il sangue in una provetta sterile da 1,5 ml e lasciarlo coagulare per 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il coagulo mediante centrifugazione a 2000 × g per 20 min a 4 °C. Raccogliere il surnatante, che rappresenta la frazione sierica, e conservare le aliquote monouso in provette criogeniche a -80 °C per test futuri.</li>
</ol>2. Saggio ELISA
<ol><li>Risospendere il peptide MOG35-55 liofilizzato (vedi Tabella dei materiali) in acqua per ottenere uno stock di 10 mg/mL. Prima di iniziare l'esperimento, diluire il brodo a 10 μg/mL nel tampone di rivestimento (vedere la tabella dei materiali) e pipettare 100 μL/pozzetto della soluzione finale in una piastra a 96 pozzetti. Sigillare la piastra con una pellicola adesiva per evitare l'evaporazione e incubare la piastra per una notte a 4 °C. NOTA: Devono essere calcolati almeno 2 pozzetti per ogni campione e devono essere inclusi anche 2 pozzetti aggiuntivi per un controllo in bianco.</li>
	<li>Parallelamente, rivestire lo stesso numero di pozzetti con 100 μL/pozzetto di albumina sierica bovina (BSA) disciolta nel tampone di rivestimento a una concentrazione di 10 μg/mL. Questi pozzetti aggiuntivi serviranno come controlli di fondo. NOTA: Si consiglia di rivestire con BSA i pozzetti di controllo poiché i tamponi di rivestimento e di bloccaggio hanno composizioni diverse. Si prega di notare che altri peptidi encefalitogeni (come PLP139-151 o MBP84-104) potrebbero essere utilizzati come antigeni irrilevanti in alternativa alla BSA.</li>
	<li>Il giorno dopo, lavare la piastra 3 volte con 200 μL/pozzetto di soluzione salina tampone fosfato integrata con Tween 20 allo 0,05% (PBS-T). Successivamente, aggiungere 100 μL/pozzetto di una soluzione bloccante a base di BSA al 3% in PBS (senza Tween 20) e incubare la piastra sigillata per 1 ora a 37 °C in un forno di ibridazione.</li>
	<li>Lavare la piastra 3 volte con 200 μL/pozzetto di PBS-T. Diluire ogni campione di siero 1:100 in soluzione bloccante e aggiungere 100 μL/pozzetto a entrambi i pozzetti rivestiti di MOG35-55 e BSA. Aggiungere lo stesso volume di soluzione bloccante ai pozzetti designati come spazi vuoti. Incubare la piastra sigillata per 2 ore a temperatura ambiente, agitando costantemente (250 giri/min).</li>
	<li>Lavare la piastra 3 volte con 200 μL/pozzetto di PBS-T. Diluire l'anticorpo secondario coniugato con HRP (1:2000, vedere Tabella dei materiali) in una soluzione composta da BSA allo 0,2% in PBS-T e aggiungere 100 μL/pozzetto a tutti i pozzetti. Incubare la piastra sigillata per 1 ora a temperatura ambiente, agitando costantemente (250 giri/min).</li>
	<li>Lavare la piastra 3 volte con 200 μL/pozzetto di PBS-T. Aggiungere 100 μL/pozzetto di substrato di tetrametilbenzidina (TMB) da 3,3',5' (vedi Tabella dei materiali) a tutti i pozzetti e incubare al buio per 1-5 minuti, monitorando lo sviluppo di un colore blu.<ol><li>Arrestare la reazione aggiungendo 100 μL/pozzetto di soluzione di arresto (vedere la tabella dei materiali) e misurare la densità ottica (OD) in ciascun pozzetto utilizzando un lettore di piastre impostato a una lunghezza d'onda di 450 nm. NOTA: Il substrato TMB deve essere bilanciato a temperatura ambiente per 30-60 minuti prima di aggiungerlo ai pozzetti.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Analisi dei dati
<ol><li>Compilare un foglio di calcolo Excel con i valori OD letti dalla piastra. Fare la media dei valori di OD ottenuti da pozzetti duplicati (sia rivestiti di MOG35-55 che BSA) per ciascun campione.</li>
	<li>Per ogni campione, sottrarre il valore medio dei pozzetti rivestiti di BSA da quello dei pozzetti rivestiti di MOG35-55. I valori corretti di fondo risultanti saranno proporzionali alla concentrazione di anticorpi anti-MOG35-55 nei diversi campioni di siero. NOTA: I pozzetti vuoti dovrebbero produrre valori corretti intorno a 0.</li>
	<li>Applicare un test statistico non parametrico come il test U di Mann-Whitney per confrontare i valori medi di OD tra due condizioni sperimentali. Includere almeno 3 campioni indipendenti per ciascuna condizione.</li>
</ol>

