Questo manoscritto è dedicato alla memoria del Dr. Wang Wenlan scomparso il 26 maggio 2011. Ringraziamo il dottor Douglas A. Kerr generosamente per fornire i HBG3 cellule MES usati in questo studio. Questo lavoro è stato finanziato da Nemours, una borsa di studio (2 RR016472-10) nell&#39;ambito del programma INBRE del Centro nazionale per le risorse di ricerca (NCRR), e un premio COBRE borsa di studio del NCRR (5 RR020173 P20-05) per sostenere il Centro per La ricerca pediatrica presso l&#39;Alfred I. duPont Hospital for Children, Wilmington, Delaware, USA.

1. Fase 1: Mouse Embryonic Stem (MES) Cultura Cell (Timing: 3 giorni) 1. Placcatura fibroblasti primari embrionali di topo (PMEF) <ol><li> Cappotto quattro da 100 mm di coltura dei tessuti piatti con gelatina di adesione PMEF. Aggiungere 8 ml di 0,1% soluzione di gelatina (StemCell Technologies) per ogni piatto e incubare per 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Togliere l&#39;eccesso di gelatina da piatti. Non sciacquare i piatti. </li><li> Diluire una fiala di Mitomicina C-inattivato PMEF (Millipore) che contiene ca. 5 x 10 6 cellule in 40 ml di PMEF supporti (vedi ricetta in tabella 1) e la piastra su quattro piatti tessuto 100-mm di coltura. Il PMEF fornire uno strato di alimentazione per le cellule MES. </li><li> PMEF devono essere seminati almeno un giorno prima di aggiungere colture cellulari MES. PMEF può essere usato fino a 1 settimana dopo la placcatura. </li></ol> 2. Placcatura MES Celle Per monitorare l&#39;efficienza della differenziazione cellulare MES in motoneuroni, Abbiamo utilizzato HBG3, una linea di cellule ES derivata da un topo transgenico che esprime eGFP sotto il controllo del promotore motore HB9 neurone specifico. <ol><li> Sbrinamento 1 flacone di HBG3 cellule MES (circa 1 x 10 7, ha contribuito dal dottor Douglas Kerr, Johns Hopkins University) in un bagno di acqua a 37 ° C. Aggiungere 5 ml di ES supporti (vedi ricetta in tabella 1) in una provetta da 15 ml e centrifugare le cellule a 800 rpm per 5 min. </li><li> Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in MES 20 ml di supporto ES con fresco aggiunto fattore inibitorio della leucemia (LIF) ad una concentrazione finale di 10 ng / ml. NOTA: LIF deve essere aggiunto il giorno di utilizzo ed è necessario per mantenere le cellule MES uno stato indifferenziato. </li><li> Rimuovere 10 ml supporti PMEF dal PMEF in ogni piatto e aggiungere 10 ml di sospensione HBG3 cellule ES ad ogni piatto. </li><li> 24 h dopo la placcatura, cellule MES formano colonie piccole di dimensioni simili a colonia indicata dalla freccia in figura 1B. 72 h dopo la placcatura, colonies aumento delle dimensioni, molti essendo circa 100 micron di diametro (figura 1B, indicato dalle frecce). Queste cellule sono pronte per la differenziazione. I terreni devono essere sostituiti ogni giorno per mantenere la proliferazione delle cellule. </li></ol> 2. Fase 2: induzione neurale (Timing: 2 giorni) Per indurre la differenziazione di cellule SEM nel motoneuroni, cellule MES devono essere separati da PMEF e coltivato in un ambiente sospensione. Gelatina fiaschi rivestiti sono usati per separare PMEF dalle cellule MES. <ol><li> Quando le colonie MES sono pronti per l&#39;induzione neurale (definito come giorno differenziazione 0), mantello 2 fiasche T150 con gelatina 0,1% (18 ml / beuta) per 30 min a temperatura ambiente e quindi rimuovere gelatina eccesso e lavare con PBS 1X tre volte. NOTA: Ogni 100-mm cultura piatto sarà necessario uno T150-gelatina pallone rivestito per separare PMEF. </li><li> Rimuovere con attenzione dei media per aspirazione, facendo attenzione a non