Ci sono molti che hanno contribuito a questo lavoro e la maggior parte sono della membrana Caffrey Biologia Strutturale e Funzionale del Gruppo, sia i membri passati e presenti. A tutti, e soprattutto per Jingquan Tan e Joseph Lyons, estendiamo i nostri più sentiti ringraziamenti e apprezzamento. Questo lavoro è stato sostenuto in parte da finanziamenti Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), il National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 e U54GM094599), e il 7PQ COST e azioni Marie Curie (CM0902 e Pief-GA-2009 -235.612).

1. Laboratorio Set-up pre-raccolta <ol><li> In preparazione per la raccolta, compila il asciutta schiuma Dewar con azoto liquido e posizionarlo accanto al microscopio in cui la raccolta è quello di prendere posto. </li><li> Immergere il disco di memoria, aprire finiscono, in azoto liquido all&#39;interno del Dewar schiuma e lasciarlo raffreddare completamente. </li><li> Garantire un micro-montaggio di una dimensione che corrisponde il cristallo per essere raccolto su un magnete (Figura 5). È importante avere a disposizione un numero di ricambio rilevatori magnetici precaricato con micro-supporti per le situazioni in cui è necessario raccogliere cristalli diversi dai uno bolo. Bacchette di ricambio dovrebbero essere disponibili in qualsiasi momento. </li><li> Posizionare una micropipetta, suggerimenti e la soluzione precipitante che è stato utilizzato per la crescita di cristalli vicino al microscopio raccolta. Può essere necessario per coprire la mesofase e l&#39;essiccamento quando il bene viene aperto. </li><li> Hanno un quaderno e penna sul banco vicino e / oil computer aperto. Questi saranno utilizzati per registrare le osservazioni riguardanti la aspetto, la qualità, la posizione, il numero della disco, ecc, di cristalli in cui sono raccolte, crio-raffreddato e messo in deposito. </li><li> Se un assistente è disponibile per aiutare con la raccolta che la persona deve capire chiaramente il protocollo che sarà seguito, l&#39;ordine in cui le varie fasi si svolgeranno, e il loro ruolo nel processo globale. </li></ol> Con tutti i materiali e delle attrezzature in atto il nostro compito successivo è quello di: 2. Identificare Piatti e Wells che contengono cristalli <ol><li> Il metodo più semplice e diretto per la ricerca di cristalli raccoglibile è di ispezionare pozzi a mano utilizzando un microscopio con normale e con luce polarizzata incrociata. Regolazione dell&#39;intensità luminosa della luce del microscopio può aiutare con localizzazione cristalli. </li><li> In alternativa, un riproduttore di immagini in cui vengono proiettati automaticamente con piastre normale e attraversato polarizzared luce, può essere usato per cercare cristalli. </li><li> Valutare a occhio registrate immagini digitali su un monitor di computer. </li><li> Contrassegnare chiaramente quei pozzi con i cristalli per i commenti di raccolta e registrazione sulla qualità dimensione e la posizione dei cristalli nel mesofase all&#39;interno del notebook o su un computer. </li><li> Rimuovere la piastra che contiene cristalli per la raccolta dal sensore CCD. </li></ol> 3. L&#39;apertura di un bene con mesofase cubica. Metodo 1 Le piastre in cui i cristalli crescono dal metodo in meso sono lastre a sandwich di vetro (Figura 2). Per accedere mesofase ei cristalli in esso, è necessario aprire il pozzo. Questo viene fatto utilizzando un utensile di taglio per tagliare il vetro coverglass superiore che sigilla il pozzo, che può poi essere rimosso. Esistono diversi approcci per il taglio e la rimozione del coverglass da cristallizzazione in un pozzo. Quella da utilizzare è dettata dal tipo of mesofase in cui il cristallo è trovato crescere. Questa può essere la fase molto viscoso e appiccicoso cubica (Figura 3A) o la sua variante più fluido, la fase spugna (Figura 3B). In questo articolo vi mostriamo il video come aprire pozzi e per raccogliere i cristalli da entrambi questi materiali di hosting. <ol><li> Mettere il panino lastra di vetro cristallizzazione sul palcoscenico di un microscopio ottico. </li><li> Utilizzando un punteggio di taglio di vetro lo strumento coverglass leggermente con due cerchi concentrici situati sopra il distanziale e appena fuori il perimetro del pozzo. Con un utensile di taglio nuovo, punteggio richiede minima pressione applicata. Sostituire l&#39;utensile con una nuova quando la pressione necessaria per punteggio aumenta anche frazionata, questo si verifica in genere dopo l&#39;apertura di 10 pozzi. </li><li> Rompere il vetro nello spazio tra i due cerchi ottenuto al fine di rilasciare il coprioggetto interna. Questo genera un sacco di frammenti di vetro e polvere. Cancellare via con un panno umidotovagliolo