Questo lavoro è stato supportato anche da finanziamenti del NIH (DC007681, AB), CT cellule staminali di assegnazione (AB), Pardee fondazione (AB), Predoctoral Ruth L. Kirschstein Nazionale Research Service Awards (NRSA) (SZY), e un NSF Graduate Research Fellowship (BL). Ringraziamo i membri del laboratorio Bordey per gli utili commenti sul manoscritto. Il materiale presente è basata su un lavoro in parte sostenuto da parte dello Stato del Connecticut sotto la ricerca sulle cellule staminali Connecticut programma di sovvenzioni. I suoi contenuti sono di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente le opinioni ufficiali dello Stato del Connecticut, del Dipartimento di Sanità Pubblica dello Stato del Connecticut o TC Innovations, Incorporated.

1. Preparazione di soluzioni, Dissection, e vibratomo <ol><li> Soluzioni devono essere preparate al osmolarità corretto e pH (Tabella 1). Rispetto al fluido cerebrospinale artificiale (ACSF), dissezione soluzione viene preparata con concentrazioni minori di sodio e di calcio, e concentrazioni più elevate di magnesio. Questo per minimizzare gli effetti eccitotossicità durante l&#39;affettatura. </li><li> Entrambe le soluzioni dissezione e ACSF deve essere saturato con 95% O 2/5% di CO 2 per gorgogliamento per almeno 10 minuti per raggiungere il pH desiderato di 7,3. </li><li> Preparare un bagno di ghiaccio in un vassoio. Posizionare un piatto dissezione nel bagno di ghiaccio e riempire con la soluzione dissezione. Bolla la piastra di dissezione. </li><li> Preparare la vibratomo creando un bagno di ghiaccio. Porre la capsula di sezionamento nel bagno di ghiaccio, riempire il piatto con soluzione di dissezione, e bolla. </li><li> Riempire la fetta tenuta camera con ACSF e bolla per garantire che la soluzione sia adeguatamente areato, indipendentementefette di dove sono posizionati. </li></ol> 2. La rimozione del tessuto cerebrale Fettine di cervello acuti tendono ad essere più sano con i topi più giovani. L&#39;architettura cellulare SVZ postnatale in roditori è maturo intorno al giorno post-natale (P) 20 1. Quindi, cerchiamo di limitare i nostri esperimenti per età del mouse di P20-P30, ma abbiamo effettuato esperimenti di successo in topi vecchie come 3 mesi. La manipolazione del tessuto, si deve prestare attenzione per minimizzare i movimenti meccanici e pressione al cervello, mantenere condizioni raffreddati, ed esporre la SVZ di soluzione il più rapidamente possibile sacrificio seguente. <ol><li> Dopo l&#39;iniezione di pentobarbital, il mouse si sta rapidamente decapitato. Il pelo viene rimosso e le incisioni sono fatte attraverso la base del cranio. La testa viene poi posto in un vassoio riempito con soluzione di dissezione. </li><li> Mentre stabilizzare la testa con una pinza, tagli continui sono fatti in tutto il cranio e, talvolta, la linea mediana con microscissors. Attenzione a minimizzare il contatto con il tessuto. Dal momento che il bulbo olfattivo è la destinazione finale dei neuroni neonati dalla SVZ, si deve essere consapevoli di preservare quella regione, in particolare durante la rimozione delle ossa intorno a questa zona. Microscissor tagli effettuati in tutto il cranio dovrebbe essere sul lato dorsale, per consentire una facile rimozione del cranio. </li><li> Rimozione del cranio sovrastante il cervello è ora separato dalle ossa sotto il cervello. Se tagli nel passaggio precedente sono effettuate correttamente, questo osso sovrastante può essere rimosso facilmente con le pinzette o pinze. </li><li> Tenendo ancora la testa con una pinza, si può utilizzare una lama chirurgica per rimuovere in modo pulito diversi pezzi di tessuto cerebrale prima affettatura, come il seguente. Un taglio coronale può essere fatta a livello di lambda. Tagli sagittali può essere effettuata su entrambi i lati del cervello laterale alla SVZ. Una stima prudente sarebbe ~ 2,5 mm dalla linea mediana. Se desiderato, il cervello può anche essere hemisected qui. Questi tagli saranno entrambi Facilitate montaggio del tessuto e consentono SVZ essere raggiunto più rapidamente quando il cervello affettatura. È importante ricordare di esercitare la quantità minima di forze meccaniche sul cervello (ad esempio non spingere o tirare). </li></ol> 3. Acuta del cervello Preparazione Slice <ol><li> Per preparare per passi successivi, in modo che la colla super utilizzato per montare il tessuto è libero di zoccoli e pronti ad applicare alla piastra vibratomo. È importante andare più veloce possibile senza danneggiare il cervello. </li><li> Il tessuto