Questo lavoro è finanziato dal programma Young Investigator Research, dal Centro di ricerca sulle malattie infettive (ZINF) presso l&#39;Università di Würzburg. Juan Garcia-C Betancur è un collega dottorato di ricerca presso la Graduate School of Life Sciences (GSLS) dell&#39;Università di Würzburg.

1. Etichettatura B. subtilis e formazione di analisi Biofilm <ol><li> Amplificazione PCR dalla regione del promotore del gene di interesse. Si mostra come esempio la clonazione di P tapa, il promotore dei geni responsabili per la produzione di proteina Tasa matrice 26. Clone P tapa in pkm008 vettore (creato dal laboratorio di Rudner, Harvard Medical School. Boston, USA) (Fig. 2). </li><li> Linearizzare i plasmidi per digestione enzimatica (Enzyme consigliato, XhoI). </li><li> Indurre la competenza naturale in B. subtilis ceppo 168 seguendo il one-step protocollo precedentemente descritto da Harwood e Taglio 27. </li><li> Aggiungere i plasmidi linearizzate nella cultura di cellule competenti e selezionate per la resistenza spectinomicina dopo due ore di incubazione. </li><li> I ceppi ottenuti hanno inserito il costrutto nel locus amyE neutro di B. subtilis di ricombinazione doppia (Fig. 4). Per creareun ceppo a doppia etichetta, integrare il secondo reporter nel Laca locus neutro utilizzando il plasmide pDR183 vi presentiamo nella figura 3. Inserire questo reporter utilizzando la stessa tecnica sopra descritta per l&#39;inserimento di reporter clonato in pKM008. </li><li> Trasferire la reporter del ceppo 168 di NCIB3610 che è in grado di formare biofilm. Utilizzare il protocollo di trasduzione del fago SPP1 28,29. Crescere ceppo donatore in TY medio (LB +10 mm MgSO 4 +10 pM MnSO 4). Mescolare 200 microlitri della cultura con 100 microlitri di diluizione magazzino fago. Aggiungere 3 ml di agar morbido dopo 30 minuti di incubazione e permettono aloni fago sorgere a 37 ° C. </li><li> Raccogliere l&#39;agar molle. Centrifugare e passare il surnatante pensato che una siringa da 0,22 micron filtro. Utilizzare questo surnatante per infettare una cultura del ceppo ricevente coltivate in terreno TY. Aggiungere 30 microlitri a 10 ml di 1:10 coltura diluita. Incubare per 30 minuti e selezionare per la resistenza antibiotica dopo 24 h di incubazione. </li><li> Sezionare una colonia e crescere durante la notte il LB a 37 ° C. </li><li> Spot 3 pl della cultura durante la notte su una solida biofilm che induce medie MSgg 1,5% agar 30. Permettere alle cellule di crescere durante 72 ore a 30 ° C (Figura 3). Dopo tre giorni di crescita, biofilm formate sulla superficie di agar MSgg sviluppato un&#39;architettura complessa morfologica nella superficie del agar. </li></ol> 2. Biofilm Dispersione e fissazione cellulare <ol><li> Rimuovere il modulo di biofilm sulla superficie del agar MSgg con uno stuzzicadenti o una pinzetta. La consistenza del biofilm dovrebbe consentire di staccatelo dalla superficie di agar in un unico pezzo. </li><li> Posizionare il biofilm in 3 ml di tampone PBS e disperdere il biofilm da ripetitivo passaggio attraverso una pipetta o un ago. In alternativa, la dispersione biofilm può essere fatto utilizzando sonicazione lieve. Sonicazione Mild richiede 12 impulsi con una potenza di 3 e ampiezza di 0,7 secondi. </li><li> Fissare i campioni prima cella singola analisi. Resuspend 300 microlitri della sospensione di cellule in 1 ml di soluzione di paraformaldeide al 4% ed incubare a temperatura ambiente per sette minuti. Composizione della soluzione di paraformaldeide al 4%: 2 g di paraformaldeide 50 ml di tampone PBS 4 microlitri 10 N NaOH Filtrare la soluzione attraverso un filtro a 0,22 um e aliquota </li><li> Lavare le cellule dopo fissazione in tampone PBS tre volte e risospendere in 300 ul di tampone PBS. </li></ol> 3. Microscopia a fluorescenza <ol><li> Versare 200 microlitri di 0.8% agarosio su un vetrino da microscopio e con attenzione coprire con un&#39;altra diapositiva. Rimuovere la slitta superiore dolcemente dopo 2 minuti per ottenere uno strato di agarosio attaccato alla slitta del fondo. </li><li> Spot 2 microlitri di cellule fissate sulla superficie dello strato di agarosio e coprire con un vetro di copertura microscopio. </li><li> Porre il campione nel microscopio a fluorescenza. Usiamo un microscopio a fluorescenza Leica DMI6000B dotato di un CRT6000 Leica iIluminatione sistema. I filtri per YFP sono Ex: BP500/20, Em: BP535/30 e per CFP sono Ex: BP426/20, Em: 480/40 </li><li> Esporre il campione un fluorescenza eccitazione tra 50-200 ms. Impostare il periodo di eccitazione in base a un controllo negativo che non mostra fluorescenza nelle condizioni selezionate per l&#39;esperimento. </li><li> Vedere l&#39;immagine di fluorescenza alla stessa immagine ottenuta con campo chiaro. Unire le due immagini in un&#39;unica immagine. I risultati ottenuti dal flusso microscopia a fluorescenza utilizzando un unico ceppo marcato ospitante il reporter sono rappresentati P tapa-YFP in figura 6. </li></ol> 4. La quantificazione delle singole cellule in citometria a flusso <ol><li> Disperdere il campione di cellule fissate con sonicazione mite. Sonicare il campione eseguendo 2 serie di impulsi 12 con una potenza di 5 e ampiezza di 0,7 secondi, per disperdere aggregati nelle cellule singole senza causare la lisi cellulare. Verificare l&#39;efficienza di dispersione cellulare mediante microscopia ottica. </li&gt; <li> Diluire il campione 1:100 in tampone PBS prima dell&#39;analisi in citometria a flusso. Usiamo un citometro a flusso BD FACS Canto II. Per YFP fluorescenza, utilizzare un laser di eccitazione a 488 nm accoppiato con un 530/30 del filtro. Per CFP fluorescenza, utilizzare l&#39;eccitazione laser a 405 nm accoppiato con un 408/40 filtro. </li><li> Calibrare la macchina citometro a flusso con due controlli negativi. Un campione di tampone PBS privo di cellule in sospensione dovrebbe servire come controllo negativo per la dimensione delle particelle rilevata dal citometro a flusso. Un campione marcato con nessun reporter fluorescenza deve essere servire come controllo negativo per la sensibilità fluorescenza