1. Tirare Micropipette di vetro Attrezzatura: Micropipetta Puller, microforgia. Vetro: Boroscillicate capillari di vetro (~ diametro 1,5 mm esterno, ~ 1.4 mm di diametro interno). <ol><li> Micropipette sono tirati utilizzando lo stesso approccio di base che viene usato per preparare microelettrodi di vetro per registrazioni elettrofisiologiche. Brevemente, un capillare di vetro viene riscaldata nel mezzo e quando il vetro inizia a fondere le due metà del capillare sono staccati generando due micropipette. Più estrattori commerciali sono a disposizione per eseguire questo processo vanno da estrattori verticali relativamente semplici che utilizzano la gravità per tirare le due pipette a parte per estrattori orizzontali altamente sofisticati che offrono molteplici opzioni programmabili per variare la velocità e altri parametri del tiro. Entrambi i tipi di estrattori sono stati utilizzati nei nostri esperimenti. </li><li> Requisitos per la geometria della punta della pipetta: Le punte delle pipette usate in questi esperimenti in genere varia tra 2 a 6 micron di diametro esterno a seconda delle dimensioni della cella. Un altro importante parametro è la forma della punta, che dovrebbe approssimare un tubo cilindrico (vedi Figura 1). Questo può essere ottenuto ottimizzando i parametri del tiro e verificando la forma della punta al microscopio finché la forma desiderata. La lunghezza ottimale del gambo della pipetta dipende dalla quantità di deformazione prevista: se le deformazioni sono piccole &lt;10 micron, è sufficiente che il cilindro come parte della pipetta è anche relativamente breve (stesso ordine di grandezza), per ingrandire deformazioni regolare di conseguenza. In generale, aumentando il calore e / o aumento di &quot;pull&quot; riduce il diametro della punta. L&#39;incremento dei &quot;pull&quot; genera anche una punta con un cono più lungo. Nei nostri esperimenti, con un P-97 orizzontale pipetta Sutter estrattore, il programma è statoottimizzato per i seguenti parametri: Calore di 473, Pull 22; Velocity 22, 200; Tempo di pressione 500. È anche possibile creare punte cilindriche tirando un gambo molto lungo e quindi di rottura e lucidatura. Istruzioni dettagliate su come preparare diversi tipi di pipette sono riportati nel manuale Sutter. </li><li> Microforgia: Si raccomanda inoltre al fuoco-lucidare la punta della pipetta per generare una superficie liscia di vetro che lo rende una buona tenuta alla membrana plasmatica. Questo viene fatto portando la punta della pipetta per la vicinanza di una sfera di vetro riscaldata per molto una frazione di secondo, usando un microforgia. Tecnica simile viene solitamente usata per la preparazione di microelettrodi per le registrazioni elettrofisiologiche. </li><li> Riempiendo la micropipetta: micropipette devono essere riempiti con una soluzione salina fisiologica, come PBS o non fluorescenti terreni di crescita. È importante sottolineare che la soluzione deve essere integrato con il 30% di siero che permetterà al mem cellabrana per passare agevolmente nella pipetta. Due approcci possono essere utilizzati per liberarsi di bolle d&#39;aria nella punta della pipetta: (i) una punta della pipetta può essere immerso nella soluzione prima per consentire al liquido di riempire la punta dalle forze capillari seguite da ricoprire lo pipetta dall&#39;altra estremità o (ii) l&#39;intera pipetta può essere riempito dall&#39;estremità posteriore picchiettando delicatamente sul gambo della pipetta per rimuovere le bolle dalla punta. </li><li> Nota: Le pipette devono essere preparate il giorno dell&#39;esperimento. </li></ol> 2. Preparazione delle cellule <ol><li> Semina delle cellule: microaspirazione viene eseguita su singole cellule che sono o mantenute in sospensione o sono attaccati al substrato. Per aspirare le cellule in sospensione, le cellule vengono sollevati dai loro substrati e pipettati in una camera poco profonda longitudinale che è montato sul microscopio invertito destra prima dell&#39;esperimento. Per aspirare substrato collegati in cellule, le cellulesono seminate su piccoli cover-tagliandi (~ 10 mm di diametro) che può anche essere collocato nella camera di microaspirazione prima dell&#39;esperimento. La logica di utilizzare una camera poco profonda longitudinale è quello di consentire una micropipetta per avvicinarsi alle cellule con un angolo molto superficiale, il più vicino possibile orizzontale. Questo viene fatto per consentire la membrana tirato in micropipetta da visualizzare su un unico piano di messa a fuoco (vedere Figura 2). </li><li> Visualizing membrana cellulare: Per osservare la proiezione membrana nella pipetta, membrane cellulari vengono colorate con un colorante lipofilo fluorescente, come DII utilizzando un protocollo standard di colorazione. <ol type="i"><li> Caldo PBS soluzione. </li><li> Diluire il DII magazzino ad una concentrazione di lavoro (5 pM) con la soluzione riscaldata PBS. </li><li> Ultrasuoni per 5 minuti per rompere gli aggregati di colorante. </li><li> Centrifugare per 5 minuti e prendere surnatante. </li><li> Lavare le cellule in PBS 3 volte, ogni 5 min. </li><li> Incubare le cellule con il colorante in modozione per 30 min a 37 ° C incubatore. </li><li> Lavare le cellule con PBS 3 volte per 5 minuti ciascuno. </li></ol></li><li> Nota: È possibile sostituire DII colorazione della membrana con la visualizzazione del sub-membrana citoscheletro che viene anche tirato insieme con la membrana nella pipetta. Si deve tener conto, tuttavia, che perturbando il citoscheletro può alterare le proprietà biomeccaniche della cella. Inoltre, quando si esegue esperimenti con cellule microaspirazione substrato allegate, si raccomanda di utilizzare l&#39;imaging 3D per valutare la lunghezza della proiezione membrana