rimuovere le colonie vagamente collegati. Aggiungere 10 ml di PBS brevemente e quindi rimuovere per aspirazione per completare la fase di lavaggio. </li><li> Per separare le cellule MES di PMEF, aggiungere 0,25% di tripsina / EDTA (3 ml / piatto, StemCell Technologies) e incubare per 3-5 minuti a 37 ° C finché le cellule staminali e PMEF staccarsi dalla piastra. Aggiungere 15 ml supporti ES freschi senza LIF e le cellule pipettare su e giù per rompere colonie (circa 15-20 volte). Quindi, aggiungere a una gelatina rivestita 0,1% T150 pallone e incubare per 30 min a 37 ° C. Dopo l&#39;incubazione, PMEF dovrebbe attaccarsi alla superficie gelificato mentre le cellule staminali embrionali dovrebbe essere galleggiare. Raccogliere le cellule galleggianti MES in una provetta da 50 ml. </li><li> Centrifugare a 800 rpm e risospendere le cellule in 10 ml di Medium differenziamento neurale (vedi ricetta in Tabella 1). </li><li> Contare le cellule utilizzando un emocitometro e poi piastra circa 2 x 10 6 cellule MES su un piatto di 100-mm coltura batterica o sospensione. Queste piastre permettono la crescita di colture in sospensione e promuovere la formazione di corpi embrionali (EBS). </li><li> On differentiazione 1 giorno, le cellule MES formare piccoli aggregati fluttuanti (EBS) che sono visibili al microscopio ottico. Qualsiasi PMEF riporto allegare al piatto. Trasferire le cellule in sospensione e media in un tubo da 15 ml e centrifugare a bassa velocità (500 rpm) per 3 min. Aspirare i media con attenzione, aggiungere 10 ml di fresca Medio differenziamento neurale al pellet EBS, e poi le cellule piastra in un nuovo piatto batterica. Oltre a rifornire i mezzi di comunicazione, questo passaggio rimuove qualsiasi PMEF che riporto dalla fase precedente. </li><li> Il giorno 2 differenziazione, EBS sono pronti per essere indotto in neuroni motori. </li></ol> 3. Fase 3: Motor Neuron Specification (Timing: 5 giorni) <ol><li> Il giorno 2 differenziazione, agitare il piatto della cultura e trasferire la media e EBs in una provetta da 15 ml. Lasciate EBs risolvere per gravità (~ 10 min) oppure mediante centrifugazione a bassa velocità (500 rpm) per 3 min. </li><li> Aspirare il terreno con cura e risospendere EBs in 10 ml di differenziazione Motor Neuron (MND), medio (vedi ricetta in <strong&gt; Tabella 1). Piastra EBs in un nuovo piatto batterica e modificare i supporti giorno per 5 giorni. </li><li> Il giorno 7 differenziazione, EBs dovrebbe essere di circa 150 a 200 micron in diametro e dovrebbe esprimere segnali forti GFP (figura 1C). Si tratta di EB sono pronti per essere dissociati e placcato su poly-DL-ornithine/laminin piatti rivestiti o coprioggetti. </li></ol> 4. Fase 4: Preparazione del Poly-DL-ornithine/laminin Coprivetrini rivestite (Timing: 2 giorni) Due giorni prima dissociare EBS (cioè il giorno differenziazione 5), preparare coprioggetti poly-DL-ornithine/laminin-coated. <ol><li> Luogo 12 mm coprioggetto rotondi (Warner Instruments) sul fondo di una piastra da 24 pozzetti. Sciogliere 25 mg di poli-DL-ornitina (Sigma-Aldrich) in 25 ml sterile, acqua bidistillata (d 2 H 2 O) per ottenere una soluzione 10X fotografia (1 mg / ml). Al momento dell&#39;uso, una diluizione 1/10 di poli-DL-ornitina con d 2 H 2 O per ottenere concentrazione di 100 ug / ml. Aggiungere 0,5 ml a ciascun pozzetto della piastra da 24 pozzetti ed incubare a 4 ° C per il pernottamento. </li><li> Il giorno successivo (differenziazione giorno 6), aspirare poli-DL-ornitina e lasciare che le piastre di copertura e scivola aria secca in un cappuccio coltura tissutale. Risciacquare nei pozzetti della piastra con D 2 H 2 O tre