del citometro a flusso. </li><li> Collocare il campione etichettato con il reporter fluorescente nel citometro a flusso. Per ciascun campione, analizzare almeno 50.000 eventi con una portata tra 300 e 3000 eventi al secondo. </li><li> Acquisizione dati utilizzando FACS Diva software (BD Biosciences) e analizzare utilizzando FlowJo 8.5.2 del software. Vedere segnali di fluorescenza al controllo che mostranos no fluorescenza. </li><li> Presentare i dati del monitoraggio del segnale di fluorescenza di un singolo ceppo marcato in uno dei due assi grafica. Tracciare il segnale di fluorescenza rilevato l&#39;asse X e il numero di cellule che esprimono i diversi livelli di fluorescenza sull&#39;asse Y. I risultati ottenuti dall&#39;analisi citometria a flusso utilizzando un unico ceppo marcato ospitante il reporter sono rappresentati P tapa-YFP in figura 8. </li><li> Presentare i dati del monitoraggio del segnale di fluorescenza di un ceppo doppio etichettati in tre assi grafica. Tracciare il segnale di fluorescenza di ciascuno dei canali monitorati in assi X e Y (per esempio, GFP potrebbe essere misurato l&#39;asse X e PCP nel asse Y). Plot in asse Z il numero di cellule che esprimono ciascuna reporter e presentano come isolines contorno che sarebbero perpendicolare al piano del foglio (Fig. 9 e 10). </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Quando B. subtilis cresce su un piatto della biofilm che induce MSgg mezzo, la formazione di biofilm si osserva dopo tre giorni di incubazione a 30 ° C 30. Il biofilm mostra consistenza forte e può essere staccata dalla superficie di agar in un unico pezzo. Inoltre, il biofilm mostra un&#39;architettura complessa morfologica che è indicativo delle sottopopolazioni di cellule aderenti distinti (Fig. 5). Ad esempio, la produzione della matrice extracellulare in biofilm risultato la formazione di rughe sulla superficie della colonia. Questa funzione può essere correlata con la differenziazione della sottopopolazione di produttori matrice 19. Analogamente, l&#39;aumento di strutture aeree sulla superficie del biofilm è indicativa della presenza di una sottopopolazione di cellule sporulanti, poiché le spore localizzato nella zona apicale di queste strutture 30. Esempi di visualizzazione del differenziamento cellulare in un unico marcato e un ceppo doppio marcato utilizzando microscopia a fluorescenza sono represented in figura 6 e 7, rispettivamente. L&#39;unico ceppo marcato ospita la reporter fluorescente P tapa-CFP, che si esprime nella sottopopolazione di cellule produttrici di matrice. Questa sottopopolazione è responsabile di produrre e secernere la matrice extracellulare che costituisce il biofilm (Fig. 6). Il ceppo doppio etichettato ospita il giornalista P tapa CFP-26 e il giornalista ulteriori P srfAA YFP-31. Questo secondo reporter permette di monitorare la sottopopolazione di cellule responsabili di secernere la surfattina molecola di segnalazione, che innesca la cascata di segnalazione per la differenziazione dei produttori matrice (Fig. 7). Sottopopolazione dei produttori di matrice sono false colorati in blu, mentre la sottopopolazione di produttori surfattina è falso colorata in giallo. Analisi di citometria a flusso utilizzando un unico ceppo marcato ospitare il reporter P tapa-YFP è presentato in figura 8. Ceppo di controllo non trattato non ospitarei geni delle proteine ​​fluorescenti ha mostrato una singola fluorescenza popolazione relativamente basso. Cellule che ospitano P tapa-YFP non in biofilm che inducono condizioni di non differenziare la sottopopolazione di matrice produttori e l&#39;intera popolazione ha mostrato un basso fluorescenza relativa. In biofilm che inducono condizione, una sottopopolazione di cellule con alta fluorescenza relativa è verificato, osservato come una spalla destra del picco relativa bassa fluorescenza 23. I risultati ottenuti dall&#39;analisi citometria a flusso utilizzando un ceppo doppio marcato sono rappresentati in figura 9 e 10. Figura 9 monitorato le sottopopolazioni di matrice produttori e dei produttori surfattina utilizzando il doppio etichettato strain P tapa-PCP, P srfAA-YFP. Poiché il controllo di fluorescenza di fondo è stato utilizzato un ceppo non nutrire alcun geni delle proteine ​​fluorescenti. Successivamente, abbiamo rilevato di ciascuna delle sottopopolazioni di produttori della matrice e produttori surfattina in ogni canale di fluorescenza, utilizzando unico ceppo marcato<html> s come controlli. Il doppio etichettato strain P tapa-PCP, P srfAA-YFP ha mostrato due sottopopolazioni di cellule che esprimono alti livelli di i giornalisti fluorescenti. Ogni popolazione è incorniciato, dimostrando che non vi è alcuna sovrapposizione nella espressione dei giornalisti tra le due sottopopolazioni di cellule specializzate 15. Analogamente, l&#39;analisi mediante citometria a flusso doppio marcato ceppo P SKF-YFP, P-tapa YFP è presentato in figura 10. Il reporter per la SKF gene controlla la differenziazione della sottopopolazione di cannibali 32, che è stato descritto per differenziare coordinatamente con la sottopopolazione di produttori di matrice 24. In questo caso, il ceppo doppio marcato mostrato un&#39;unica sottopopolazione di cellule fluorescenti che esprimono sia YFP e PCP. Ciò indica che entrambe le vie della differenziazione delle cellule vengono attivate in modo coordinato sottopopolazione stessa. 1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Schema generale della Experiment. Il protocollo è diviso in tre fasi principali. La prima fase prevede l&#39;etichettatura il ceppo di B. subtilis con la fusione giornalista che controlla la sottopopolazione di interesse. In secondo luogo, crescere i ceppi identificati in biofilm che inducono condizioni. In terzo luogo, disperdere il biofilm ed effettuare singola cella di analisi della popolazione con microscopio a fluorescenza e citometria a flusso. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig2.jpg" /> Figura 2. Rappresentazione schematica del vettore pKM008 integrazione. Questo vettore integra la fusione giornalista di interesse nel amyE locus neutro dalla ricombinazione doppio. Il promotore di interesse (P tapa) viene clonato nel vettore utilizzando siti di restrizione EcoRI e HindIII. Quindi, l&#39;espressione del gene PCP è sotto il controllo del promotore P tapa. L&#39;Orientationione dei geni nel plasmide è rappresentato come una freccia. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig3.jpg" /> Figura 3. Rappresentazione schematica del vettore di integrazione pDR183. Questo vettore integra la fusione giornalista di interesse nel locus neutro Laca mediante ricombinazione doppio. La fusione di interesse (P tapa - PCP) è clonato nel vettore utilizzando la restrizione siti EcoRI e BamHI. L&#39;orientamento dei geni del plasmide è rappresentato come una freccia. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig4.jpg" /> Figura 4. Schema di integrazione dei reporter nel cromosoma di B. subtilis di ricombinazione doppia. (A) B. cromosoma subtilis ha due loci neutrali, amyE e Laca, per integrare fusioni reporter senza compromettere lo sviluppo del biofilm. (B) B. subtilis di ricombinazione doppia. La fusione giornalista integra nel locus neutro in modo stabile. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig5.jpg" /> Figura 5. Formazione di biofilm di B. subtilis NCIB3610. processo di formazione bioflm del ceppo B. subtilis NCIB 3610 quando cresce il biofilm che induce MSgg medium nel corso di tre giorni a 30 ° C. Immagini sequenziali di sviluppo del biofilm sono stati prelevati ogni 12 ore. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig6.jpg" /> Figura 6. Visualizzazione della sottopopolazione di produttori matrice al microscopio a fluorescenza. Un campione di un biofilm di B. subtilis P tapa - cfp è stato fissato ed esaminato al microscopio a fluorescenza. 200 ms di fluorescenzaeccitazione evidenziato una sottopopolazione di cellule che emettono fluorescenza superiore rispetto al resto delle cellule. Abbiamo considerato questa sottopopolazione come la sottopopolazione di cellule produttrici di matrice. Barra della scala è di 3 micron. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig7.jpg" /> Figura 7. Visualizzazione della sottopopolazione di matrice produttori e produttori surfattina sotto il microscopio a fluorescenza. Campione da un biofilm della B. subtilis P tapa-cfp, P srfAA-YFP ceppo doppio marcato è stato fissato ed esaminato al microscopio a fluorescenza. Tempo di esposizione di 250 ms evidenziato due sottopopolazioni di cellule che emettono fluorescenza superiore rispetto al resto delle cellule. Una sottopopolazione espresso YFP ed è stato rilevato utilizzando esclusivamente il canale YFP (false colorata in giallo). Questa è la sottopopolazione di produttori di surfattina. Un&#39;altra sottopopolazione espresso CFP ed è stato rilevato utilizzando esclusivamente la Chann PCP<html> el. Questa è la sottopopolazione di produttori matrice. Barra della scala è di 3 micron. <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig8.jpg" /> Figura 8. Quantificazione della sottopopolazione di produttori matrice 2-D usando citometria di flusso. Dispersed cellule di un biofilm di B. subtilis P tapa-YFP sono stati monitorati in citometria a flusso. Il citometro a flusso contato 50.000 eventi e il segnale di fluorescenza per ogni evento è stato monitorato. Numero di cellule contate è tracciata in asse Y, mentre l&#39;intensità del segnale YFP viene tracciata sull&#39;asse X. Le cellule sono state coltivate in terreno LB per ottenere non biofilm condizioni che inducono. Le cellule sono state coltivate in mezzo MSgg per ottenere biofilm che inducono condizioni. La sottopopolazione dei produttori matrice differenzia solo nel biofilm che inducono condizioni. Questo dato è stato adattato da López et al., PNAS (2009) 106 :280-285. s/ftp_upload/3796/3796fig9.jpg &quot;/&gt; Figura 9. Quantificazione della sottopopolazione di produttori matrice e dei produttori surfattina utilizzando 3-D citometria a flusso. Segnale di fluorescenza dei canali monitorati sono presentati nell&#39;asse X (per YFP) e l&#39;asse Y (per PCP). L&#39;asse Z misura il numero di cellule che esprimono ciascuna reporter e viene quantificata come isolines contorno perpendicolari al piano della carta. Il numero di eventi monitorati in questo esperimento era 50.000 eventi. Sinistra pannello superiore presenta un controllo di fluorescenza di fondo non ospitare geni delle proteine ​​fluorescenti. Diritto pannello superiore rileva la sottopopolazione di produttori surfattina in fluorescenza YFP canale (incorniciata in giallo) utilizzando un unico marcato ceppo P srfAA-YFP. Pannello in basso a sinistra rileva la sottopopolazione di produttori di matrice politica comune della pesca nel canale di fluorescenza (incorniciato in blu) utilizzando un unico ceppo marcato P tapa-CFP. Il doppio etichettato strain tapa P &lt;/ Em&gt;-PCP, P srfAA-YFP è monitorata nel pannello in basso a destra. Ha dimostrato due sottopopolazioni che sono incorniciate in giallo e blu. Questo dato è stato adattato da López et al., Geni e lo sviluppo (2009) 23 :1631-1638. <img alt="Figura 10" src="/files/ftp_upload/3796/3796fig10.jpg" /> Figura 10. Quantificazione della sottopopolazione di produttori matrice e cannibali utilizzando 3-D citometria a flusso. Segnale di fluorescenza dei canali monitorati sono presentati nell&#39;asse X (per YFP) e l&#39;asse Y (per PCP). Il numero di eventi monitorati in questo esperimento era 50,000. Diritto pannello superiore rileva la sottopopolazione di cannibali in fluorescenza YFP canale (incorniciata in giallo) in un unico marcato ceppo P SKF-YFP. Pannello in basso a sinistra rileva la sottopopolazione di produttori di matrice politica comune della pesca nel canale di fluorescenza (incorniciato in blu) in un unico ceppo marcato P tapa-CFP. Il double marcato ceppo P tapa-PCP, P SKF-YFP ha mostrato solo una sottopopolazione di cellule in diagonale per gli assi X e Y (incorniciato in verde). Questa sottopopolazione viene rilevato nel canale YFP e CFP, perché esprime i due reporter contemporaneamente. López et al. Geni e sviluppo (2009) 23 :1631-1638.