nella pipetta che è posizionato ad un angolo rispetto al piano focale delle cellule. </li></ol> 3. Microaspirazione e Acquisizione di immagini Attrezzatura: invertito microscopio a fluorescenza, preferibilmente con capacità di deconvoluzione 3D (Zeiss Axiovert 200M con controllo computerizzato asse Z movimento della oggettivitaes o equivalente), videocamera collegata a un computer (AxioCam MRm o equivalente), trasduttore di pressione (BioTek o equivalente), esente da vibrazioni stazione (TMD o equivalente), Micromanipolatore (Narishige, Sutter, Burleigh o equivalente; manipolatori possono essere di tipo meccanico, idraulico o piezoelettrico). È anche importante sottolineare che microaspirazione può essere eseguita utilizzando un microscopio senza funzionalità 3D per stimare la rigidità di cellule in sospensione, come 1,2 globuli rossi o neutrofili 3, organelli isolati come nuclei 4 o 5 liposomi artificiali. Immagine del software di acquisizione: Zeiss AxioVision o un equivalente. <ol><li> Montare le cellule in una camera microaspirazione, come descritto sopra, su un microscopio invertito a fluorescenza. Posizionare le celle scegliendo una cella per un esperimento e posizionarlo al centro del campo visivo. È importante perform questi esperimenti in un ambiente privo di vibrazioni, in particolare per gli esperimenti con substrato-attached cellule, perché le vibrazioni minuto che si manifestano in genere su panche e tavoli regolari rischiano di compromettere completamente la creazione del sigillo, rompere la punta della micropipetta o provocare significativi spostamenti nella posizione della punta che si distorga l&#39;analisi dei risultati. </li><li> Posizionare una micropipetta riempita con PBS / media w / soluzione di siero in una portapipette collegato ad un trasduttore di potenza dal tubo flessibile con il diametro adeguato al connettore del titolare pipetta per una perfetta tenuta. All&#39;inizio di ogni esperimento la pressione nella pipetta viene equilibrata alla pressione atmosferica. La pipetta è montato su un micromanipolatore che permette un controllo preciso dei movimenti pipetta in un intervallo micron. Posizionare una pipetta con un angolo basso al fondo della camera e portare la punta della pipetta al centro del campo visivo. The gambo della pipetta, una parte cilindrica della punta della pipetta nel quale viene aspirata la membrana, è allineato orizzontalmente al piano focale (1) posizionamento della pipetta al shallowest possibile angolo (10-15 °) e (2) da flettendo il gambo della pipetta contro il fondo della camera. Perché il gambo è molto sottile è sufficientemente flessibile per scorrere sul fondo della camera, mentre si avvicina una cella, come mostrato schematicamente nella figura 1. Lentamente abbassare la micropipetta al lato di una singola cella utilizzando il manipolatore corso fino in prossimità del piano di messa a fuoco per la cella. Quindi, utilizzando un manipolatore multa spostare la micropipetta al bordo della cella finché la punta della pipetta tocca delicatamente la membrana. Prendere una immagine per osservare la posizione della pipetta. Tenute buone vengono creati quando la punta tutta la pipetta è completamente a contatto con la superficie cellulare e il contatto è stabile. Non vi è alcun criterio oggettivo forte, tuttavia, di quanto è buono il sigillo è escEPT per l&#39;esame visivo. </li><li> Applicare una fase di pressione negativa con il trasduttore e mantenerla fino proiezione membrana è stabilizzata. La pressione necessaria per aspirare la membrana nella pipetta varia a seconda del tipo cellulare e specifiche condizioni sperimentali. Nei nostri esperimenti, deformazione iniziale si osserva tipicamente quando si applica pressione nell&#39;intervallo tra -2 e-15mm Hg. Quando la pressione viene applicata, la membrana viene progressivamente deformata nella pipetta finché è stabilizzato a certa lunghezza, un processo che richiede tipicamente 2-3 min. Durante questo tempo, le immagini di deformazione della membrana vengono acquisiti ogni 30 sec per monitorare la progressione della membrana che viene tirato nella pipetta. </li><li> Aumentare la pressione al livello successivo in 2-5 passaggi mmHg e ripetere la procedura fino proiezione stacca dalla membrana cellulare e si muove nella pipetta, a questo punto si ferma l&#39;esperimento. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. Analisi Per quantificare il grado di deformazione della membrana, la lunghezza aspirato (L) viene misurata dalla punta della pipetta sul vertice della circonferenza della proiezione membrana. È importante notare, tuttavia, che la pipetta si applica più grande forza sulla membrana cellulare allo stesso livello di pressione. Per tenere conto della variabilità tra i diametri delle pipette, pertanto, la lunghezza aspirato viene normalizzato per il diametro pipetta (D) misurata per ciascun esperimento. I dati possono essere ulteriormente analizzati utilizzando uno standard lineare viscoelastico semispazio modello della cellula endoteliale, come descritto nei precedenti studi 6,7. In particolare, il modulo elastico delle cellule è stata valutata utilizzando l&#39;equazione: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/3886/3886eq1.jpg" /> dove E è il modulo di Young, a è l&#39;internoraggio della pipetta, Dp è la differenza di pressione, L è la lunghezza corrispondente aspirato, e φ (η) è una parete funzionamento calcolato utilizzando il modello di forza, come descritto da Theret et al 7. È importante notare che i modelli multipli sono stati utilizzati per analizzare i dati microaspirazione compreso un modello ad elementi finiti che presuppone che una cellula è una sfera deformabile con proprietà di materiale isotropo e omogeneo e modelli goccia di liquido, che assumono che cellule formano una forma sferica, può deformare continuamente, e recuperare a seguito di rilascio, come descritto in numerosi eccellenti recensioni: 8-10. Microaspirazione può anche essere usato per studiare altri parametri biomeccanici di cellule e tessuti, come le proprietà viscoelastiche cellulari, tensione corticale e contributo dei diversi elementi strutturali di biomeccanica cellule e tessuti (vedi le recensioni elencati sopra per maggiori informazioni). 