Indagine sulla risposta umorale nella demielinizzazione autoimmune

<ol>
	<li>Reich, D. S., Lucchinetti, C. F., Calabresi, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+sclerosis.">Multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 378 (2), 169-180 (2018).</li><li>Baranzini, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+cell+repertoire+diversity+and+clonal+expansion+in+multiple+sclerosis+brain+lesions.">B cell repertoire diversity and clonal expansion in multiple sclerosis brain lesions.</a> J Immunol. 163 (9), 5133-5144 (1999).</li><li>Genain, C. P., Cannella, B., Hauser, S. L., Raine, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+autoantibodies+associated+with+myelin+damage+in+multiple+sclerosis.">Identification of autoantibodies associated with myelin damage in multiple sclerosis.</a> Nat Med. 5 (2), 170-175 (1999).</li><li>Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+hypomethylation+programs+underpin+b+cell+activation+in+early+multiple+sclerosis.">Specific hypomethylation programs underpin b cell activation in early multiple sclerosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (51), e2111920118 (2021).</li><li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocrelizumab+versus+interferon+beta-1a+in+relapsing+multiple+sclerosis.">Ocrelizumab versus interferon beta-1a in relapsing multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 221-234 (2017).</li><li>Montalban, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ocrelizumab+versus+placebo+in+primary+progressive+multiple+sclerosis.">Ocrelizumab versus placebo in primary progressive multiple sclerosis.</a> N Engl J Med. 376 (3), 209-220 (2017).</li><li>Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preclinical+models+of+multiple+sclerosis:+Advantages+and+limitations+towards+better+therapies.">Preclinical models of multiple sclerosis: Advantages and limitations towards better therapies.</a> Curr Med Chem. 23 (14), 1442-1459 (2016).</li><li>Steinman, L., Zamvil, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+successfully+apply+animal+studies+in+experimental+allergic+encephalomyelitis+to+research+on+multiple+sclerosis.">How to successfully apply animal studies in experimental allergic encephalomyelitis to research on multiple sclerosis.</a> Ann Neurol. 60 (1), 12-21 (2006).</li><li>Khare, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+oligodendrocyte+glycoprotein-specific+antibodies+from+multiple+sclerosis+patients+exacerbate+disease+in+a+humanized+mouse+model.">Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific antibodies from multiple sclerosis patients exacerbate disease in a humanized mouse model.</a> J Autoimmun. 86, 104-115 (2018).</li><li>Marta, C. B., Oliver, A. R., Sweet, R. A., Pfeiffer, S. E., Ruddle, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogenic+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+antibodies+recognize+glycosylated+epitopes+and+perturb+oligodendrocyte+physiology.">Pathogenic myelin oligodendrocyte glycoprotein antibodies recognize glycosylated epitopes and perturb oligodendrocyte physiology.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (39), 13992-13997 (2005).</li><li>Flach, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoantibody-boosted+t-cell+reactivation+in+the+target+organ+triggers+manifestation+of+autoimmune+cns+disease.">Autoantibody-boosted t-cell reactivation in the target organ triggers manifestation of autoimmune cns disease.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), 3323-3328 (2016).</li><li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ataxin-1+regulates+b+cell+function+and+the+severity+of+autoimmune+experimental+encephalomyelitis.">Ataxin-1 regulates b cell function and the severity of autoimmune experimental encephalomyelitis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (38), 23742-23750 (2020).</li><li>Didonna, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex-specific+tau+methylation+patterns+and+synaptic+transcriptional+alterations+are+associated+with+neural+vulnerability+during+chronic+neuroinflammation.">Sex-specific tau methylation patterns and synaptic transcriptional alterations are associated with neural vulnerability during chronic neuroinflammation.</a> J Autoimmun. 101, 56-69 (2019).</li><li>Ma, Q., Matsunaga, A., Ho, B., Oksenberg, J. R., Didonna, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte-specific+argonaute+profiling+identifies+micrornas+associated+with+experimental+autoimmune+encephalomyelitis.">Oligodendrocyte-specific argonaute profiling identifies micrornas associated with experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 297 (2020).</li><li>Lanz, T. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clonally+expanded+b+cells+in+multiple+sclerosis+bind+ebv+ebna1+and+glialcam.">Clonally expanded b cells in multiple sclerosis bind ebv ebna1 and glialcam.</a> Nature. 603 (7900), 321-327 (2022).</li></ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Qui, è stato riportato un protocollo basato su ELISA semplice ed efficiente per quantificare accuratamente la risposta umorale in un modello animale rilevante di patologia della SM. Questo metodo è stato recentemente impiegato per descrivere il nuovo ruolo della proteina atassina-1 nel controllo dei livelli sierici di autoanticorpi nel paradigma EAE MOG35-55/C57BL6J12. A questo proposito, è necessario prendere in considerazione una serie di fattori, al fine di ottenere risultati coerenti e biol...