<ol>
	<li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview+of+microbial+biofilms.">Overview of microbial biofilms.</a> J. Ind. Microbiol. 15, 137-140 (1995).</li><li>Davey, M. E., O'Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microbial+biofilms:+from+ecology+to+molecular+genetics.">Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics.</a> Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64, 847-867 (2000).</li><li>Kolenbrander, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+microbial+communities:+biofilms,+interactions,+and+genetic+systems.">Oral microbial communities: biofilms, interactions, and genetic systems.</a> Annu. Rev. Microbiol. 54, 413-437 (2000).</li><li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+as+microbial+development.">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu. Rev. Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li><li>Donlan, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+microbial+life+on+surfaces.">Biofilms: microbial life on surfaces.</a> Emerg. Infect. Dis. 8, 881-890 (2002).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms.">Biofilms.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2, a000398-a000398 (2010).</li><li>Branda, S. S., Vik, S., Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilms:+the+matrix+revisited.">Biofilms: the matrix revisited.</a> Trends Microbiol. 13, 20-26 (2005).</li><li>Branda, S. S., Chu, F., Kearns, D. B., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+major+protein+component+of+the+Bacillus+subtilis+biofilm+matrix.">A major protein component of the Bacillus subtilis biofilm matrix.</a> Mol. Microbiol. 59, 1229-1238 (2006).</li><li>Latasa, C., Solano, C., Penades, J. R., Lasa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm-associated+proteins.">Biofilm-associated proteins.</a> C. R. Biol. 329, 849-857 (2006).</li><li>O'Gara, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ica+and+beyond:+biofilm+mechanisms+and+regulation+in+Staphylococcus+epidermidis+and+Staphylococcus+aureus.">ica and beyond: biofilm mechanisms and regulation in Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus aureus.</a> FEMS Microbiol Lett. 270, 179-188 (2007).</li><li>Chai, Y., Chu, F., Kolter, R., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability+and+biofilm+formation+in+Bacillus+subtilis.">Bistability and biofilm formation in Bacillus subtilis.</a> Mol. Microbiol. 67, 254-263 (2008).</li><li>Chen, R., Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+sigmaD-dependent+autolysins+in+Bacillus+subtilis+population+heterogeneity.">Role of the sigmaD-dependent autolysins in Bacillus subtilis population heterogeneity.</a> J. Bacteriol. 191, 5775-5784 (2009).</li><li>Guttenplan, S. B., Blair, K. M., Kearns, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+EpsE+flagellar+clutch+is+bifunctional+and+synergizes+with+EPS+biosynthesis+to+promote+Bacillus+subtilis+biofilm+formation.">The EpsE flagellar clutch is bifunctional and synergizes with EPS biosynthesis to promote Bacillus subtilis biofilm formation.</a> PLoS Genet. 6, e1001243-e1001243 (2010).</li><li>Kearns, D. B., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+population+heterogeneity+during+growth+of+Bacillus+subtilis.">Cell population heterogeneity during growth of Bacillus subtilis.</a> Genes Dev. 19, 3083-3094 (2005).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paracrine+signaling+in+a+bacterium.">Paracrine signaling in a bacterium.</a> Genes Dev. 23, 1631-1638 (2009).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Jongbloed, J. D., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+differential+gene+expression+by+improved+cyan+fluorescent+protein+and+yellow+fluorescent+protein+production+in+Bacillus+subtilis.">Visualization of differential gene expression by improved cyan fluorescent protein and yellow fluorescent protein production in Bacillus subtilis.</a> Appl. Environ. Microbiol. 70, 6809-6815 (2004).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Hamoen, L. W., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+cell+analysis+of+gene+expression+patterns+of+competence+development+and+initiation+of+sporulation+in+Bacillus+subtilis+grown+on+chemically+defined+media.">Single cell analysis of gene expression patterns of competence development and initiation of sporulation in Bacillus subtilis grown on chemically defined media.</a> J. Appl. Microbiol. 101, 531-541 (2006).</li><li>Veening, J. W., Kuipers, O. P., Brul, S., Hellingwerf, K. J., Kort, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+phosphorelay+perturbations+on+architecture,+sporulation,+and+spore+resistance+in+biofilms+of+Bacillus+subtilis.">Effects of phosphorelay perturbations on architecture, sporulation, and spore resistance in biofilms of Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 188, 3099-3109 (2006).</li><li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community.">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22, 945-953 (2008).</li><li>Stewart, P. S., Franklin, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+heterogeneity+in+biofilms.">Physiological heterogeneity in biofilms.</a> Nat. Rev. Microbiol. 6, 199-210 (2008).</li><li>Veening, J. W., Smits, W. K., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bistability,+epigenetics,+and+bet-hedging+in+bacteria.">Bistability, epigenetics, and bet-hedging in bacteria.</a> Annu. Rev. Microbiol. 62, 193-210 (2008).</li><li>Aguilar, C., Vlamakis, H., Guzman, A., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KinD+is+a+checkpoint+protein+linking+spore+formation+to+extracellular-matrix+production+in+Bacillus+subtilis+biofilms.">KinD is a checkpoint protein linking spore formation to extracellular-matrix production in Bacillus subtilis biofilms.</a> MBio. 1, (2010).</li><li>Lopez, D., Fischbach, M. A., Chu, F., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+diverse+natural+products+that+cause+potassium+leakage+trigger+multicellularity+in+Bacillus+subtilis.">Structurally diverse natural products that cause potassium leakage trigger multicellularity in Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 280-285 (2009).</li><li>Lopez, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannibalism+enhances+biofilm+development+in+Bacillus+subtilis.">Cannibalism enhances biofilm development in Bacillus subtilis.</a> Mol. Microbiol. 74, 609-618 (2009).</li><li>Arima, K., Kakinuma, A., Tamura, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfactin,+a+crystalline+peptidelipid+surfactant+produced+by+Bacillus+subtilis:+isolation,+characterization+and+its+inhibition+of+fibrin+clot+formation.">Surfactin, a crystalline peptidelipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 31, 488-494 (1968).</li><li>Romero, D., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+accessory+protein+required+for+anchoring+and+assembly+of+amyloid+fibres+in+B.+subtilis+biofilms.">An accessory protein required for anchoring and assembly of amyloid fibres in B. subtilis biofilms.</a> Mol. Microbiol. 80, 1155-1168 (2011).</li><li>Hardwood, C. R., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biological Methods for Bacillus. , (1990).</li><li>Novick, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+systems+in+staphylococci.">Genetic systems in staphylococci.</a> Methods Enzymol. 204, 587-636 (1991).</li><li>Yasbin, R. E., Young, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transduction+in+Bacillus+subtilis+by+bacteriophage+SPP1.">Transduction in Bacillus subtilis by bacteriophage SPP1.</a> J. Virol. 14, 1343-1348 (1974).</li><li>Branda, S. S., Gonzalez-Pastor, J. E., Ben-Yehuda, S., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fruiting+body+formation+by+Bacillus+subtilis.">Fruiting body formation by Bacillus subtilis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 11621-11626 (2001).</li><li>Nakano, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=srfA+is+an+operon+required+for+surfactin+production,+competence+development,+and+efficient+sporulation+in+Bacillus+subtilis.">srfA is an operon required for surfactin production, competence development, and efficient sporulation in Bacillus subtilis.</a> J. Bacteriol. 173, 1770-1778 (1991).</li><li>Gonzalez-Pastor, J. E., Hobbs, E. C., Losick, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cannibalism+by+sporulating+bacteria.">Cannibalism by sporulating bacteria.</a> Science. 301, 510-513 (2003).</li><li>Aguilar, C., Vlamakis, H., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinking+about+Bacillus+subtilis+as+a+multicellular+organism.">Thinking about Bacillus subtilis as a multicellular organism.</a> Curr. Opin. Microbiol. 10, 638-643 (2007).</li><li>Shapiro, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thinking+about+bacterial+populations+as+multicellular+organisms.">Thinking about bacterial populations as multicellular organisms.</a> Annu. Rev. Microbiol. 52, 81-104 (1998).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Il fatto che le comunità batteriche mostrano sottopopolazioni di cellule che esprimono set specifico di geni evidenzia la complessità delle comunità microbiche 33,34. Questo protocollo dovrebbe aiutare a determinare se l&#39;espressione di un gene di interesse viene limitata a un particolare sottopopolazione di cellule specializzate nella comunità microbica. Visualizzazione di tali sottopopolazioni richiede lo sviluppo di nuove tecniche, perché i metodi tradizionali per monitorare l&#39;espressione genic...