volte. Lasciare asciugare all&#39;aria per un&#39;altra ora. </li><li> Sciogliere 1 mg del mouse laminina (Millipore) in 5 ml di freddo-freddo 1X PBS per rendere disponibile una soluzione 100x (200 mg / ml). Al momento dell&#39;uso, fare diluizione 1/100 in ghiacciato-freddo 1X PBS (2 mg laminina / ml). Aggiungere 0,5 ml / pozzetto in una piastra da 24 pozzetti e incubare a 4 ° C per il pernottamento. Prima che le cellule di semina, laminina in eccesso deve essere rimosso e pozzi risciacquati con PBS 1X due volte. Copri possono essere memorizzati in MND mezzo (0,5 ml / pozzetto). </li></ol> 5. Fase 5: Allungamento Axon (Timing: 2 giorni) <ol><li> Il giorno 7 differenziazione, raccogliere EBs in un tubo da 15 ml e permettono di risolvere EB (circa 3 minuti). Aspirare media e ri-suspend EBs in PBS. Lasciare EBS per insediarsi e poi aspirare PBS. Ripetere questa operazione 3 volte. Aggiungere 1 ml di Accumax (Millipore) per l&#39;EBS, mescolare delicatamente e incubare per 5 min a temperatura ambiente. Poi aspirare Accumax eccesso che copre il EBS. </li><li> Per dissociare EBS, aggiungere 3 ml di terreno MND. Pipettare su e giù per 20 volte usando un ml 1 micropipetta Eppendorf (blu punta) per interrompere EBS. Incubare per 2 min a temperatura ambiente. Trasferire sospensione cellulare in un tubo mm 12x75 con cellule filtro tappo (BD Falcon) per ottenere una sospensione di cellule singole. Ripetere questo passaggio dissociazione di ciuffi e le cellule rimanenti trattenuti dal filtro, in modo da arricchire la resa di singole cellule. La sospensione finale singola cellula sarà 6 ml. </li><li> Mescolare delicatamente questa sospensione singola cella e contare le cellule utilizzando un emocitometro. Diluire le cellule nel mezzo MND (supplementato con 10 ng / ml di ciascun BDNF, GDNF, CNTF, e NT-3) ad una densità di 2x10 5 cellule per ml. Aggiungere sospensione cellulare (0,5 ml / pozzetto) a 24-pozzetti contenenti pocoprioggetti ly-DL-ornithine/laminin rivestite (precedentemente preparato come descritto sopra). Le cellule differenziate si estendono neuriti a lungo dopo 2 giorni di coltura (Figura 1D). </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Figura 1A mostra il profilo del protocollo. Nel passaggio 1, le cellule sono coltivate in MES PMEF e integrato con LIF per prevenire differenziazione spontanea. In generale, indifferenziate colonie MES sono rotondi e compatti, e sono chiaramente definiti i bordi. Le colonie non sono in contatto tra loro. Tipicamente, le cellule MES dovrebbe essere diviso in un rapporto 1:4 ogni 2 ~ 3 giorni. Tuttavia, ciascuna linea singola cellula crescerà ad un tasso differente e il rapporto di divisione devono essere determinate empiricamente. Le frecce in figura 1B indicano l&#39;aspetto tipico di cellule MES dopo coltura su uno strato alimentatore PMEF per 3 giorni. Queste colonie sono di grandi dimensioni (50-100 micron di diametro), ma mantengono ancora orlo tondo e definitos. In questa fase le colonie sono pronti per la differenziazione o sottocultura. Una punta di freccia in Figura 1B mostra una piccola colonia MES che solitamente si trova 24 h dopo la placcatura. Quattro giorni dopo la placcatura, le cellule diventano MES invaso. Essi mostrano un aspetto appiattito e la perdita di confini definiti, che indica che stanno cominciando a differenziare. Tali cellule non sono ottimali per la differenziazione nelle cellule neuronali. Per differenziare le cellule MES in neuroni motori, le cellule MES bisogno di essere coltivata in condizioni di sospensione per permettere la formazione EB. Nel passaggio 2, cellule ES sono trasferite su una superficie di coltura