5. RappresentanteRisultati In studi precedenti, l&#39;aspirazione micropipetta è stato effettuato con il 5 liposomi o su cellule che non sono stati attaccati al substrato 2,11-13. Nei nostri studi, tuttavia, le cellule sono aggiornati normalmente fissato al substrato per evitare variazioni della struttura citoscheletrica che possono verificarsi quando le cellule staccare 14-16. Per convalidare l&#39;uso della tecnica microaspirazione per substrato-attached cellule, abbiamo testato se mostra interruzione di F-actina determina la diminuzione della rigidità delle cellule delle cellule endoteliali aortiche bovine (BAECs), come stimato da questo approccio. Figura 3 che, come previsto , questo è davvero il caso. Specificamente, la Figura 3A mostra una tipica serie di immagini fluorescenti di una membrana endoteliale subire deformazioni progressive in risposta alla pressione negativa applicata attraverso una micropipetta. Come previsto, la membrana viene gradualmente aspirato nella pipetta e la aspiratlunghezza ed aumenta in funzione della pressione applicata. Il tempo-corsi di spettacolo deformazione che distruzione di F-actina aumenta significativamente le lunghezze aspirati delle proiezioni in tutte le condizioni di pressione (Figura 3B) 14. Usando questo approccio, abbiamo scoperto che la rigidità cellulare aumenta quando le membrane cellulari sono esaurite mentre arricchimento di colesterolo colesterolo non ha avuto effetto 14. Figura 4 mostra un colesterolo arricchita di cellule, una cellula di controllo, ed una cellula colesterolo impoverito dopo aver raggiunto lunghezze massime di aspirazione -15 mm Hg (4A). Le proiezioni di solito ha iniziato a svilupparsi a 10 mmHg, e il tempo-corsi di deformazione della membrana può essere misurata per le pressioni negative di -10, -15 e -20 mm Hg (4B). Applicazione di pressioni superiori-25mmHg provocato il distacco della sporgenza aspirato formando una vescicola separata. Il livello di pressione che ha provocato il distacco della membrana era similar in diverse condizioni di colesterolo. Questa osservazione è molto inaspettato perché studi precedenti hanno mostrato che in bistrati lipidici di membrana un aumento del colesterolo membrana aumenta la rigidità della membrana 5,17. I nostri studi hanno confermato queste osservazioni che utilizzano diversi approcci indipendenti, tra cui microscopia a forza atomica e microscopia 18,19 Forza di trazione 20. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig1.jpg" /> Figura 1. Vista laterale schematica di una pipetta di registrazione. La pipetta è tirato per generare un codolo cilindrico alla punta (vista laterale). Parametri micropipetta: D = 2a = diametro interno e ED = 2b = diametro esterno. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig2.jpg" /> Figura 2. Micropipetta avvicina un substrato-attached cella (A) vista laterale schematica,. (B) di contrasto immagine luminosa di una micropipetta smatassa toccando una cella tipicamente sagomato utilizzato in esperimenti di aspirazione; (C) immagine fluorescente della stessa cella etichettata con DiIC 18. La micropipetta è ancora presente ma è invisibile (da 14). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig3.jpg" /> Figura 3. Validazione di misurare la rigidità delle cellule nel substrato-attached celle utilizzando microaspirazione. A: Immagini di deformazione della membrana progressiva BAECs in condizioni di controllo e dopo l&#39;esposizione latrunculin La pipetta è invisibile sulle immagini perché non è fluorescente.. Le cellule sono state esposte a pM latrunculin 2 A per 10 minuti, che riduce drasticamente la quantità di F-actina, come misurato da rodamina falloidina fluorescenza (non mostrato), ma non ha avuto effetto significativo sulla forma cellulare. In un latrunculin trattata cella, esiste un assottigliamento della membrana nel mezzo della proiezione aspirato ma la proiezione è ancora collegato alla cells. B. Un effetto di latrunculin sui relativi tempi di deformazione della membrana dove viene aspirato L lunghezza della proiezione membrana e D è il diametro della pipetta per cellule di controllo (n = 14) e cellule esposte a 2 latrunculin pM A per 10 min (n = 5). Le cellule sono state aspirato con -10 mm Hg (diamanti), -15 mm Hg (quadrati) e 20 mm Hg (triangoli). (Dal 14.) <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/3886/3886fig4.jpg" /> Figura 4. Effetto dei livelli di colesterolo cellulare su deformazione della membrana di BAECs. . A immagini tipiche di deformazione della membrana di colesterolo-arricchito, colesterolo impoverito e cellule di controllo (cellule di controllo sono stati esposti a MβCD: MβCD-colesterolo miscela in rapporto 1:1 che non aveva alcun effetto sul livello di colesterolo libero nelle cellule (vedi inserto). Le immagini mostrate raffigurano la deformazione massima a -15 mm Hg. La freccia indica la posizione della proiezione aspirato. Il bar è di 30 micron. B. Tempo medio-corsi di lunghezza aspirati per le tre popolazioni di cellule sperimentali. C. Lunghezze massime aspirati tracciata in funzione della pressione applicata. La lunghezza massima normalizzata in cellule impoverito era significativamente inferiore a quello delle cellule di controllo per pressioni -15 mmHg e -20 mmHg (P &lt;0,05). (Dal 14.)