<table border="1"><tbody><tr><td> Tecnica </td><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td rowspan="11"> MSgg composizione </td><td> fosfato di potassio 5mM </td><td> Roth </td><td> 6878 </td></tr><tr><td> 100 mM MOPS </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Cloruro di magnesio 2 mM </td><td> Roth </td><td> 2.189,1 </td></tr><tr><td> Cloruro di calcio 700μM </td><td> Roth </td><td> A119.1 </td></tr><tr><td> 50 micron cloruro ferrico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 157740 </td></tr><tr><td> Cloruro di zinco 1 pm </td><td> Applichem </td><td> A2076 </td></tr><tr><td> Tiamina 2μM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 74625 </td></tr><tr><td> Glicerolo 0,5% </td><td> Roth </td><td> 7533 </td></tr><tr><td> Glutacompagno di 0,5% </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 49621 </td></tr><tr><td> Triptofano 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T0254 </td></tr><tr><td> Fenilalanina 50μg/ml </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P2126 </td></tr><tr><td> Cella di fissaggio </td><td> Paraformaldeide </td><td> Roth </td><td> 0335 </td></tr><tr><td></td><td> Nome dell&#39;apparecchiatura </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Sonicazione </td><td> Cella Sonicator </td><td> Bandelin </td><td> D-1000 </td></tr><tr><td> Microscopia a fluorescenza </td><td> Microscopio a fluorescenza </td><td> Leica </td><td> DMI6000B </td></tr><tr><td></td><td> Nome del software </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Microscopia a fluorescenza </td> &lt;td&gt; Asaf </td><td> Leica </td><td></td></tr><tr><td> Citometria a flusso </td><td> FCASDiva </td><td> BD </td><td></td></tr><tr><td> Citometria a flusso </td><td> FlowJo </td><td> Treestar </td><td></td></tr></tbody></table>