senza uno strato alimentatore per promuovere la formazione EB. In questo passo, vengono incubate in mezzo differenziamento neurale supplementato con Noggin, bFGF, e FGF-8 per 2 giorni a cellule dirette ad lignaggio neurale. Piccola EBS può essere osservata al microscopio a giorno 1 di differenziazione. Dovrebbero essere galleggiare nel mezzo. Riporto PMEF si possono trovare anche al giorno 1di differenziazione e devono essere rimossi. Queste cellule batteriche aderiscono ai piatti in modo vengono eliminati quando EBS sono diversi passaggi ad un nuovo piatto batterica. Così, al giorno 2 di differenziazione, PMEF pochi o nessun va visto nel piatto di coltura. Al punto 3, ha continuato il trasferimento di EBS per nuovi piatti devono assicurare la rimozione di qualsiasi PMEF rimanente. EBS sono coltivate nella differenziazione dei motoneuroni (MND), i media integrati con RA e SAG per 5 giorni di differenziare le cellule in neuroni motori. Durante la coltura, EB continuano a crescere in dimensione e può essere visto ad occhio nudo al giorno differenziazione 3 ~ 4. Figura 1C mostra l&#39;aspetto microscopico di differenziazione EBs il giorno 7. A differenza delle cellule indifferenziate, EBS mostrano una forte fluorescenza a causa di espressione di GFP. Si tratta di EBS sono differenziati in modo ottimale e sono pronti per la dissociazione. Citometria a flusso dimostrato che il 51% ± 0,8% delle cellule dal dissociato EBs era differenziate in cellule esprimenti GFP 5. Al punto 5, della cultura della thEse motoneuroni in presenza di GDNF, CNTF, BDNF, NT3 e risultati in estensione di lunghe proiezioni assonale. figura 1D mostra la comparsa di cellule differenziate 2 giorni dopo placcatura di dissociata EBs. Nota neuriti lunghi si estendono dai corpi cellulari delle cellule placcati. Colorazione immunofluorescente mostra che le cellule GFP + esprimono il pan-marcatore neuronale (neurofilamento-catena media) e due motori marcatori neuronali specifici, (Islet-1 e colina acetiltransferasi, Figura 2). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig1.jpg" /> Figura 1. Differenziazione di cellule SEM nel motoneuroni (immagine modificata da Wu et al. 5). A) Schema di protocollo di differenziazione da cellule MES per i motoneuroni. B) le cellule indifferenziate MES formano colonie rotonde sulla parte superiore di uno strato di fibroblasti alimentatore. Hanno debole espressione GFP. C) le cellule MES sono state separate da strati feeder e culturosso a basso attaccamento piatti a formare EBS. Durante i primi due giorni del processo di differenziazione, le cellule sono state esposte a 50 ng / Noggin ml, 20 ng / ml bFGF, e 20 ng / ml FGF-8. Successivamente, sono state indotte a differenziarsi con 1 pM acido retinoico e 1 pM sonic SAG agonista hedgehog per 5 giorni. Differenziate le cellule MES ha espresso una forte fluorescenza GFP. D) Dopo 7 giorni di differenziazione, EBS erano dissociate e placcato su poly-DL-ornithine/laminin piastre rivestite. Le cellule differenziate esteso lunghi processi neurali dopo 2 giorni di coltura. Scala bar = 200 micron. MN = motoneurone. B, C e D sono immagini in campo chiaro e B &#39;, C&#39; e D &#39;sono corrispondenti immagini a fluorescenza. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3813/3813fig2.jpg" /> Figura 2. Caratterizzazione di MES derivati ​​da cellule neuroni motori. Immunofluorescenza per catena neurofilamenti medio (NF-M, rosso), chat (rosso), e Islet-1 (rossa) è stata coincidente con GFP (green) exprESSIONE. DAPI (blu) è stato utilizzato per identificare i nuclei. Scala bar = 50 micron.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