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Cell. 15, 3475-3484 (2004).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rho+GTPases+and+the+Actin+Cytoskeleton.">Rho GTPases and the Actin Cytoskeleton.</a> Science. 279, 509-514 (1998).</li><li>Okajima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+for+the+Examination+of+Single+Cell+Rheology.+In.">Atomic Force Microscopy for the Examination of Single Cell Rheology. In.</a> Methods Mol. Biol. 736, 303-329 (2011).</li><li>Wang, N., Butler, J. P., Ingber, D. 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J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+cytoskeletal+prestress.">Mapping the cytoskeletal prestress.</a> American Journal of Physiology - Cell Physiology. 298, C1245-C1252 (2010).</li><li>Munevar, S., Wang, Y., Dembo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traction+force+microscopy+of+migrating+normal+and+H-ras+transformed+3T3+fibroblasts.">Traction force microscopy of migrating normal and H-ras transformed 3T3 fibroblasts.</a> Biophys. J. 80, 1744-1757 (2001).</li><li>Wirtz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle-tracking+microrheology+of+living+cells:+principles+and+applications.">Particle-tracking microrheology of living cells: principles and applications.</a> Annu. Rev. Biophys. 38, 301-326 (2009).</li><li>Shin, D., Athanasiou, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoindentation+for+obtaining+cell+biomechanical+properties.">Cytoindentation for obtaining cell biomechanical properties.</a> J. Orthop. Res. 17, 880-890 (1999).</li><li>Ou-Yang, H. D., Wei, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+fluids:+probing+mechanical+properties+of+biological+systems+with+optical+tweezers.">Complex fluids: probing mechanical properties of biological systems with optical tweezers.</a> Annu. Rev. Phys. Chem. 61, 421-440 (2010).</li><li>Hosu, B. G., Sun, M., Marga, F., Grandbois, M., Forgacs, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+membrane+tethers+revisited+using+magnetic+tweezers.">Eukaryotic membrane tethers revisited using magnetic tweezers.</a> Phys. Biol. 4, 67-78 (2007).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Microaspirazione fornisce un metodo semplice e altamente riproducibili stimare rigidità cellule / deformabilità applicando pressione negativa ad una membrana cellulare e misurare la deformabilità della membrana in risposta alla pressione ben definita. È stato inizialmente sviluppato da Mitchison e Swann (1954) per caratterizzare le proprietà elastiche dei ricci di mare uova di fornire uno sguardo sui meccanismi di divisione cellulare 21 e poi a guardare le proprietà meccaniche dei globuli rossi 1.<...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Catalogo / Numero del modello </td><td> Commenti </td></tr><tr><td> Sutter pipetta estrattore </td><td> Sutter Instruments </td><td> P-97 </td><td></td></tr><tr><td> Microforgia </td><td> Narishige </td><td> MF-830 </td><td></td></tr><tr><td> Invertito microscopio a fluorescenza </td><td> Zeiss </td><td> Axiovert 200M </td><td> Il microscopio deve essere preferibilmente dotata di capacità 3D/deconvolution. </td></tr><tr><td> Videocamera </td><td> Zeiss </td><td> AxioCam MRm </td><td></td></tr><tr><td> Acquisizione di immagini sotware </td><td> Zeiss </td><td> AxioVision </td><td></td></tr><tr><td> Trasduttore di pressione pneumatica </td><td> BioTek </td><td> DPM-1B </td><td> DPM1B Tester trasduttore pneumatico può essere trovato da FLUKE. </td></tr><tr><td> Pipetta di vetro </td&gt; <td> Richland </td><td> Vetro su misura </td><td> Pipette sono stati personalizzati con un diametro interno 1,2 e 1,6 diametro esterno. </td></tr><tr><td> DiI Dye </td><td> Invitrogen </td><td> D282 </td><td> Si scioglie bene in DMSO </td></tr></tbody></table>