single-cell analysis of bacillus subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry

Formazione di biofilm è un attributo per quasi tutti i batteri 1-6. Quando batteri formano biofilm, le cellule sono racchiusi nella matrice extracellulare che è prevalentemente costituito da proteine ​​e esopolisaccaridi, tra gli altri fattori 7-10. La comunità microbica racchiuso all&#39;interno del biofilm spesso mostra la differenziazione della distinta sottopopolazione di cellule specializzate 11-17. Queste sottopopolazioni coesistono e spesso mostrano organizzazione spaziale e temporale all&#39;interno del biofilm 18-21. Formazione di biofilm nel modello Bacillus subtilis richiede la differenziazione delle sottopopolazioni di cellule specializzate distinte. Tra questi, la sottopopolazione di produttori matrice, responsabili di produrre e secernere la matrice extracellulare del biofilm è essenziale per la formazione di biofilm 11,19. Pertanto, la differenziazione dei produttori matrice è una caratteristica della formazione di biofilm in B. subtilis. Abbiamo usato giornalisti fluorescenti per visualizzare e quantificare la sottopopolazione di produttori matrice in biofilm di B. subtilis 15,19,22-24. Concretamente, abbiamo osservato che la sottopopolazione di produttori matrice differenzia in risposta alla presenza di autoprodotto segnale extracellulare surfattina 25. È interessante notare, surfattina è prodotto da una sottopopolazione di cellule specializzate diverse dalla sottopopolazione di produttori matrice 15. Abbiamo riportato in questa relazione l&#39;approccio tecnico necessario per visualizzare e quantificare la sottopopolazione dei produttori e dei produttori matrice surfattina nei biofilm di B. subtilis. Per fare questo, reporter fluorescenti di geni necessari per la produzione di matrice e di produzione di surfattina sono inseriti nel cromosoma di B. subtilis. Reporter sono espressi solo in una sottopopolazione di cellule specializzate. Quindi, le sottopopolazioni possono esseremonitorata utilizzando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso (Fig. 1). Il fatto che diverse sottopopolazioni di cellule specializzate coesistono all&#39;interno delle comunità multicellulari di batteri ci dà una prospettiva diversa sulla regolazione dell&#39;espressione genica nei procarioti. Questo protocollo affronta questo fenomeno sperimentalmente e può essere facilmente adattato a qualsiasi modello di altre lavorazioni, per chiarire i meccanismi molecolari alla base eterogeneità fenotipica all&#39;interno di una comunità microbica.

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Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm microbici sono generalmente costituiti da distinti sottopopolazioni di cellule specializzate. Cella singola analisi di queste sottopopolazioni richiede l&#39;uso di reporter fluorescenti. Qui descriviamo un protocollo di visualizzare e monitorare diversi subpopulationswithin<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilm mediante microscopia a fluorescenza e citometria a flusso.

Singola cella Analisi Bacillus subtilis I biofilm usando la microscopia a fluorescenza e citometria a flusso

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

single-cell-analysis-bacillus-subtilis-biofilms-using-fluorescence

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

20.3K Views.  University of Würzburg. Biofilm microbici sono generalmente costituiti da distinti sottopopolazioni di cellule specializzate. Cella singola analisi di queste sottopopolazioni richiede l'uso di reporter fluorescenti. Qui descriviamo un protocollo di visualizzare e monitorare diversi subpopulationswithin B. subtilis Biofilm mediante microscopia a fluorescenza e citometria a flusso.