La qualità di cellule MES è il parametro più critico per la produzione efficiente di neuroni motori. MES cellule devono essere coltivate in PMEF per prevenire differenziazione spontanea. L&#39;aggiunta di LIF aiuta a mantenere le cellule MES uno stato indifferenziato. Come cellule MES dividere ogni 12-15 ore, il terreno di coltura si esaurisce rapidamente e deve essere sostituito ogni giorno. Efficiente attivazione del pathway Shh è un parametro critico necessario per indurre motore neur...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td> PMEF </td><td> Millipore </td><td> PMEF-H </td><td> NA </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> PMEF media </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 11965-118 </td><td> NA </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16140-071 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> L-glutammina </td><td> Invitrogen </td><td> 25030-081 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-063 </td><td> 1% </td></tr><tr><td></td><td></td&gt; <td></td><td></td></tr><tr><td> MES media </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Technologies </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES Cell-Qualified FBS </td><td> Invitrogen </td><td> 16141-079 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> -I Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Aminoacidi non essenziali </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Nucleosidi </td><td> Millipore </td><td> ES-008-D </td><td> 1% </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanolo </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> LIF </td><td> Millipore </td><td&gt; LIF2010 </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Differenziazione medio Neural </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMEM </td><td> StemCell Technologies </td><td> 36250 </td><td> NA </td></tr><tr><td> ES Cult FBS </td><td> StemCell Technologies </td><td> 06905 </td><td> 15% </td></tr><tr><td> Aminoacidi non essenziali </td><td> Invitrogen </td><td> 11140-050 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Mono-tio glicerolo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M-6145 </td><td> 1mM </td></tr><tr><td> Boccaletto </td><td> Invitrogen </td><td> PHC1506 </td><td> 50 ng / ml </td></tr><tr><td> FGF-8 </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0274 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td> bFGF </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0024 </td><td> 20 ng / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND medio (differenziazione) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Cult Basal Medium-A </td><td> StemCell Technologies </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Knockout sostituzione siero </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 integratore </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> ITS Supplement-B </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07155 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Acido ascorbico </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07157 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> -I Glutamax </td><td>Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> D-glucosio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> 0,15% in d 2 H 2 O </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07159 </td><td> 5 pg / ml </td></tr><tr><td> Eparina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 20 ug / ml in d 2 H 2 O </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanolo </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> Acido Retinoico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R-2625 </td><td> 1 pM </td></tr><tr><td> SAG </td><td> EMD Chemicals </td><td> 566660 </td><td> 1 pM </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> MND medio (Motor Neuron cultura) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> ES-Cult Basal Medium-A </td><td> StemCell Technologies </td><td> 5801 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Knockout sostituzione siero </td><td> Invitrogen </td><td> 10828-028 </td><td> 10% </td></tr><tr><td> N-2 integratore </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> ITS Supplement-B </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07155 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Acido ascorbico </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07157 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> Penicillina / streptomicina </td><td> Millipore </td><td> TMS-AB2-C </td><td> 1% </td></tr><tr><td> -I Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> 35050-061 </td><td> 1% </td></tr><tr><td> D-glucosio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-8270 </td><td> 0,15% in d 2 H 2 O </td></tr><tr><td> Fibronectina </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07159 </td><td> 5 pg / ml </td></tr><tr><td> Eparina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> H3149 </td><td> 20 ug / ml in d 2 H 2 O </td></tr><tr><td> β-mercaptoetanolo </td><td> Millipore </td><td> ES-007-E </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> BDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 248-BD-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> CNTF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 257-NY-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> GDNF </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 212-GD-010/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr><tr><td> NT-3 </td><td> R &amp; D Systems </td><td> 267-N3-005/CF </td><td> 10 ng / ml </td></tr></tbody></table> NA = Non applicabile. Tabella 1. PMEF e dei media per la cultura o la differenziazione delle cellule MES. <table border="1"><tbody><tr><td> &lt;&gt; Nome forte del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Concentrazione finale </td></tr><tr><td> 0,1% gelatina </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07903 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Poly-DL-ornitina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P0421 </td><td> 0,1 mg / ml in d 2 H 2 O </td></tr><tr><td> Mouse laminina </td><td> Millipore </td><td> CC095 </td><td> 2 ug / ml in PBS </td></tr><tr><td> 0,25% di tripsina / EDTA </td><td> StemCell Technologies </td><td> 07901 </td><td> NA </td></tr><tr><td> Accumax </td><td> Millipore </td><td> SCR006 </td><td> NA </td></tr></tbody></table> NA = Non applicabile. Tabella 2. Reagenti per il rivestimento e la dissociazione.