micropipette aspiration of substrate-attached cells to estimate cell stiffness

Crescente numero di studi dimostrano che le proprietà biomeccaniche delle singole cellule svolgono un ruolo importante in molteplici funzioni cellulari, tra cui la proliferazione cellulare, la differenziazione, la migrazione e interazioni cellula-cellula. I due parametri chiave di biomeccanica cellulari sono deformabilità cellulare o rigidità e la capacità delle cellule di contrarsi e generare forza. Qui si descrive un metodo rapido e semplice per valutare la rigidità cellulare misurando il grado di deformazione della membrana in risposta alla pressione negativa applicata da una micropipetta di vetro alla superficie cellulare, una tecnica che si chiama Aspirazione Micropipetta o microaspirazione. Microaspirazione viene eseguita tirando un capillare di vetro per creare una micropipetta con una punta molto piccola (2-50 micron di diametro a seconda delle dimensioni di una cellula o di un campione di tessuto), che viene poi collegato ad un trasduttore di pressione pneumatica e portato a termine prossimità di una cellula al microscopio. Quando l&#39;punta della pipetta tocca una cella, una fase di pressione negativa è applicata alla pipetta dal trasduttore di pressione pneumatica di generazione di pressione ben definito sulla membrana cellulare. In risposta alla pressione, la membrana viene aspirata nella deformazione della membrana pipetta e progressivo o &quot;proiezione membrana&quot; nella pipetta viene misurato in funzione del tempo. Il principio di base di questo approccio sperimentale è che il grado di deformazione della membrana in risposta ad una forza meccanica definita è una funzione della rigidezza della membrana. La membrana è più rigido, più lenta è la velocità di deformazione della membrana e più breve è il regime tecnica length.The aspirazione può essere eseguita su cellule isolate, sia in sospensione e substrato-annessi, organelli grandi, e liposomi. Analisi viene eseguita confrontando deformazioni della membrana massimi raggiunti sotto una data pressione di diverse popolazioni cellulari o condizioni sperimentali. Un &quot;coefficiente di rigidezza&quot; è estimated tracciando la lunghezza aspirato di deformazione della membrana in funzione della pressione applicata. Inoltre, i dati possono essere ulteriormente analizzati per stimare il modulo di Young delle cellule (E), il parametro più comune per caratterizzare rigidità dei materiali. È importante notare che la membrana plasmatica delle cellule eucariotiche possono essere visti come una bi-componente in cui è underlied bistrato lipidico di membrana dalla sub-membrana citoscheletro e che è il citoscheletro che costituisce l&#39;impalcatura meccanica della membrana e domina la deformabilità della busta cellulare. Questo approccio, pertanto, permette di sondare le proprietà biomeccaniche del sub-membrana citoscheletro.