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Flow Cytometry Analysis of Immune Cells Within Murine Aortas

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam cells, immune cells, vascular endothelial and smooth muscle cells, platelets, extracellular matrix, and a lipid-rich core with extensive necrosis and fibrosis of surrounding tissues.1 The innate and adaptive arms of the immune response are involved in the initiation, development and persistence of atherosclerosis.2, 3 There is a significant body of evidence that different subsets of the immune cells, such as macrophages, dendritic cells, T and B lymphocytes, are present within the aortas of healthy and atherosclerosis-prone mice4. Additionally, immune cells are found in the surrounding aortic adventitia which suggests an important role of this tissue in atherogenesis.2
For some time, the quantitative detection of different types of immune cells, their activation status, and the cellular composition within the aortic wall was limited by RT-PCR and immunohistochemical methods for the study of atherosclerosis. Few attempts were made to perform flow cytometry using human aortas, and a number of problems, such as a high autofluorescence, have been reported5,6. Human atherosclerotic plaques were digested with collagenase 1, and free cells were collected and stained for CD14+/CD11c+ to highlight macrophage-derived foam cells. In this study, a "mock" channel was used to avoid false-positive staining.6 Necrotic materials accumulating during the digestion process give rise in a large amount of debris that generates a high autofluorescence in aortic samples. To resolve this problem, a panel of negative and positive controls has been proposed, but only double staining could be applied in these samples. We have developed a new flow cytometry-based method7 to analyze the immune cell composition and characterize the activation, proliferation, differentiation of immune cells in healthy and atherosclerosis-prone aorta. This method allows the investigation of the immune cell composition of the aortic wall and opens possibilities to use a broad spectrum of immunological methods for investigations of immune aspects of this disease.

This paper presents a flow cytometry-based method to investigate the immune composition of aortas. The paper also illustrates an additional technique that allows examining surrounding adventitia and vessel wall separately. This method opens possibilities to perform phenotypical analyses of aortic leukocytes and apply several immunological assays for atherosclerosis studies.

Analisi Citometria a flusso di cellule immunitarie all&#39;interno aorte Murine

Atherosclerosis is a chronic inflammatory process of medium and large size vessels that is characterized by the formation of plaques consisting of foam ...

Ricerca

Immunologia e infezioni

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

Cellulare Imaging in diretta di Bacillus subtilis E Streptococcus pneumoniae Utilizzando automatico Time-lapse Microscopia

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Un semplice e rapido protocollo non-enzimaticamente dissociare freschi tessuti umani per l&#39;analisi di linfociti infiltranti

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two Sprague-Dawley rats were used in this study. Animals were orally treated twice a day for two days with B. subtilis BSB3 strain or PBS. The next day after the last treatment, each group was divided and two experimental groups (one treated with PBS and one treated with B. subtilis) were placed at 45 oC for 25 min. Two control groups stayed for 25 min at room temperature. All rats were euthanized and different parameters were analyzed in all groups. Adverse effects of heat stress are registered by the decrease of villi height and total mucosal thickness in the intestinal epithelium; translocation of bacteria from the lumen; increased vesiculation of erythrocytes and elevation of the lipopolysaccharides (LPS) level in the blood. The protective efficacy of treatment is evaluated by prevention of these side effects. The protocol was set up for the oral treatment of rats with bacteria for prevention of heat stress complications, but this protocol can be modified and used for other routes of administration and for analysis of different compounds.

Prevention of Heat Stress Adverse Effects in Rats by Bacillus subtilis Strain

We described a protocol for prevention of heat stress effects in rats by oral pre-treatment with beneficial bacteria. This protocol can be modified and used for various routes of administration and for analysis of different compounds.

La prevenzione di stress termico effetti avversi nei ratti<em&gt; Bacillus subtilis</em&gt; Strain

This study was designed to evaluate the protective effect of the Bacillus subtilis strain against complications related to heat stress. Thirty-two ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Metodologie per lo studio<em&gt; B. subtilis</em&gt; I biofilm come modello per Caratterizzare piccole molecole inibitori biofilm

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Fluorescence-activated Cell Sorting for Purification of Plasmacytoid Dendritic Cells from the Mouse Bone Marrow

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method enables researchers to better understand the characteristics of a single cell population without the influence of other cells. Compared to other methods of cell enrichment, such as magnetic-activated cell sorting (MCS), FACS is more flexible and accurate for cell separation due to the ability of phenotype detection by flow cytometry. In addition, FACS is usually capable of separating multiple cell populations simultaneously, which improves the efficiency and diversity of experiments. Although FACS has some limitations, it has been broadly used to purify cells for functional studies in both in vitro and in vivo settings. Here we report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate a very rare population of immune cells, plasmacytoid dendritic cells (pDC), with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for in vitro functional studies of pDC.

We report a protocol using fluorescence-activated cell sorting to isolate plasmacytoid dendritic cells (pDC) with high purity from the bone marrow of lupus-prone mice for functional studies of pDC.