La sclerosi multipla (SM) è una malattia autoimmune cronica del sistema nervoso centrale (SNC) caratterizzata da infiltrazione focale di cellule immunitarie nel parenchima cerebrale, rottura delle guaine mieliniche che avvolgono gli assoni, attivazione della glia e perdita neuronale1. Oltre al ruolo ben consolidato delle cellule T patogene, molteplici linee di evidenza hanno evidenziato il coinvolgimento delle cellule B nella mediazione della risposta autoimmune contro il SNC. Le cellule B subiscono un'espansione clonale nel cervello della SM e sono stati rilevati anticorpi contro i componenti della mielina all'interno delle lesioni demieliniche 2,3. L'attivazione selettiva delle cellule B periferiche all'esordio della malattia è stata recentemente documentata, suggerendo un ruolo putativo per questo compartimento immunitario anche nell'inizio della malattia4. Il successo delle terapie che depleiscono le cellule B come gli anticorpi monoclonali anti-CD20 corrobora ulteriormente la connessione meccanicistica tra il funzionamento aberrante delle cellule B e la demielinizzazione autoimmune 5,6. Da un punto di vista molecolare, le cellule B possono contribuire alla malattia attraverso la presentazione di autoantigeni, la secrezione di citochine pro-infiammatorie e la produzione di anticorpi autoreattivi.
Sono stati sviluppati diversi modelli animali per ricapitolare caratteristiche specifiche del fenotipo complesso della SM. Tra questi, l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è il paradigma più utilizzato in vivo e si basa sull'immunizzazione di animali da esperimento con peptidi corti derivati da proteine mieliniche come la glicoproteina oligodendrocitaria mielina (MOG) e la proteina basica della mielina (MBP)7. Gli animali immunizzati con EAE sviluppano una patologia demielinizzante che assomiglia alla SM in molti aspetti, inclusa una robusta risposta umorale contro il peptide encefalitogeno8. Per questo motivo, gli studi EAE sono stati determinanti per sezionare la funzione delle cellule B e degli autoanticorpi nel contesto della malattia. Ad esempio, è stato dimostrato che gli anticorpi specifici per MOG isolati da pazienti con SM possono aggravare il decorso clinico nei modelli EAE9. In particolare, il residuo di prolina in posizione 42 nel MOG umano si è dimostrato fondamentale per determinare la patogenicità degli autoanticorpi10. Più recentemente, è stato scoperto che gli autoanticorpi specifici per MOG promuovono la malattia non solo mediando la perdita di mielina, ma anche aumentando la riattivazione delle cellule T autoreattive all'interno del SNC11. 
Considerando l'importanza delle risposte anticorpali nell'autoimmunità del SNC, questo articolo presenta un protocollo basato su ELISA per misurare in modo efficiente i livelli sierici di anticorpi autoreattivi nei topi C57BL/6J EAE immunizzati con peptide MOG35-55. Nella prima parte del protocollo verrà descritto il metodo per raccogliere il siero tramite puntura intracardiaca. Successivamente verranno dettagliate le procedure per impostare il test ELISA e acquisire i dati. Infine, verranno discusse l'analisi e l'interpretazione dei dati.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needles</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39;,5,5&#39;-tetramethylbenzidine (TMB) substrate</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N301</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive seals</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>AB0558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6J female mice</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>000664</td>
			<td>Animals between 8-10 weeks of age should be used for EAE experiments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogenic tubes</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>10-500-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection tray</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S111022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissector scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14082-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA coating buffer</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>421701</td>
			<td>Store at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel software</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Analysis spreadsheet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11152-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Mouse IgG, Human ads-HRP</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>1030-05</td>
			<td>Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light source</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>AMPSILED21</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microplate reader</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>14-377-575&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Molecular biology grade water</td>
			<td>Corning</td>
			<td>46-000-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse MOG35-55 peptide</td>
			<td>EZBiolab</td>
			<td>cp7203</td>
			<td>Store at -80 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multichannel pipette</td>
			<td>Axygen</td>
			<td>AP-12-200-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Noyes spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15011-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp 96-well plates</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>423501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>88-861-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>VWR</td>
			<td>445-0024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated tabletop centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>75002441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stop solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>N600</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1706531</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantification of autoreactive antibodies in mice upon experimental autoimmune encephalomyelitis