cerebrale può essere scavato da sotto, che separa il tessuto dall&#39;osso sottostante contemporaneamente separazione nervi. </li><li> Il tessuto è montato ed incollato su un piatto e posizionato sul vibratomo. A causa della rostrale-caudale anatomia del SVZ, ci siamo concentrati sul rendere fette sagittali in quanto conserva il percorso migratorio dei neuroblasti, la guaina gliale, e il sistema vascolare, che sono in gran parte allineati in questa direzione. Si può sia mount il tessuto alla linea mediana o sulla superficie piana creata mediante tagli sagittali laterali al SVZ. Una fase opzionale è mettere un blocco 3% agarosio dietro il tessuto per servire da riscontro per la lama come le fette staccarsi. Si usa preferibilmente il cianoacrilato colla a base di super. </li><li> Sciacquare la lama con etanolo per rimuovere oli e sciacquare con acqua distillata. Posizionare la lama sul portalama. Montare il portalama al vibratomo. </li><li> Regolare le impostazioni vibratomo per tagliare il tessuto per uno spessore di 250-350 micron per fetta. È importante tagliare utilizzando vibrazioni ad alta frequenza e bassa velocità. </li><li> Sezione progressivamente attraverso il tessuto. L&#39;aspetto del bulbo olfattivo è un buon indicatore che si trova vicino SVZ in fette sagittali come le fette più laterali conterranno né regione. Altri punti di riferimento per cercare includere il ventricolo e l&#39;ispessimento del corpo calloso, sotto il quale si trova la SVZ. La SVZ comparirà per primo nella più Sagit lateralefette mentali. Il RMS mostrerà in mediale fette sagittali. </li><li> Togliere le fette contenenti il ​​SVZ con una plastica pipetta Pasteur con la punta tagliata. Trasferimento alla camera di tenuta fetta. Spesso ottenere maggiori fette di quanto si possono utilizzare in un giorno di lavoro. Tuttavia, fette variano dalla quantità di cellule contenenti il ​​SVZ. A volte è necessario guardare attraverso sezioni diverse per trovare quella desiderata per l&#39;imaging. </li></ol> 4. Preparazione di Microscopio e Coloranti Le fette richiedono un tempo di incubazione di un&#39;ora in ACSF a riprendersi dalla dissezione e taglio. Diversi passaggi possono essere eseguite durante questo periodo di recupero slice. <ol><li> Preparazione di pipette per tintura di calcio e / o applicazione di droga <ol class="lalpha"><li> Pipette di vetro devono avere una punta di 2-3 micron di diametro e una lunghezza della punta (~ 2 mm) e l&#39;angolo (~ 16 ° per il titolare pipetta) che impedisce il contatto con la camera di perfusione e lascia spazio per il posizionamento deil&#39;obiettivo. </li><li> Si può preparare in genere 6-8 pipette di pressione per ogni giorno di esperimenti. </li></ol></li><li> Calcio colorante preparazione <ol class="lalpha"><li> Quando si prepara la soluzione di lavoro (4-5 mM di bagno, 250 pM di applicazione di pressione), è preferibile esporre la quantità minima di DMSO alle cellule. Questo può essere ottenuto facendo scorte altamente concentrati. Per esempio, per Fluo-4, una provetta contenente 50 ug viene utilizzato al giorno. Si può fare uno stock 10 mM di tale aliquota con l&#39;aggiunta di 4,6 ml di soluzione di Pluronic F-127, il 20% in DMSO. </li></ol></li><li> Preparazione configurazione microscopio (Figura 2). <ol class="lalpha"><li> L&#39;uso di una pompa peristaltica per il flusso di soluzione ha contribuito a minimizzare spostamento dell&#39;immagine. Far funzionare la pompa peristaltica prima di consentire ACSF a correre attraverso le linee di perfusione e assicurarsi che sia priva di bolle. </li><li> Impostare il tubo di ingresso della camera di perfusione e garantire non vi siano perdite. </li><li> Posizionare il puntale vuoto per enteure che la soluzione viene aspirata dalla camera di perfusione. Assicurare che è a un livello adeguato in modo che l&#39;obiettivo è immerso alla giusta distanza di lavoro, ma non così alta che tale soluzione può traboccare nella camera. Un basso livello di soluzione riducendo inoltre al minimo le distorsioni di flusso. Un costante aspirazione può anche essere verificata attraverso l&#39;ascolto di stabilità. </li></ol></li></ol> 5. Colorante di caricamento Questo metodo è stato descritto in dettaglio in un altro manoscritto 2. Si prega di vedere le figure in esso. <ol><li> Bagno carico colorante <ol class="lalpha"><li> Fare una soluzione 1-2 ml di lavoro del colorante. Per Fluo-4 AM, una concentrazione di 4-5 mM è sufficiente per etichettare neuroblasti SVZ. </li><li> Fette vengono prima trasferiti in un piatto di coltura 