Separazione delle cellule fluorescenza-attivato per la purificazione delle cellule dendritiche plasmacitoidi dal midollo osseo di topo

Fluorescence-activated cell sorting (FACS) is a technique to purify specific cell populations based on phenotypes detected by flow cytometry. This method ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and their important role in lung development and function, as well as their lung-localized responses to infection and inflammation. To date, no unified method for identification, isolation, and handling of alveolar macrophages from humans and mice exists. Such a method is needed for studies on these important innate immune cells in various experimental settings. The method described here, which can be easily adopted by any laboratory, is a simplified approach to harvesting alveolar macrophages from bronchoalveolar lavage fluid or from lung tissue and maintaining them in vitro. Because alveolar macrophages primarily occur as adherent cells in the alveoli, the focus of this method is on dislodging them prior to harvest and identification. The lung is a highly vascularized organ, and various cell types of myeloid and lymphoid origin inhabit, interact, and are influenced by the lung microenvironment. By using the set of surface markers described here, researchers can easily and unambiguously distinguish alveolar macrophages from other leukocytes, and purify them for downstream applications. The culture method developed herein supports both human and mouse alveolar macrophages for in vitro growth, and is compatible with cellular and molecular studies.

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

This communication describes methodologies for isolation and culture of alveolar macrophages from humans and murine models for experimental purposes.

Isolamento e coltura In Vitro dei macrofagi alveolari murini ed umani

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Characterization of Human Monocyte Subsets by Whole Blood Flow Cytometry Analysis

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can have pathological significance. An ideal method for examining alterations to monocytes is whole blood flow cytometry as the minimal handling of samples by this method limits artifactual cell activation. However, many different approaches are taken to gate the monocyte subsets leading to inconsistent identification of the subsets between studies. Here we demonstrate a method using whole blood flow cytometry to identify and characterize human monocyte subsets (classical, intermediate, and non-classical). We outline how to prepare the blood samples for flow cytometry, gate the subsets (ensure contaminating cells have been removed), and determine monocyte subset expression of surface markers &#8212; in this example M1 and M2 markers. This protocol can be extended to other studies that require a standard gating method for assessing monocyte subset proportions and monocyte subset expression of other functional markers.

Here we present a protocol for characterizing monocyte subsets by whole blood flow cytometry. This includes outlining how to gate the subsets and assess their expression of surface markers and giving an example of the assessment of the expression of M1 (inflammatory) and M2 markers (anti-inflammatory).

Caratterizzazione dei sottoinsiemi di monociti umani da sangue intero flusso Cytometry analisi

Monocytes are key contributors in various inflammatory disorders and alterations to these cells, including their subset proportions and functions, can ...

Quantification of Efferocytosis by Single-cell Fluorescence Microscopy

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling and cellular processes that control efferocytosis. This quantification can be difficult to perform as apoptotic cells are often efferocytosed piecemeal, thus necessitating methods which can accurately delineate between the efferocytosed portion of an apoptotic target versus residual unengulfed cellular fragments. The approach outlined herein utilizes dual-labeling approaches to accurately quantify the dynamics of efferocytosis and efferocytic capacity of efferocytes such as macrophages. The cytosol of the apoptotic cell is labeled with a cell-tracking dye to enable monitoring of all apoptotic cell-derived materials, while surface biotinylation of the apoptotic cell allows for differentiation between internalized and non-internalized apoptotic cell fractions. The efferocytic capacity of efferocytes is determined by taking fluorescent images of live or fixed cells and quantifying the amount of bound versus internalized targets, as differentiated by streptavidin staining. This approach offers several advantages over methods such as flow cytometry, namely the accurate delineation of non-efferocytosed versus efferocytosed apoptotic cell fractions, the ability to measure efferocytic dynamics by live-cell microscopy, and the capacity to perform studies of cellular signaling in cells expressing fluorescently-labeled transgenes. Combined, the methods outlined in this protocol serve as the basis for a flexible experimental approach that can be used to accurately quantify efferocytic activity and interrogate cellular signaling pathways active during efferocytosis.

Efferocytosis, the phagocytic removal of apoptotic cells, is required to maintain homeostasis and is facilitated by receptors and signaling pathways that allow for the recognition, engulfment, and internalization of apoptotic cells. Herein, we present a fluorescence microscopy protocol for the quantification of efferocytosis and the activity of efferocytic signaling pathways.

Quantificazione del fagosoma da microscopia di fluorescenza di cella singola

Studying the regulation of efferocytosis requires methods that are able to accurately quantify the uptake of apoptotic cells and to probe the signaling ...

Preparation of Whole Bone Marrow for Mass Cytometry Analysis of Neutrophil-lineage Cells

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a myeloid-biased 39-antibody CyTOF panel to evaluate the hematopoietic system with a focus on the neutrophil-lineage cells by using this protocol. The CyTOF result was analyzed with an open-resource dimensional reduction algorithm, viSNE, and the data was presented to demonstrate the outcome of this protocol. We have discovered new neutrophil-lineage cell populations based on this protocol. This protocol of fresh whole BM preparation may be used for 1), CyTOF analysis to discover unidentified cell populations from whole BM, 2), investigating whole BM defects for patients with blood disorders such as leukemia, 3), assisting optimization of fluorescence-activated flow cytometry protocols that utilize fresh whole BM.

Here, we present a protocol to process fresh bone marrow (BM) isolated from mouse or human for high-dimensional mass cytometry (Cytometry by Time-Of-Flight, CyTOF) analysis of neutrophil-lineage cells.

Preparazione del midollo osseo intero per l'analisi della citometria di massa delle cellule di lignaggio neutrofilo

In this article, we present a protocol that is optimized to preserve neutrophil-lineage cells in fresh BM for whole BM CyTOF analysis. We utilized a ...