L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello di malattia che ricapitola la malattia autoimmune della sclerosi multipla (SM) a livello istopatologico e molecolare. L'EAE è indotto dall'immunizzazione di animali da esperimento tramite iniezione sottocutanea di peptidi di mielina corta insieme a coadiuvanti specifici per aumentare la risposta immunitaria. Come la controparte umana, i topi EAE sviluppano lesioni demielinizzanti, infiltrazione di cellule immunitarie nel sistema nervoso centrale (SNC), attivazione della glia e danno neuronale. Un corpo coerente di prove supporta anche un ruolo meccanicistico per la disfunzione delle cellule B nell'eziologia sia della SM che dell'EAE. Le cellule B possono fungere da cellule presentanti l'antigene e da fonte primaria di citochine pro-infiammatorie e autoanticorpi. Nell'EAE, vengono generati anticorpi contro i peptidi mielinici che sono stati impiegati per indurre la malattia. È stato dimostrato che tali autoanticorpi mediano la perdita di mielina o la riattivazione delle cellule T patogene nel SNC. Questo articolo descrive un efficiente protocollo basato su ELISA per quantificare gli autoanticorpi nel siero di topi C57BL/6J immunizzati con il peptide della glicoproteina 35-55 degli oligodendrociti mielinici (MOG35-55). Il metodo proposto funge da potente strumento per studiare la specificità e l'entità della risposta umorale aberrante nel contesto della demielinizzazione autoimmune.