35 mm, con fondo di rete che è già riempito con ACSF. Sostituire la soluzione utilizzando una pipetta di trasferimento 3 ml di plastica per rimuovere delicatamente il ACSF, contemporaneamente aggiungendo il calcium colorante soluzione di lavoro. </li><li> Incubare a 37 ° C per 30-60 min in 5% CO 2 gas ambiente controllato. </li><li> Mettere la fetta di nuovo nel pieno ACSF camera di contenimento per lavare via colorante che non ha inserito cellule. In alternativa, si può porre direttamente sulla camera di perfusione microscopio che esegue ACSF. Questo periodo di lavaggio è 30-45 min. </li><li> Trasferire la sezione per la camera di perfusione. </li></ol></li><li> Applicazione della pressione di colorante <ol class="lalpha"><li> Trasferire la fetta dalla camera di contenimento per la camera di perfusione della configurazione microscopio. </li><li> Riempire una pipetta di vetro con una soluzione di lavoro che è di 250 pM e posto sul micromanipolatore. </li><li> Abbassare la pipetta per la regione di interesse. La pipetta può essere posizionato in modo tale che la punta è o diversi micrometri dalla superficie di fetta o diversi micrometri sepolto sotto la superficie slice, ma lontano dalla regione registrata. L&#39;angolo della pipetta non Affect l&#39;efficienza di carico. Quando l&#39;imaging sotto la superficie fetta, si scopre che mettendo la punta della pipetta di sotto del piano di imaging sarà etichettare la nostra area di esposizione desiderata meglio. </li><li> Quando la pressione applicando il colorante, impostare il Picospritzer modo che sia &lt;3 psi. Non abbiamo stimato il volume di diffusione colorante, perché questo è soggetto alla variabilità del diametro della punta della pipetta, la pressione applicata, e la densità del tessuto in cui viene iniettato il colorante. Noi applichiamo semplicemente fino a raggiungere il nostro carico desiderato, valutato a occhio. Minimizzare i danni alla slice durante l&#39;applicazione, in particolare quando la punta è disposto sotto la superficie slice. La tua candidatura per 1-2 min. Applicazioni ripetute volte sono necessarie a seconda etichettatura come valutato a occhio. Per questo periodo di concentrazione e di applicazione, troviamo che l&#39;applicazione della superficie di colorante etichetta preferenzialmente neuroblasti, mentre al di sotto della superficie di applicazione etichette preferenzialmente astrociti. Tuttavia,&gt; 3 applicazione min a 500 pM anche etichettare neuroblastiindipendentemente dal fatto che la punta sia sopra o sotto la superficie di fetta (JC Platel, osservazioni non pubblicate). Lasciare per il lavaggio e il recupero fetta per 30-45 minuti. </li></ol></li></ol> 6. Imaging confocale di attività di calcio <ol><li> Trova la regione di interesse prima con un obiettivo di risparmio energetico, come 4x o 10x. Posizionare nel centro del campo prima di passare a un obiettivo di potenza superiore. A questo punto, si può valutare la salute generale slice notando la comparsa di cellule SVZ in contrasto interferenziale differenziale (DIC). Le cellule sane appaiono rotondo e paffuto. Inoltre, le cellule sane visualizzerà debole Fluo-4 carico come suppone nessun carico a fluorescenza tutto o luminosi (una cellula morente). </li><li> Abbassare l&#39;immersione in acqua obiettivo sulla regione di interesse, che è ora colorante caricato. In entrambi i casi un obiettivo 40x o 60x è stata adeguata per le nostre esigenze, anche se 40x offre un campo visivo più ampio e consente di operare una maggiore pipetta. Quando l&#39;imaging di sotto delsuperficie, andiamo spesso almeno 15 micron sotto la superficie slice in cui il 3-dimensionale architettura e la salute delle cellule sono meglio conservati. </li><li> Verificare che la perfusione e di vuoto funzionano adeguatamente. </li><li> Impostare il microscopio in modo che time-lapse risoluzione e risoluzione spaziale sono impostati su tassi desiderati. Per microscopia confocale, questi fattori devono essere bilanciati come un aumento della risoluzione temporale generalmente determina una perdita di risoluzione spaziale a causa della natura di scansione del sistema. Per l&#39;attività di calcio, abbiamo immaginato una struttura di circa ogni secondo con una risoluzione di 512x512 pixel. Se più canali acquisite separatamente sono necessari, questo influirà anche velocità di acquisizione. Impostare la durata del film (2-10 min). </li><li> Avviare l&#39;esecuzione. Se si esegue studi di farmacologia, lavare il antagonisti o agonisti non desensibilizzanti per almeno 5-10 minuti, e poi fare un altro film di 5-10 min. Agonisti che possono desensibilizzare recettori possono essere acutamente applicata, ad esempio utilizzando un prEssure pipetta controllato da un micromanipolatore. </li></ol> 7. Analisi di calcio Analisi segue procedure standard che abbiamo descritto in pubblicazioni permeabili 2-4. F 0 (cioè basale) e F sono le intensità media di fluorescenza misurati durante tutte le regioni di interesse (ROI) e in ogni ROI, rispettivamente. Un cambiamento di fluorescenza è stato considerato un aumento di Ca 2 + se era&gt; 15% F / F 0 aumento. Intracellulare di Ca + 2 cambi sono stati calcolati utilizzando Calsignal 5. 