efficient differentiation of mouse embryonic stem cells into motor neurons

Differenziazione diretta delle staminali embrionali (ES) in cellule funzionali motoneuroni rappresenta una risorsa promettente per studiare i meccanismi della malattia, per lo screening di nuovi composti farmacologici, e per sviluppare nuove terapie per malattie del motoneurone come l&#39;atrofia muscolare spinale (SMA) e la sclerosi laterale amiotrofica ( ALS). Molti attuali protocolli utilizzano una combinazione di acido retinoico (RA) e sonic hedgehog (Shh) per differenziare staminali embrionali di topo (MES), le cellule in neuroni motori 1-4. Tuttavia, l&#39;efficienza differenziazione delle cellule SEM nel motore neuroni ha soltanto incontrato con discreto successo. Abbiamo sviluppato un protocollo due fasi differenziazione 5 che migliora significativamente l&#39;efficienza di differenziazione rispetto a protocolli attualmente applicate. Il primo passo è di migliorare il processo neuralization aggiungendo Noggin e fattori di crescita dei fibroblasti (FGF). Noggin è una proteina morfogenetica dell&#39;osso (BMP), antagonista ed è implicato in uno induzione neuraleecondo al modello predefinito di neurogenesi e risulta nella formazione di anteriore patterning neurale 6. FGF segnalazione agisce sinergicamente con Noggin nell&#39;indurre la formazione di tessuto neurale attraverso la promozione di una identità neurale posteriore 7-9. In questa fase, le cellule sono state MES innescato con Noggin, bFGF, e FGF-8 per due giorni per promuovere la differenziazione verso lignaggi neurali. Il secondo passo è quello di indurre le specifiche dei neuroni motori. Noggin / FGFs esposti MES cellule sono state incubate con RA e un agonista Shh, agonista Smoothened (SAG), per altri 5 giorni per facilitare la generazione dei neuroni motori. Per monitorare la differenziazione di MES in neuroni motori, abbiamo utilizzato una linea di cellule ES derivata da un topo transgenico che esprime eGFP sotto il controllo del promotore motore neurone specifico HB9 1. Usando questo protocollo robusto, abbiamo raggiunto 51 ± 0,8% di efficienza differenziazione (n = 3; p &lt;0,01, t di Student-test) 5. I risultati di immunofluorescenzacolorazione ha dimostrato che le cellule GFP + esprimere i marcatori dei motoneuroni specifici, Islet-1 e colina acetiltransferasi (Chat). I nostri due fasi protocollo di differenziazione offre un modo efficace per differenziare le cellule MES in neuroni motori spinali.

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Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Abbiamo sviluppato un nuovo protocollo per migliorare l&#39;efficienza del differenziamento in vitro delle cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori. Le cellule staminali differenziate acquisito motoneuroni presenta come evidenziato dalla espressione di marcatori neuronali e motorie dei neuroni che utilizzano tecniche immunoistochimiche.

Differenziazione efficiente di cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori

Direct differentiation of embryonic stem (ES) cells into functional  motor neurons represents a promising resource to study disease mechanisms, to  screen ...