Multiple sclerosis (MS) is a chronic autoimmune disease of the central nervous system (CNS) characterized by focal infiltration of immune cells into the brain parenchyma, breakdown of myelin sheaths wrapping axons, glia activation, and neuronal loss1. In addition to the well-established role of pathogenic T cells, multiple lines of evidence have highlighted the involvement of B cells in mediating the autoimmune response against the CNS. B cells undergo clonal expansion in the MS brain and antibodies against myelin components have been detected within demyelinated lesions2,3. The selective activation of peripheral B cells at disease onset has been recently documented, suggesting a putative role for this immune cell compartment in disease initiation as well4. The success of B cell-depleting therapies such as anti-CD20 monoclonal antibodies further corroborates the mechanistic connection between aberrant B cell functioning and autoimmune demyelination5,6. From a molecular standpoint, B cells can contribute to disease via autoantigen presentation, pro-inflammatory cytokine secretion, and autoreactive antibody production.
Multiple animal models have been developed to recapitulate specific features of the complex MS phenotype. Among them, experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most widely used in vivo paradigm and relies on the immunization of experimental animals with short peptides derived from myelin proteins such as myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) and myelin basic protein (MBP)7. EAE immunized animals develop a demyelinating pathology that resembles MS in many aspects, including a robust humoral response against the encephalitogenic peptide8. For this reason, EAE studies have been instrumental in dissecting the function of B cells and autoantibodies in the context of disease. For instance, it was demonstrated that MOG-specific antibodies isolated from MS patients can aggravate the clinical course in EAE models9. Notably, the proline residue at position 42 in human MOG was shown to be critical for determining autoantibody pathogenicity10. More recently, MOG-specific autoantibodies have been found to promote disease not only by mediating myelin loss but also via boosting the reactivation of autoreactive T cells within the CNS11. 
Considering the importance of antibody responses in CNS autoimmunity, this article presents an ELISA-based protocol to efficiently measure the serum levels of autoreactive antibodies in C57BL/6J mice EAE immunized with MOG35-55 peptide. In the first part of the protocol, the method to collect serum via intracardiac puncture will be described. Subsequently, the procedures to set up the ELISA assay and acquire the data will be detailed. Lastly, data analysis and interpretation will be discussed.

Autore in primo piano: Nuovo test per lo studio delle risposte delle cellule B nella ricerca sulla sclerosi multipla

Quantificazione degli anticorpi autoreattivi nei topi dopo encefalomielite autoimmune sperimentale

So the focus of our laboratory is to understand the molecular basis of multiple sclerosis, a immune disease of the central nervous system that is characterized by demyelination, neuroinflammation, and axonal injury. So this protocol represent an economical and flexible alternatives to commercial kits. Our can be easily adjusted to test B-cell antibody responses against different EEA peptides.My lab is devoted to further understanding the connection between neuroinflammation and neurodegeneration in chronic neurological diseases such as multiple sclerosis.

Per dimostrare la robustezza del presente test ELISA, il metodo è stato testato su campioni di siero isolati da una coorte di topi femmina C57BL/6J a 20 giorni dopo l'immunizzazione (dpi) con 100 μg di peptide MOG35-55 nell'adiuvante di Freund completo (CFA) seguendo un protocollo di induzione EAE convalidato 12,13,14. Gli animali hanno anche ricevuto 400 ng di tossina della pertosse nei giorni 0 e 2. I campioni di siero di an...

Watch this Scientific Journal Video about Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice upon Experimental Autoimmune Encephalomyelitis at JoVE.com

L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) è un modello animale di sclerosi multipla (SM), che condivide con la malattia umana una robusta risposta autoimmune umorale. Qui, riportiamo un protocollo ELISA semplice e flessibile per quantificare gli autoanticorpi nel siero di topi immunizzati con EAE.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a disease model that recapitulates the autoimmune disorder multiple sclerosis (MS) at histopathological ...

Quindi l'obiettivo del nostro laboratorio è comprendere le basi molecolari della sclerosi multipla, una malattia immunitaria del sistema nervoso centrale caratterizzata da demielinizzazione, neuroinfiammazione e danno assonale. Questo protocollo rappresenta quindi un'alternativa economica e flessibile ai kit commerciali. Il nostro può essere facilmente regolato per testare le risposte anticorpali delle cellule B contro diversi peptidi EEA.Il mio laboratorio è dedicato a comprendere ulteriormente la connessione tra neuroinfiammazione e neurodegenerazione nelle malattie neurologiche croniche come la sclerosi multipla.

quantification-autoreactive-antibodies-mice-upon-experimental

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice upon Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

499 Views.  East Carolina University. Quindi l'obiettivo del nostro laboratorio è comprendere le basi molecolari della sclerosi multipla, una malattia immunitaria del sistema nervoso centrale caratterizzata da demielinizzazione, neuroinfiammazione e danno assonale. Questo protocollo rappresenta quindi un'alternativa economica e flessibile ai kit commerciali. Il nostro può essere facilmente regolato per testare le risposte anticorpali delle cellule B contro diversi peptidi EEA.Il mio laboratorio è dedicato a comprendere ...