8. Risultati rappresentativi Siamo riusciti ad ottenere il caricamento selettivo di cellule SVZ seconda dei protocolli di carico colorante sopra descritti e altrove 2-4,6. Vasca di carico o di applicazione di pressione sulla superficie fetta di Fluo-04:00 (4-5 o 250 mM, rispettivamente) le etichette per lo più neuroblasti. Mentre applicazione di una pressione in grado di caricare neurobdura più rapidamente loading bagno in una sola fetta, carico vasca consente il caricamento simultaneo di più sezioni. Abbiamo confermare l&#39;identità di cellule marcate come neuroblasti da (1) se visualizzare comportamento migratorio 4,7, (2) la loro morfologia, (3) colorazione negativa della sulforodamina 101, un astrociti specifico colorante 3 o (4) con colorazione positiva DCX-DsRed espressione (JC Platel, osservazioni non pubblicate). Neuroblasti migrano rapidamente (media di 60 pm / h) a temperatura fisiologica 4,7-9, ma il loro movimento può essere facilmente osservato anche a temperatura ambiente. Il movimento dei neuroblasti non pone un problema per quanto riguarda l&#39;immissione regioni d&#39;interesse (ROI) per monitorare l&#39;attività di calcio in quanto i nostri film sono in genere di breve durata. Tuttavia, durante i lunghi periodi di attesa, come ad esempio durante lo scambio di soluzioni di droga, gli investigatori devono fare attenzione in modo che corrisponda ROI sotto controllo e periodi di trattamento. Non è raro che neuroblasti migrare dentro o fuori della i<html> MAGING campo o piano focale. Applicazione della pressione di Fluo-4 AM (250 pm) in profondità nella sezione e per la durata limitata (&lt;2 min) etichetta preferenzialmente astrociti SVZ 2. Etichettatura astrociti è stata verificata mediante l&#39;etichettatura positiva con solforodamina 101 e la loro morfologia, soprattutto per la presenza di proiezioni e endfeet sui vasi sanguigni, che abbiamo recentemente descritto 3. Usando questi metodi, abbiamo osservato attività spontanea sia nella popolazione neuroblast SVZ e astrociti (Figura 1). L&#39;attività in astrociti spesso assume la forma di onde che svolgono recipiente 3 sanguigno. Inoltre, utilizzando l&#39;imaging calcio come un saggio, l&#39;applicazione di agonisti farmacologici ha rivelato o confermata espressione di recettori GABA sul neuroblasti e astrociti 6, AMPA e NMDA recettori neuroblasti 4. Cifre 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4071/4071fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Attività di moltiplicazione di calcio negli astrociti. (A) Rappresentante in media immagine da un time-lapse di attività calcio. Astrociti nella SVZ stati caricati con applicazione di pressione di Fluo-4 sono profondo nella slice. Film sono stati acquisiti a 0,75 s di tempo passi. Regioni di interesse (ROI) sono disposti sopra le cellule che presentano attività. (B) Tracce di ROI posizionata sopra cellule del film illustrato in (A). Tracce sono stati filtrati con una media mobile e normalizzato. La scala verticale rappresenta 2 x Af / F 0 dove F è l&#39;intensità del segnale e F 0 è il segnale basale media e Af = 0 FF. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4071/4071fig2.jpg" /> Figura 2. Immagine del sistema di perfusione. Un&#39;estremità di un tubo viene immerso in 95% O 2/5% CO 2 gas-psoluzione erfused. La soluzione è quindi perfuso attraverso il tubo e alla camera bagno da una pompa peristaltica (non mostrato). L&#39;altra estremità è inserita nella presa soluzione della camera vasca montata su una piattaforma. La punta di aspirazione viene quindi collegato all&#39;uscita soluzione della camera e fissato ad un livello per determinare l&#39;altezza soluzione. Dalla presa, la punta di aspirazione è collegato alla linea del vuoto, che aspira la soluzione dalla camera in un contenitore per rifiuti. Il sistema di perfusione è indicata dal palco microscopio per maggiore chiarezza visiva.