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Research

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Biology

22.2K Views.  Alfred I. duPont Hospital for Children. Abbiamo sviluppato un nuovo protocollo per migliorare l'efficienza del differenziamento in vitro delle cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori. Le cellule staminali differenziate acquisito motoneuroni presenta come evidenziato dalla espressione di marcatori neuronali e motorie dei neuroni che utilizzano tecniche immunoistochimiche.

Video: Efficient Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Motor Neurons

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as well as the generation of mature neural cell types for further study. In this protocol we describe a method for the differentiation of ESC to neural progenitors using serum-free, monolayer culture. The method is scalable, efficient and results in production of ~70% neural progenitor cells within 4 - 6 days. It can be applied to ESC from various strains grown under a variety of conditions. Neural progenitors can be allowed to differentiate further into functional neurons and glia or analyzed by microscopy, flow cytometry or molecular techniques. The differentiation process is amenable to time-lapse microscopy and can be combined with the use of reporter lines to monitor the neural specification process. We provide detailed instructions on media preparation and cell density optimization to allow the process to be applied to most ESC lines and a variety of cell culture vessels.

This protocol describes in detail the method for generating neural progenitors from embryonic stem cells using a serum-free monolayer method. These progenitors can be used to derive mature neural cell types or to study the process of neural specification and is amenable to multiwell format scaling for compound screening.

Differenziamento neurale delle cellule staminali embrionali di topo in siero privo monostrato Cultura

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

Differenziazione neurale efficiente utilizzando la coltura a cella singola di cellule staminali embrionali umane

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

Differenziazione e caratterizzazione di progenitori neurali e neuroni da cellule staminali embrionali di topo

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant interest in deriving a pure population of lineage-committed oligodendrocyte precursor cells (OPCs) for transplantation. OPCs are characterized by the activity of the transcription factor Olig2 and surface expression of a proteoglycan NG2. Using the GFP-Olig2 (G-Olig2) mouse embryonic stem cell (mESC) reporter line, we optimized conditions for the differentiation of mESCs into GFP+Olig2+NG2+ OPCs. In our protocol, we first describe the generation of embryoid bodies (EBs) from mESCs. Second, we describe treatment of mESC-derived EBs with small molecules: (1) retinoic acid (RA) and (2) a sonic hedgehog (Shh) agonist purmorphamine (Pur) under defined culture conditions to direct EB differentiation into the oligodendroglial lineage. By this approach, OPCs can be obtained with high efficiency (&gt;80%) in a time period of 30 days. Cells derived from mESCs in this protocol are phenotypically similar to OPCs derived from primary tissue culture. The mESC-derived OPCs do not show the spiking property described for a subpopulation of brain OPCs in situ. To study this electrophysiological property, we describe the generation of spiking mESC-derived OPCs by ectopically expressing NaV1.2 subunit. The spiking and nonspiking cells obtained from this protocol will help advance functional studies on the two subpopulations of OPCs.

We describe a small molecule-based protocol for differentiation of mouse embryonic stem cells into oligodendrocyte precursor cells (OPCs). This protocol generates Olig2+NG2+ OPCs with high efficiency by 30 days of differentiation. We also describe a method to generate "spiking" OPCs that can fire action potentials.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali in precursori degli oligodendrociti

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Biologia

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in precursori Interneurone corticale

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Neuroscienze

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into motor neuron is obtained by ectopic expression of alternative modules of transcription factors, namely Ngn2, Isl1 and Lhx3 (NIL) or Ngn2, Isl1 and Phox2a (NIP). NIL and NIP specify, respectively, spinal and cranial motor neuron identity. Our protocol starts with the generation of modified iPSC lines in which NIL or NIP are stably integrated in the genome via a piggyBac transposon vector. Expression of the transgenes is then induced by doxycycline and leads, in 5 days, to the conversion of iPSCs into MN progenitors. Subsequent maturation, for 7 days, leads to homogeneous populations of spinal or cranial MNs. Our method holds several advantages over previous protocols: it is extremely rapid and simplified; it does not require viral infection or further MN isolation; it allows generating different MN subpopulations (spinal and cranial) with a remarkable degree of maturation, as demonstrated by the ability to fire trains of action potentials. Moreover, a large number of motor neurons can be obtained without purification from mixed populations. iPSC-derived spinal and cranial motor neurons can be used for in vitro modeling of Amyotrophic Lateral Sclerosis and other neurodegenerative diseases of the motor neuron. Homogeneous motor neuron populations might represent an important resource for cell type specific drug screenings.

Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors

This protocol allows rapid and efficient conversion of induced pluripotent stem cells into motor neurons with a spinal or cranial identity, by ectopic expression of transcription factors from inducible piggyBac vectors.

Conversione di cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo (IPSC) in neuroni motore spinale e cranico funzionale utilizzando vettori PiggyBac

We describe here a method to obtain functional spinal and cranial motor neurons from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). Direct conversion into ...

Neuronal Differentiation from Mouse Embryonic Stem Cells In vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and potentially aid in regenerative medicine. Here, we established an efficient and low cost method for neuronal differentiation from mESCs in vitro, using the strategy of combinatorial screening. Under the conditions defined here, the 2-day embryoid body formation + 6-day retinoic acid induction protocol permits fast and efficient differentiation from mESCs into neural precursor cells (NPCs), as seen by the formation of well-stacked and neurite-like A2lox and 129 derivatives that are Nestin positive. The healthy state of embryoid bodies and the timepoint at which retinoic acid (RA) is applied, as well as the RA concentrations, are critical in the process. In the subsequent differentiation from NPCs into neurons, N2B27 medium II (supplemented by Neurobasal medium) could better support the long term maintenance and maturation of neuronal cells. The presented method is highly efficiency, low cost and easy to operate, and can be a powerful tool for neurobiology and developmental biology research.

Here, we established a low cost and easy to operate method that directs fast and efficient differentiation from embryonic stem cells into neurons. This method is suitable for popularization among laboratories and can be a useful tool for neurological research.

Differenziazione neuronale dalle cellule staminali embrionali del topo in vitro

The neural differentiation of mouse embryonic stem cells (mESCs) is a potential tool for elucidating the key mechanisms involved in neurogenesis and ...

Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells into a Networked Neuron Population

Source: Hubbard, K. et al., <a href="https://app.jove.com/v/52361">Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons.</a>&#160;J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates a technique for embryonic stem cell differentiation into a networked population of neurons with functioning synapses. It outlines the steps involved in embryonic stem cell differentiation into neurons, induction of neuronal network formation, and enrichment of the culture with networked neurons.

Differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo in una popolazione di neuroni in rete

1. Neuronal Differentiation
NOTE: Conduct steps 1.1 - 1.5 before noon and step 1.7 after noon. An overview of the differentiation procedures is presented ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroscience

Neuronal Culture Techniques

Advanced Neuronal Models

Differentiation of Spinal Cord Neural Progenitor Cells into Motor Neurons

If the neural progenitor cell cultures were frozen, thaw them. After medium exchange and PBS rinsing as described in the manuscript, change the medium with a motor neuron differentiation medium containing 0.02 micromolar cytosine arabinoside.
Then, incubate the cells for 48 hours at 37 degrees Celsius and 5% carbon dioxide when glial-committed progenitors emerge as single proliferating flat cells under post-mitotic motor neuron progenitors aggregated in cell clusters. Later, perform medium exchange as indicated in the manuscript.

Differenziazione delle cellule progenitrici neurali del midollo spinale in motoneuroni

EoE Sub Articles

Differentiation of Neural Progenitor Cells into Neurons

Seed about 500,000 mouse embryonic stem cell derivatives in 2 milliliters of basal differentiation medium per well onto the 0.1% gelatin-coated plates. Randomly divide the derivatives into three groups in order to test three phase II differentiation protocols. Incubate the plate for six hours. Then, wash the cells twice with 2 milliliters of PBS and add 2 milliliters of basal differentiation medium, N2 B27 medium 1, or N2 B27 medium 2 to each well, depending on the protocol. Place the plates into the incubator, and allow the cells to differentiate for another 10 days, changing the corresponding medium every two days.