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Micropipette Aspiration of Substrate-attached Cells to Estimate Cell Stiffness

Qui si descrive un metodo rapido e semplice per misurare la rigidità delle cellule. Il principio generale di questo approccio è di misurare la deformazione della membrana in risposta a ben definito pressione negativa applicata mediante una micropipetta alla superficie cellulare. Questo metodo fornisce un potente strumento per studiare le proprietà biomeccaniche del substrato-attached cellule.

Aspirazione Micropipetta di celle substrato-attached per Stima rigidità cellulare

Growing number of studies show that biomechanical properties of individual cells play major roles in multiple cellular functions, including cell ...

micropipette-aspiration-substrate-attached-cells-to-estimate-cell

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.8K Views.  University of Illinois. Qui si descrive un metodo rapido e semplice per misurare la rigidità delle cellule. Il principio generale di questo approccio è di misurare la deformazione della membrana in risposta a ben definito pressione negativa applicata mediante una micropipetta alla superficie cellulare. Questo metodo fornisce un potente strumento per studiare le proprietà biomeccaniche del substrato-attached cellule.

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Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic valve leaflets are composed of interstitial cells suspended within an extracellular matrix (ECM) and are lined with an endothelial cell monolayer. The valve withstands a harsh, dynamic environment and is constantly exposed to shear, flexion, tension, and compression. Research has shown calcific lesions in diseased valves occur in areas of high mechanical stress as a result of endothelial disruption or interstitial matrix damage1-3. Hence, it is not surprising that epidemiological studies have shown high blood pressure to be a leading risk factor in the onset of aortic valve disease4. 
The only treatment option currently available for valve disease is surgical replacement of the diseased valve with a bioprosthetic or mechanical valve5. Improved understanding of valve biology in response to physical stresses would help elucidate the mechanisms of valve pathogenesis. In turn, this could help in the development of non-invasive therapies such as pharmaceutical intervention or prevention. Several bioreactors have been previously developed to study the mechanobiology of native or engineered heart valves6-9. Pulsatile bioreactors have also been developed to study a range of tissues including cartilage10, bone11 and bladder12. The aim of this work was to develop a cyclic pressure system that could be used to elucidate the biological response of aortic valve leaflets to increased pressure loads. 
The system consisted of an acrylic chamber in which to place samples and produce cyclic pressure, viton diaphragm solenoid valves to control the timing of the pressure cycle, and a computer to control electrical devices. The pressure was monitored using a pressure transducer, and the signal was conditioned using a load cell conditioner. A LabVIEW program regulated the pressure using an analog device to pump compressed air into the system at the appropriate rate. The system mimicked the dynamic transvalvular pressure levels associated with the aortic valve; a saw tooth wave produced a gradual increase in pressure, typical of the transvalvular pressure gradient that is present across the valve during diastole, followed by a sharp pressure drop depicting valve opening in systole. The LabVIEW program allowed users to control the magnitude and frequency of cyclic pressure. The system was able to subject tissue samples to physiological and pathological pressure conditions. This device can be used to increase our understanding of how heart valves respond to changes in the local mechanical environment.

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

A cyclic pressure bioreactor capable of subjecting heart valve tissue to physiological and pathological pressure conditions has been designed. A LabVIEW program allows users to control pressure magnitude, amplitude and frequency. This device can be used to study the mechanobiology of heart valve tissue or isolated cells.