<ol>
	<li>Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chain+formation+and+glial+tube+assembly+in+the+shift+from+neonatal+to+adult+subventricular+zone+of+the+rodent+forebrain.">Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain.</a> J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).</li><li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+and+recording+subventricular+zone+progenitor+cells+in+live+tissue+of+postnatal+mice.">Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice.</a> Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).</li><li>Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gap+junction-mediated+calcium+waves+define+communication+networks+among+murine+postnatal+neural+progenitor+cells.">Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells.</a> Eur. J. Neurosci. , (2011).</li><li>Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+activated+by+subventricular+zone+astrocytic+glutamate+are+critical+for+neuroblast+survival+prior+to+entering+a+synaptic+network.">NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network.</a> Neuron. 65, 859-872 (2010).</li><li>Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchrony+of+spontaneous+calcium+activity+in+mouse+neocortex+before+synaptogenesis.">Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis.</a> Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).</li><li>Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAA+increases+calcium+in+subventricular+zone+astrocyte-like+cells+through+L-+and+T-type+voltage-gated+calcium+channels.">GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels.</a> Front. Cell. Neurosci. 4, 8 (2010).</li><li>Bolteus, A. J., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+Release+and+Uptake+Regulate+Neuronal+Precursor+Migration+in+the+Postnatal+Subventricular+Zone.">GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone.</a> J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).</li><li>Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tonic+activation+of+GLUK5+kainate+receptors+decreases+neuroblast+migration+in+a+whole+mount+preparation+of+the+subventricular+zone.">Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone.</a> J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).</li><li>Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+features+of+postnatal+subventricular+zone+cell+motility:+a+two-photon+time-lapse+study.">Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study.</a> J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).</li><li>Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABA+controls+Ca2++activity-dependent+network+synchrony+in+the+adult+neurogenic+forebrain.">GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain.</a> , (2007).</li><li>Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFAP-expressing+cells+in+the+postnatal+subventricular+zone+display+a+unique+glial+phenotype+intermediate+between+radial+glia+and+astrocytes.">GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes.</a> Glia. 54, 394-410 (2006).</li><li>Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biophysical+properties+and+ionic+signature+of+neuronal+progenitors+of+the+postnatal+subventricular+zone+in+situ.">Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ.</a> J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).</li><li>Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neural+activity+in+worms,+flies+and+mice+with+improved+GCaMP+calcium+indicators.">Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators.</a> Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).</li><li>Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+expanded+palette+of+genetically+encoded+Ca(2)+indicators.">An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators.</a> Science. 333, 1888-1891 (2011).</li><li>Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetically+targeted+optical+sensor+to+monitor+calcium+signals+in+astrocyte+processes.">A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes.</a> Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Immagini di calcio delle cellule SVZ è stato utilizzato per studiare gli schemi di attività spontanea in neuroblasti 10, canale di espressione del recettore in entrambi i neuroblasti e astrociti 4,6,8 e onde di calcio astrocitari 3. Poiché le cellule del SVZ o sono immaturi o hanno proprietà gliali, non sparare potenziali di azione 11,12, il che significa che i cambiamenti millisecondo potenziale tensione indicativa di attività in reti maturi non è applicabile in questa ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Soluto </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Dissezione (mM) </td></tr><tr><td> Saccarosio </td><td> Sigma </td><td> S0389 </td><td> Dissection: 147 mm ACSF: 0 mm </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma </td><td> S9888 </td><td> Dissection: 42 mm ACSF: 126 mm </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Sigma </td><td> P3911 </td><td> Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM </td></tr><tr><td> MgCl 2 .6 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> M9272 </td><td> Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4. H 2 O </td><td> Sigma </td><td> S8282 </td><td> Dissection: 1,25 mm ACSF: 1,25 mm </td></tr><tr><td> Glucosio </td><td> Sigma </td><td> G8270 </td><td> DisseZIONE: 10 mM ACSF: 10 mM </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Sigma </td><td> S6014 </td><td> Dissection: 26 mm ACSF: 26 mm </td></tr><tr><td> CaCl 2 .2 H 2 O </td><td> Sigma </td><td> C3306 </td><td> Dissection: 1,33 mM ACSF: 2 mM </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Lista Chimica e ricette di soluzione di dissezione e ACSF. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td> [Intestazione] </td></tr><tr><td> Nome </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Vibratomo </td><td> Leica </td><td> VT 1000S </td><td></td></tr><tr><td> Super Glue </td><td> Surehold o 3M </td><td> Surehold 3G Super Glue o 3M Vet-Bond </td><td></td></tr><tr><td> Dissezione strumenti </td><td> Roboz o Ted Pella </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fluo-04:00 calcio colorante sensibile </td><td> Invitrogen </td><td> F14201 </td><td></td></tr><tr><td> Oregon verde BAPTA-1:00 calcio-colorante sensibile </td><td> Invitrogen </td><td> O6807 </td><td></td></tr><tr><td> Pluronic F-127 soluzione 20% in DMSO </td><td> Invitrogen </td><td> P3000MP </td><td></td></tr><tr><td> Montante microscopio confocale </td><td> Olimpo </td><td> FV300 o FV1000 </td><td></td></tr><tr><td> Immersione in acqua obiettivi </td><td> Olimpo </td><td> LUMPlanFl 40 x W / IR (NA 0,80); LUMPlanFl 60 x W / I (NA 0,90) </td><td></td></tr><tr><td> Micromanipolatori </td><td> Sutter </td><td> MPC-200/MPC-325/MPC-385 </td><td></td></tr><tr><td> Regolatore di pressione &lt;/ Td&gt; <td> Parker Hannifin </td><td> Picospritzer </td><td> &lt;3 PSI durante l&#39;applicazione </td></tr><tr><td> Pipettare estrattore </td><td> Sutter o Narshige </td><td> Sutter P-97 o Narshige PP-830 </td><td></td></tr><tr><td> Pipette di vetro </td><td> Sutter </td><td> BF150-110-10 </td><td> ID: 1.10, OD: 1.50 </td></tr><tr><td> Pompa peristaltica </td><td> Harvard Apparatus </td><td> Modello 720 </td><td> Portata: 1 ml / min </td></tr><tr><td> Camera da bagno </td><td> Warner Instruments </td><td> RC-26 GLP </td><td> A basso profilo consente di attestazione obiettivo </td></tr><tr><td> Tubi </td><td> Tygon </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Termoregolatore </td><td> Warner Instruments </td><td> TC-324B/344B </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 2. Materiali / dotazioni.