Video: Autore in primo piano: Nuovo test per lo studio delle risposte delle cellule B nella ricerca sulla sclerosi multipla

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a disease model that recapitulates the autoimmune disorder multiple sclerosis (MS) at histopathological and molecular levels. EAE is induced by immunizing experimental animals via subcutaneous injection of short myelin peptides together with specific adjuvants to boost the immune response. Like the human counterpart, EAE mice develop demyelinating lesions, immune cell infiltration into the central nervous system (CNS), glia activation and neuronal injury. A consistent body of evidence also supports a mechanistic role for B cell dysfunction in the etiology of both MS and EAE. B cells can serve as antigen-presenting cells as well as a primary source of pro-inflammatory cytokines and autoantibodies. In EAE, antibodies are generated against the myelin peptides that were employed to induce the disease. Such autoantibodies have been shown to mediate either myelin loss or pathogenic T cell reactivation into the CNS. This article describes an efficient ELISA-based protocol to quantify autoantibodies in the serum of C57BL/6J mice immunized with the myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 (MOG35-55) peptide. The proposed method serves as a powerful tool to investigate the specificity and magnitude of the aberrant humoral response in the context of autoimmune demyelination.

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an animal model of multiple sclerosis (MS), which shares with the human disease a robust humoral autoimmune response. Here, we report a simple and flexible ELISA protocol to quantify autoantibodies in the serum of EAE immunized mice.

Ricerca

Immunologia e infezioni

Serum Collection via Intracardiac Puncture in Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) Immunized Mice

Raccolta del siero tramite puntura intracardiaca in topi immunizzati con encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE)

Quantification of Autoantibodies in the Serum of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Immunized Mice Using ELISA

Begin by re-suspending the lyophilized MOG 35 55 peptide in water. Dilute the peptide stock to 10 micrograms per milliliter in coating buffer before the experiment. Now pipette 100 microliters of the final solution into wells of a 96 well plate.Simultaneously coat an equal number of wells with 100 microliters of BSA dissolved in coating buffer. Seal the plate with an adhesive film to prevent evaporation and incubate the plate overnight at four degrees Celsius. The next day, perform three washes of the plate with 200 microliters of PBS supplemented with 0.5%tween 20.Subsequently add 100 microliters per well of a blocking solution composed of 3%BSA in PBS. Incubate the sealed plate for one hour at 37 degrees Celsius in a hybridization oven. After incubation, wash the plate three times with 200 microliters per well of PBST.Dilute each serum sample obtained from the blood of EAE immunized mice in blocking solution and add 100 microliters per well to both MOG 35 55 and BSA coated wells. Add the same volume of blocking solution to designated blank wells. Incubate the sealed plate for two hours at room temperature with constant shaking.After incubation, remove the plate from the incubator and rinse the plate three times with 200 microliters per well of PBST. Dilute the HRP conjugated secondary antibody in a solution consisting of 0.2%BSA in PBST and add 100 microliters to each well. Incubate the sealed plate for one hour at room temperature maintaining constant shaking.Wash the plate three times with 200 microliters per well of PBST. Add 100 microliters of three, three prime, five, five prime tetramethyl benzidine substrate to each well. Incubate in the dark for one to five minutes monitoring the development of a blue color.Add 100 microliters of stop solution to each well. Then use a plate reader set at a wavelength of 450 nanometers to measure the optical density in each well. The optical density values of the EAE samples were significantly higher than the control samples indicating a robust immunoglobulin G response against the MOG peptide.