Progettazione di un bioreattore per la pressione ciclica Ex Vivo Studio delle valvole cardiache aortica

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Ricerca

Bioingegneria

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells (hESC) to Different Lineages

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture indefinitely and differentiated to any cell types in the body. Various types of biomaterials have also been used in stem cell cultures to provide a microenvironment mimicking the stem cell niche1-3. The latter is important for promoting cell-to-cell interaction, cell proliferation, and differentiation into specific lineages as well as tissue organization by providing a three-dimensional (3D) environment4 such as encapsulation. The principle of cell encapsulation involves entrapment of living cells within the confines of semi-permeable membranes in 3D cultures2. These membranes allow for the exchange of nutrients, oxygen and stimuli across the membranes, whereas antibodies and immune cells from the host that are larger than the capsule pore size are excluded5. Here, we present an approach to culture and differentiate hESC DA neurons in a 3D microenvironment using alginate microcapsules. We have modified the culture conditions2 to enhance the viability of encapsulated hESC. We have previously shown that the addition of p160-Rho-associated coiled-coil kinase (ROCK) inhibitor, Y-27632 and human fetal fibroblast-conditioned serum replacement medium (hFF-CM) to the 3D platform significantly enhanced the viability of encapsulated hESC in which the cells expressed definitive endoderm marker genes1. We have now used this 3D platform for the propagation of hESC and efficient differentiation to DA neurons. Protein and gene expression analyses after the final stage of DA neuronal differentiation showed an increased expression of tyrosine hydroxylase (TH), a marker for DA neurons, &gt;100 folds after 2 weeks. We hypothesized that our 3D platform using alginate microcapsules may be useful to study the proliferation and directed differentiation of hESC to various lineages. This 3D system also allows the separation of feeder cells from hESC during the process of differentiation and also has potential for immune-isolation during transplantation in the future.

Alginate Microcapsule as a 3D Platform for Propagation and Differentiation of Human Embryonic Stem Cells hESC to Different Lineages

We have optimized a microencapsulation technique as an effective 3D platform for propagation and differentiation of embryonic stem cells to endoderm and dopaminergic (DA) neurons. It also provides an opportunity for immune-isolation of cells from the host during transplantation. This platform can be adapted for other cell types.

Microcapsule di alginato come piattaforma 3D per la propagazione e la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane (hESC) per diverse linee

Human embryonic stem cells (hESC) are emerging as an attractive alternative source for cell replacement therapy since they can be expanded in culture ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

Sviluppo, di espansione, e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoraggio delle cellule NK umane da cellule staminali embrionali umane (hESC) ed e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

Trapianto di progenitori miogenici pluripotenti derivati da cellule staminali indotte simili a mesoangioblasti nei modelli di topo di rigenerazione muscolare

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Ordering Single Cells and Single Embryos in 3D Confinement: A New Device for High Content Screening

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening based on cells in such environments have therefore serious limitations: cell organelles show extreme phenotypes, cell morphologies and sizes are heterogeneous and/or specific cell organelles cannot be properly visualized. In addition, cells in vivo are located in a 3D environment; in this situation, cells show different phenotypes mainly because of their interaction with the surrounding extracellular matrix of the tissue. In order to standardize and generate order of single cells in a physiologically-relevant 3D environment for cell-based assays, we report here the microfabrication and applications of a device for in vitro 3D cell culture. This device consists of a 2D array of microcavities (typically 105 cavities/cm2), each filled with single cells or embryos. Cell position, shape, polarity and internal cell organization become then normalized showing a 3D architecture. We used replica molding to pattern an array of microcavities, &#8216;eggcups&#8217;, onto a thin polydimethylsiloxane (PDMS) layer adhered on a coverslip. Cavities were covered with fibronectin to facilitate adhesion. Cells were inserted by centrifugation. Filling percentage was optimized for each system allowing up to 80%. Cells and embryos viability was confirmed. We applied this methodology for the visualization of cellular organelles, such as nucleus and Golgi apparatus, and to study active processes, such as the closure of the cytokinetic ring during cell mitosis. This device allowed the identification of new features, such as periodic accumulations and inhomogeneities of myosin and actin during the cytokinetic ring closure and compacted phenotypes for Golgi and nucleus alignment. We characterized the method for mammalian cells, fission yeast, budding yeast, C. elegans with specific adaptation in each case. Finally, the characteristics of this device make it particularly interesting for drug screening assays and personalized medicine.

We report a device and a new method to study cells and embryos. Single cells are precisely ordered in microcavity arrays. Their 3D confinement is a step towards 3D environments encountered in physiological conditions and allows organelle orientation. By controlling cell shape, this setup minimizes variability reported in standard assays.

Ordinazione di singole cellule e singola embrioni in 3D confinamento: Un nuovo dispositivo per l&#39;alta Screening contenuti

Biological cells are usually observed on flat (2D) surfaces. This condition is not physiological, and phenotypes and shapes are highly variable. Screening ...