preparation of acute subventricular zone slices for calcium imaging

Zona subventricolare (SVZ) è una delle due zone neurogenici nel cervello postnatale. La SVZ contiene cellule densamente, comprese le cellule progenitrici neurali con caratteristiche astrocitari (chiamati astrociti SVZ), neuroblasti, e cellule progenitrici intermedi. Neuroblasti nati nel SVZ tangenzialmente la migrazione di una grande distanza al bulbo olfattivo, dove si differenziano in interneuroni. Segnalazione intercellulari attraverso molecole di adesione e segnali diffusibili svolgono un ruolo importante nel controllo della neurogenesi. Molti di questi segnali innescare l&#39;attività intracellulare di calcio che trasmette informazioni all&#39;interno e tra le cellule. Attività calcio è così riflettente dell&#39;attività di segnali extracellulari ed è un modo ottimale per comprendere funzionale segnalazione intercellulare tra cellule SVZ. L&#39;attività di calcio è stato studiato in molte altre regioni e tipi di cellule, tra cui gli astrociti e neuroni maturi. Tuttavia, il metodo tradizionale di loacellule d con indicatore colorante calcio (carico bagno ad esempio) non era efficiente al caricamento di tutti i tipi di cellule SVZ. Infatti, la densità cellulare nel SVZ osta diffusione colorante all&#39;interno del tessuto. Inoltre, si preparano sezioni sagittali di preservare la disposizione tridimensionale delle cellule SVZ, in particolare il flusso di migrazione neuroblast sul rostrale-caudale asse. Qui, descriviamo i metodi per preparare sezioni sagittali contenenti la SVZ, il caricamento delle cellule SVZ con colorante indicatore di calcio, e l&#39;acquisizione delle attività di calcio con filmati time-lapse. Abbiamo usato Fluo-04:00 colorante per il caricamento di astrociti SVZ con applicazione di una pressione all&#39;interno del tessuto. L&#39;attività di calcio è stato registrato utilizzando un microscopio a scansione confocale che permette una risoluzione precisa per distinguere le singole celle. Il nostro approccio è applicabile ad altre zone neurogenici compresa la zona dell&#39;ippocampo adulto subgranular embrionali e zone neurogena. Inoltre, altri tipi di coloranti possonoessere applicato utilizzando il metodo descritto.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging at JoVE.com

Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

Un metodo per caricare zona subventricolare (SVZ) cellule con coloranti di calcio indicatori per l&#39;attività di registrazione di calcio è descritto. Il post-natale SVZ contiene cellule ravvicinate comprese le cellule progenitrici neurali e neuroblasti. Piuttosto che utilizzare loading bagno abbiamo iniettato il colorante dalla pressione all&#39;interno del tessuto consentendo una migliore diffusione colorante.

Preparazione di acuta fette zona subventricolare for Imaging di calcio

The subventricular zone (SVZ) is one of the two neurogenic zones in the postnatal brain. The SVZ contains densely packed cells, including neural ...

preparation-of-acute-subventricular-zone-slices-for-calcium-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.0K Views.  Yale University School of Medicine. Un metodo per caricare zona subventricolare (SVZ) cellule con coloranti di calcio indicatori per l'attività di registrazione di calcio è descritto. Il post-natale SVZ contiene cellule ravvicinate comprese le cellule progenitrici neurali e neuroblasti. Piuttosto che utilizzare loading bagno abbiamo iniettato il colorante dalla pressione all'interno del tessuto consentendo una migliore diffusione colorante.

Video: Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging

The Subventricular Zone En-face: Wholemount Staining and Ependymal Flow

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an extensively studied model system for understanding the behavior of neural stem cells and the regulation of adult neurogenesis. Traditionally, these studies have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region. Compared to sections, wholemounts preserve the complete cytoarchitecture and cellular relationships within the SVZ. This approach has recently revealed that the adult neural stem cells, or type B1 cells, are part of a mixed neuroepithelium with differentiated ependymal cells lining the lateral ventricles. In addition, this approach has been used to study the planar polarization of ependymal cells and the cerebrospinal fluid flow they generate in the ventricle. With recent evidence that adult neural stem cells are a heterogeneous population that is regionally specified, the wholemount approach will likely be an essential tool for understanding the organization and parcellation of this stem cell niche.

The lateral ventricle walls contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. Traditionally, studies on neurogenesis in this region have relied on classical sectioning techniques for histological analysis. Here we present an alternative approach, the wholemount technique, which provides a comprehensive, en-face view of this germinal region.

La zona subventricolare En-face: colorazione Wholemount e flusso ependimale

The walls of the lateral ventricles contain the largest germinal region in the adult mammalian brain. The subventricular zone (SVZ) in these walls is an ...

Ricerca

Neuroscienze

Neonatal Subventricular Zone Electroporation

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal cells1. Understanding the molecular pathways responsible for NSC self-renewal, commitment, and differentiation is critical for harnessing their unique potential to repair the brain and better understand central nervous system disorders. Previous methods for the manipulation of mammalian systems required the time consuming and expensive endeavor of genetic engineering at the whole animal level2. Thus, the vast majority of studies have explored the functions of NSC molecules in vitro or in invertebrates.
Here, we demonstrate the simple and rapid technique to manipulate neonatal NPCs that is referred to as neonatal subventricular zone (SVZ) electroporation. Similar techniques were developed a decade ago to study embryonic NSCs and have aided studies on cortical development3,4 . More recently this was applied to study the postnatal rodent forebrain5-7. This technique results in robust labeling of SVZ NSCs and their progeny. Thus, postnatal SVZ electroporation provides a cost and time effective alternative for mammalian NSC genetic engineering.

We demonstrate a minimally invasive technique referred to as neonatal subventricular zone electroporation. The technique consists of injecting plasmid DNA into the lateral ventricles of neonatal pups and applying electrical current to deliver and genetically manipulate neural stem cells

Neonatale Elettroporazione zona subventricolare

Neural stem cells (NSCs) line the postnatal lateral ventricles and give rise to multiple cell types which include neurons, astrocytes, and ependymal ...

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to neuroblasts able to move along the rostral migratory stream (RMS) towards the olfactory bulb (OB). This long-distance migration is required for the subsequent maturation of newborn neurons in the OB, but the molecular mechanisms regulating this process are still unclear. Investigating the signaling pathways controlling neuroblast motility may not only help understand a fundamental step in neurogenesis, but also have therapeutic regenerative potential, given the ability of these neuroblasts to target brain sites affected by injury, stroke, or degeneration.
In this manuscript we describe a detailed protocol for in vivo postnatal electroporation and subsequent time-lapse imaging of neuroblast migration in the mouse RMS. Postnatal electroporation can efficiently transfect SVZ progenitor cells, which in turn generate neuroblasts migrating along the RMS. Using confocal spinning disk time-lapse microscopy on acute brain slice cultures, neuroblast migration can be monitored in an environment closely resembling the in vivo condition. Moreover, neuroblast motility can be tracked and quantitatively analyzed. As an example, we describe how to use in vivo postnatal electroporation of a GFP-expressing plasmid to label and visualize neuroblasts migrating along the RMS. Electroporation of shRNA or CRE recombinase-expressing plasmids in conditional knockout mice employing the LoxP system can also be used to target genes of interest. Pharmacological manipulation of acute brain slice cultures can be performed to investigate the role of different signaling molecules in neuroblast migration. By coupling in vivo electroporation with time-lapse imaging, we hope to understand the molecular mechanisms controlling neuroblast motility and contribute to the development of novel approaches to promote brain repair.

In vivo Postnatal Electroporation and Time-lapse Imaging of Neuroblast Migration in Mouse Acute Brain Slices

Neuroblast migration is a fundamental event in postnatal neurogenesis. We describe a protocol for efficient labeling of neuroblasts by in vivo postnatal electroporation and subsequent visualization of their migration using time-lapse imaging of acute brain slices. We include a description for the quantitative analysis of neuroblast dynamics by video tracking.

In vivo postnatale elettroporazione e Time-lapse imaging di migrazione neuroblasti in mouse acuta Fette cervello

The subventricular zone (SVZ) is one of the main neurogenic niches in the postnatal brain. Here, neural progenitors proliferate and give rise to ...