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 &#8211; 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn&#8217;t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Semplice Poliacrilammide-based a più pozzetti Rigidità Assay per lo Studio della rigidezza-dipendenti le risposte delle cellule

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

A Method to Estimate Cadaveric Femur Cortical Strains During Fracture Testing Using Digital Image Correlation

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral surface obtained from mechanical testing. This optical method requires a texture of many contrasting fiduciary marks on a solid white background for accurate tracking of surface deformation as loading is applied to the specimen. Immediately prior to testing, the surface of interest in the camera view is painted with a water-based white primer and allowed to dry for several minutes. Then, a black paint is speckled carefully over the white background with special consideration for the even size and shape of the droplets. Illumination is carefully designed and set such that there is optimal contrast of these marks while minimizing reflections through the use of filters. Images were obtained through high speed video capture at up to 12,000 frames/s. The key images prior to and including the fracture event are extracted and deformations are estimated between successive frames in carefully sized interrogation windows over a specified region of interest. These deformations are then used to compute surface strain temporally during the fracture test. The strain data is very useful for identifying fracture initiation within the femur, and for eventual validation of proximal femur fracture strength models derived from Quantitative Computed Tomography-based Finite Element Analysis (QCT/FEA).

In this protocol, the femur surface strains are estimated during fracture testing using the digital image correlation technique. The novelty of the method involves application of a high-contrast stochastic speckle pattern on the femur surface, carefully specified illumination, high speed video capture, and digital image correlation analysis for strain calculations.

Un metodo per stimare il femore cadaverico corticale ceppi durante frattura test utilizzando correlazione di immagini digitali

This protocol describes the method using digital image correlation to estimate cortical strain from high speed video images of the cadaveric femoral ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by several researchers. However, most of these investigators have used polyacrylamide hydrogels for stem cell culture in their studies. Therefore, their results are controversial because those results might originate from the specific characteristics of the polyacrylamide and not from the physical cue (stiffness) of the biomaterials. Here, we describe a protocol for preparing hydrogels, which are not based on polyacrylamide, where various stem, cells including human embryonic stem (ES) cells and human induced pluripotent stem (iPS) cells, can be cultured. Hydrogels with varying stiffness were prepared from bioinert polyvinyl alcohol-co-itaconic acid (P-IA), with stiffness controlled by crosslinking degree by changing crosslinking time. The P-IA hydrogels grafted with and without oligopeptides derived from extracellular matrix were investigated as a future platform for stem cell culture and differentiation. The culture and passage of amniotic fluid stem cells, adipose-derived stem cells, human ES cells, and human iPS cells is described in detail here. The oligopeptide P-IA hydrogels showed superior performances, which were induced by their stiffness properties. This protocol reports the synthesis of the biomaterial, their surface manipulation, along with controlling the stiffness properties and finally, their impact on stem cell fate using xeno-free culture conditions. Based on recent studies, such modified substrates can act as future platforms to support and direct the fate of various stem cells line to different linkages; and further, regenerate and restore the functions of the lost organ or tissue.

A protocol is presented to prepare polyvinyl alcohol-co-itaconic acid hydrogels with varying stiffness, which were grafted with and without oligopeptides, to investigate the effect of the stiffness of biomaterials on the differentiation and proliferation of stem cells. The stiffness of the hydrogels was controlled by the crosslinking time.

Cultura di cellule staminali pluripotenti umane il polivinil alcool-Co-itaconico acido idrogel con diverse rigidità nelle circostanze senza Xeno

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been proven to be useful substrates for culturing cells in a physical microenvironment that partially mimics in vivo conditions. Here, we present a simple protocol for characterizing the Young's moduli of isotropic linear elastic substrates typically used for mechanobiology studies. The protocol consists of preparing a soft silicone substrate on a Petri dish or stiff silicone, coating the top surface of the silicone substrate with fluorescent beads, using a millimeter-scale sphere to indent the top surface (by gravity), imaging the fluorescent beads on the indented silicone surface using a fluorescence microscope, and analyzing the resultant images to calculate the Young's modulus of the silicone substrate. Coupling the substrate's top surface with a moduli extracellular matrix protein (in addition to the fluorescent beads) allows the silicone substrate to be readily used for cell plating and subsequent studies using traction force microscopy experiments. The use of stiff silicone, instead of a Petri dish, as the base of the soft silicone, enables the use of mechanobiology studies involving external stretch. A specific advantage of this protocol is that a widefield fluorescence microscope, which is commonly available in many labs, is the major equipment necessary for this procedure. We demonstrate this protocol by measuring the Young's modulus of soft silicone substrates of different elastic moduli.

Substrates with stiffness in the kilopascal-range are useful to study the response of cells to physiologically relevant micro-environment stiffness. Using just a widefield fluorescence microscope, the Young's modulus of soft silicone gels can be determined using an indentation with a suitable sphere.

Misura di rigidità dei substrati in morbido Silicone per gli studi di Mechanobiology usando un microscopio a fluorescenza Widefield

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...