Cell Sorting of Neural Stem and Progenitor Cells from the Adult Mouse Subventricular Zone and Live-imaging of their Cell Cycle Dynamics

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. They successively generate transit amplifying cells (TACs) and neuroblasts that differentiate into neurons once they integrate the olfactory bulbs. Emerging fluorescent activated cell sorting (FACS) techniques have allowed the isolation of NSCs as well as their progeny and have started to shed light on gene regulatory networks in adult neurogenic niches. We report here a cell sorting technique that allows to follow and distinguish the cell cycle dynamics of the above-mentioned cell populations from the adult SVZ with a LeX/EGFR/CD24 triple staining. Isolated cells are then plated as adherent cells to explore in details their cell cycle progression by time-lapse video microscopy. To this end, we use transgenic Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) mice in which cells are red-fluorescent during G1 phase due to a G1 specific red-Cdt1 reporter. This method has recently revealed that proliferating NSCs progressively lengthen their G1 phase during aging, leading to neurogenesis impairment. This method is easily transposable to other systems and could be of great interest for the study of the cell cycle dynamics of brain cells in the context of brain pathologies.

We report a Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS)-based method to isolate neural stem cells (NSCs) and their progeny from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain. Applied to Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator (FUCCI) transgenic mice, it allows the study of cell cycle progression by live imaging.

Ordinamento delle cellule staminali neurali e di cellule progenitrici del topo adulto subventricolare Zone e Live-imaging loro dinamiche del ciclo cellulare

Neural stem cells (NSCs) in the subventricular zone of the lateral ventricles (SVZ) sustain olfactory neurogenesis throughout life in the mammalian brain. ...

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have validated the utility of this method for enhancing neuronal preservation and overall brain slice viability. The implementation of this technique by early adopters has facilitated detailed investigations into brain function using diverse experimental applications and spanning a wide range of animal ages, brain regions, and cell types. Steps are outlined for carrying out the protective recovery brain slice technique using an optimized NMDG artificial cerebrospinal fluid (aCSF) media formulation and enhanced procedure to reliably obtain healthy brain slices for patch clamp electrophysiology. With this updated approach, a substantial improvement is observed in the speed and reliability of gigaohm seal formation during targeted patch clamp recording experiments while maintaining excellent neuronal preservation, thereby facilitating challenging experimental applications. Representative results are provided from multi-neuron patch clamp recording experiments to assay synaptic connectivity in neocortical brain slices prepared from young adult transgenic mice and mature adult human neurosurgical specimens. Furthermore, the optimized NMDG protective recovery method of brain slicing is compatible with both juvenile and adult animals, thus resolving a limitation of the original methodology. In summary, a single media formulation and brain slicing procedure can be implemented across various species and ages to achieve excellent viability and tissue preservation.

Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method

This protocol demonstrates the implementation of an optimized N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. A single media formulation is used to reliably obtain healthy brain slices from animals of any age and for diverse experimental applications.

Preparazione di fettine di cervello acuto utilizzando un' ottimizzata N-metilico-D-metodo di ripristino protettivo glucamine

This protocol is a practical guide to the N-methyl-D-glucamine (NMDG) protective recovery method of brain slice preparation. Numerous recent studies have ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

L&#39;incubazione prolungata di acuta neuronale tessuto per Elettrofisiologia e Calcio imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

Preparazione delle fette Acute del midollo spinale per la registrazione di cellule intere Patch-clamp in neuroni di sostanza Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

Preparazione di fette acute di ippocampale umano per registrazioni elettrofisiologiche

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

<meta charset="utf8"></head><body>Nucleofecazione efficiente di NSC isolate dalla zona subventricolare murina

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) as mitogens, producing clonal aggregates known as neurospheres. This in vitro system is a valuable tool for studying NSC potential. Transfection of siRNAs or genes carried in plasmids can be used to induce perturbations to gene expression and study NSC biology. However, the exogenous nucleic acid delivery to NSC cultures is challenging due to the low efficiency of central nervous system (CNS) cells transfection. Here, we present an improved nucleofection system that achieves high efficiency of gene delivery in expanded NSCs from adult murine SVZ. We demonstrate that this relatively simple method enhances gene perturbation in adult NSCs, surpassing traditional transfection protocols with survival rates exceeding 80%. Moreover, this method can also be applied in primary isolated NSCs, providing a crucial advancement in gene function studies through gene expression manipulation via knockdown or overexpression in neurosphere cultures.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Nucleofection migliorata per la consegna genica ad alta efficienza in colture di cellule staminali neurali munine derivate dalla zona subven

Here, we describe a nucleofection system designed to enhance gene delivery efficiency in expanded neural stem cells (NSCs) isolated from the adult murine subventricular zone. The findings demonstrate that this method significantly improves gene perturbation in NSCs, surpassing the effectiveness of traditional transfection protocols and enhancing cell survival rate.

Isolamento, espansione e nucleofezione di cellule staminali neurali dalla zona subventricolare murina adulta

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...