di carta. </li><li> Rimuovere il coprioggetto liberata da presa con una pinzetta a punta sottili e inclinando lontano da dentro e fuori dal pozzo. In questo caso, la fase cubica rimane bloccato in posizione e sulla piastra di base del pozzo. </li><li> Lo zoom per avere una visione più chiara del mesofase cubica che ora è pronto per l&#39;uso nella raccolta cristallo. </li></ol> 4. L&#39;apertura di un Bene con mesofase Cubic. Metodo 2 <ol><li> Utilizzando il piano di taglio dell&#39;utensile punteggio rette parallele nella coverglass ad un lato del bene e che si estendono nello stesso pozzo. Ciò consente un più facile accesso alle pinzette e rimozione del coprioggetto. </li></ol> In questa dimostrazione particolare, il coprioggetto crepe a liberare il coprioggetto dalla superficie adesiva distanziale. Nel processo, il coverglass sposta in posizione e il precipitante separa dalla fase cubica. Quando il coverglass viene sollevato alcune del precipitante va con esso. Si sono lasciati con un b espostoOlus di mesofase senza precipitante circostante. Immediatamente, aggiungere 1 precipitante microlitri fresca sopra il bolo con una micropipetta per evitare mesofase si secchi e subendo un cambiamento di fase che può danneggiare i cristalli. Il bolo è pronto per essere utilizzato in cristallo raccolta. 5. L&#39;apertura di un bene con la fase spugna. Senza successo La fase di spugna è meno tollerante a lavorare a causa della sua capacità di flusso. Se che i risultati di flusso nella fase spugna contattando il perimetro della capillarità ben sguainerò mesofase ei cristalli verranno perse. Un esempio di questo si verifichi è mostrato in questo video. <ol><li> Zoom sulla fase spugna e passare avanti e indietro tra normale e incrociata luce polarizzata per individuare i cristalli in fase di spugna. </li><li> In preparazione per l&#39;apertura del punteggio bene e tagliare il coprioggetto come descritto nella Sezione 3. Nel processo, il coprioggetto crepe. Nel tentativo dizione per aprire la ben precipitanti gli spostamenti in direzione della fessura e alla fine entra in contatto con il distanziatore. Con il precipitante va una parte della fase spugna e il suo carico di cristalli che sono persi. </li></ol> In questa particolare sequenza, i polarizzatori sul microscopio non sono completamente attraversato ed i cristalli possono essere visti come oggetti luminosi al tempo stesso che il bene e suoi contenuti rimangono visibili. 6. L&#39;apertura di un bene con la fase spugna. Con successo <ol><li> Zoom sulla fase spugna e individuare un cristallo, sia in condizioni normali e incrociati luce polarizzata. </li><li> Punteggio, tagliare e rimuovere una sezione del coprioggetti che copre il bene, come al punto 4.1. Incompleto attraversato luce polarizzata viene utilizzato per tenere traccia del cristallo. </li><li> Introdurre un pezzo di carta velina secco attraverso l&#39;apertura nel coprioggetto e nel pozzo fino a sfiorare la soluzione precipitante. Wick via la soluzione attentamente fino a quando non è quasi tutto andato e quindi rimuovere il tessuto. Questo fa sì che il precipitante rimanente e la fase spugna, con il cristallo ancora al suo posto, per ritrarre sotto il coprioggetto. </li><li> Punteggio, tagliare e rimuovere con una pinzetta il resto del coprioggetto, come al punto 4.1. In questo caso, la fase di spugna divide, alcuni rimane nel pozzo e alcuni bastoni al coprioggetto. Il cristallo è nel bolo sul coprioggetto. Perché c&#39;è molto poco presente precipitante, la fase di spugna inizia a subire una transizione di fase probabilmente a causa di essiccazione. Questo può essere visto come un anello di birifrangenza che migra verso il centro del bolo. Immediatamente aggiungere precipitante al bolo per fermare la transizione. Il bolo è ora pronto per l&#39;uso in cristallo raccolta. </li></ol> 7. Raccolta e Cryo-Cristalli di raffreddamento dalla fase cubica <ol><li> Andare avanti e indietro tra normale e incrociata luce polarizzata per individuare cristalli nel bolo fase cubica nel pozzo aperto. In tla sequenza video fino a quattro cristalli birifrangenti può essere visto in bolo fase cubica incrociato con luce polarizzata. </li><li> Utilizzare un montato crio-loop (Figura 5) per sondare mesofase appena esposto per cristalli, per ripescare cristalli e poi immergeteli, contenuta nella crio-loop, in azoto liquido nella Dewar immediatamente dopo la raccolta. Idealmente, la raccolta e lo snap-raffreddamento dovrebbe avvenire in un unico movimento continuo e rapido. Come mesofase poco aderente possibile dovrebbe essere raccolto con il cristallo. Nella nostra esperienza, crio-protettivo non è necessaria con in meso-cresciuti cristalli. </li><li> Poiché non è possibile cercare il cristallo in crio-loop immediatamente dopo la raccolta ispezionare il bolo mesofase utilizzato per la raccolta di verificare che il cristallo non c&#39;è più suggerendo che è stato raccolto con successo. </li></ol> 8. Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento dalla fase spugna <ol><li> Andare avanti e indietro tra normale e incrociata luce polarizzata per individuare cristalli nel bolo spugna fase nel pozzo aperto. In questa sequenza video molti cristalli birifrangenti può essere visto nel bolo incrociate sotto luce polarizzata. </li><li> Utilizzare un montato crio-loop (Figura 5) per ripescare cristalli dalla fase spugna e immergetele, contenuta nel o sul cryoloop, in azoto liquido nella Dewar immediatamente dopo la raccolta. Come per la raccolta dalla fase cubica, idealmente, la crio-raffreddamento di processo dovrebbe avvenire subito il cristallo viene raccolto con il minor tempo possibile, che intercorre tra l&#39;evento di raccolta reale e immergersi in azoto liquido. In fase di spugna poco aderente possibile dovrebbe essere raccolto con il cristallo. Come già detto, crio-protettivo non è necessaria con in meso-cristalli coltivati. </li></ol> 9. Memorizzazione di cristalli in Dewars <ol><li> Dopo aver immerso il montato in loop in ni liquidotrogen porlo in uno degli slot di tenuta del disco di memorizzazione nella Dewar schiuma. Tutte le manipolazioni sono fatte con il ciclo, la parte superiore della bacchetta magnetica e il disco immerso in azoto liquido. </li><li> Registrare la posizione e dettagli del raccolto e crio-raffreddato cristallo nel notebook e / o sul computer. </li><li> Quando il disco nel Dewar schiuma è pieno o la raccolta per il giorno è completato il trasferimento del disco in un supporto puck archiviato in una memoria o un trasporto Dewar contenente azoto liquido. I cristalli possono essere spediti in Dewars trasporto verso l&#39;impianto di sincrotrone per la raccolta dei dati di diffrazione. </li></ol> 10. Risultati rappresentativi Gli obiettivi delle attività di raccolta e di crio-raffreddamento dimostrato qui ci sono di trasferire un cristallo dal mesofase ospita in crio-loop, per vetrificare il cristallo in loop e di collocarlo in conservazione in azoto liquido in un Dewar. La situazione ideale è dove la raccolta e la cryo-raffreddamento è fatto in modo tale che la qualità diffrazione del cristallo è conservato nel processo. Come mesofase meno possibile dovrebbe essere raccolto con il cristallo. Questo per rendere la localizzazione del cristallo e centrandola nel fascio di raggi X molto meno impegnativo, per velocizzare crio-raffreddamento al fine di vetrificazione, e di minimizzare interferire dispersione di fondo della mesofase durante la raccolta dei dati di diffrazione. Alcuni esempi di crio-raffreddati campioni in cui il cristallo può e non può essere visto sono mostrati in Figura 6. In cui il cristallo non può essere visto da occhio di solito è necessario ricorrere a rastering diffrazione per trovare il cristallo e per centrarlo nella trave di raccolta dati 27. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Rappresentazione schematica di una membrana biologica che mostra il doppio strato lipidico e su cui are trova una varietà di proteine. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. A pieno carico e sigillato a 96 pozzetti a piastra di vetro cristallizzazione. Ogni pozzetto contiene 50 fase cubica nl e 1 ul di soluzione precipitante. Per chiarezza, la fase cubica è stato macchiato con il Sudan rosso e la soluzione precipitante include blu di metilene. Da riferimento 5. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. Cristalli di proteine ​​di membrana che crescono nel mesofase lipidico. A. La fase cubica con un cristallo di batteriorodopsina da H. halobium. B. La fase di spugna che contiene un cristallo del BtuB vitamina B12 recettore / trasportatore, da E. coli. Da riferimento 25. Le fasi cubi e la spugna sono contrastanti appearances come è evidente dal confronto pannelli A e B. La fase cubica in A è molto viscoso e mantiene la sua forma originale. Esso non scorre. Questo è particolarmente evidente ai bordi del bolo mesofase che hanno un aspetto irruvidita. Per contratto, la fase di spugna è molto meno viscoso e non scorre. Così, la fase di spugna riesce a mantenere la sua forma originale ed i suoi bordi sono caratteristicamente liscia. Precipitanti che includono jeffammine, PEG 400, 2-metil-2 ,4-pentandiolo, pentaeritritolo propossilato, butandiolo, esandiolo e può risultare in una transizione dalla fase cubica a spugna 4,26. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. L&#39;organigramma riassume i passaggi necessari per la raccolta di produzione, e la crio-raffreddamento in cristalli membrana meso-coltivate proteina (A). Solo i passi immersi nel rosso tratteggiatolinea, e descritto in dettaglio in (B), sono trattati in questo articolo JoVE. Pannello A è da riferimento 3. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/4001/4001fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Un vuoto crio-loop montato su un perno che è tenuto in posizione su un magnete. Viste estese del perno (A) e micro-mount (B) di questo importante strumento per la raccolta e crio-raffreddamento vengono visualizzati. Il loop vuota alla fine del montaggio in micro-B è di 30 micron di diametro. Pur non avendo provato altri tipi di loop ampiamente, troviamo che il MiTeGen loop opera presentata bene con entrambe le fasi cubiche e spugna. <img src="/files/ftp_upload/4001/4001fig6.jpg" alt="Figura 6" /> Cristalli di Figura 6. Raccolti e crio-raffreddato di proteine ​​di membrana in crio-loop come si vede con un filtro in linea microscopio su una linea di luce di sincrotrone. A, B. Esempi di cristalli raccolte (citocromo ossidasi Caa3 34 (A), diacilglicerolo chinasi, DgkA (B)), dove i cristalli (freccia blu) sono visibili attraverso la crio-mesofase raffreddato su un crio-loop. C. Esempio di dove il cristallo raccolto non è visibile in crio-mesofase raffreddato su un crio-loop. La punta del ciclo viene identificato con una freccia rossa. L&#39;adesione crio-raffreddato mesofase è identificato con una freccia blu.

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A., Huang, X. P., Carroll, F. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+human+kappa-opioid+receptor+in+complex+with+JDTic.">Structure of the human kappa-opioid receptor in complex with JDTic.</a> Nature. 485, 327-332 (2012).</li><li>Cherezov, V., Abola, E., Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+progress+in+the+structure+determination+of+GPCRs,+a+membrane+protein+family+with+high+potential+as+pharmaceutical+targets.">Recent progress in the structure determination of GPCRs, a membrane protein family with high potential as pharmaceutical targets.</a> Methods Mol. Biol. 654, 141-168 (2010).</li><li>Liu, W., Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophases.">Crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases.</a> J. Vis. Exp. , (2011).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-volume+plates+with+excellent+optical+properties+for+fast,+inexpensive+crystallization+screening+of+membrane+proteins.">Nano-volume plates with excellent optical properties for fast, inexpensive crystallization screening of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 36, 1372-1377 (2003).</li><li>Cherezov, V., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picolitre-scale+crystallization+of+membrane+proteins.">Picolitre-scale crystallization of membrane proteins.</a> J. Appl. Cryst. 39, 604-606 (2006).</li><li>W&#246;hri, A. B., Johansson, L. C., Wadsten-Hindrichsen, P., Wahlgren, W. Y., Fischer, G., Horsefield, R., Katona, G., Nyblom, M., Oberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Lipidic-Sponge+Phase+Screen+for+Membrane+Protein+Crystallization.">A Lipidic-Sponge Phase Screen for Membrane Protein Crystallization.</a> Structure. 16, 1003-1009 (2008).</li><li>Cherezov, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rastering+strategy+for+screening+and+centring+of+microcrystal+samples+of+human+membrane+proteins+with+a+sub-10+microm+size+X-ray+synchrotron.">Rastering strategy for screening and centring of microcrystal samples of human membrane proteins with a sub-10 microm size X-ray synchrotron.</a> 6, 587-597 (2009).</li><li>Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lipid's+eye+view+of+membrane+protein+crystallization+in+mesophases.">A lipid's eye view of membrane protein crystallization in mesophases.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 486-497 (2000).</li><li>Briggs, J., Chung, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+temperature-composition+phase+diagram+and+mesophase+structure+characterization+of+the+monoolein/water+system.">The temperature-composition phase diagram and mesophase structure characterization of the monoolein/water system.</a> J. Phys. Ii. 6, 723-751 (1996).</li><li>Qiu, H., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phase+diagram+of+the+monoolein/water+system:+metastability+and+equilibrium+aspects.">The phase diagram of the monoolein/water system: metastability and equilibrium aspects.</a> Biomaterials. 21, 223-234 (2000).</li><li>Misquitta, Y., Cherezov, V., Havas, F., Patterson, S., Mohan, J. M., Wells, A. J., Hart, D. J., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+lipid+for+membrane+protein+crystallization.">Rational design of lipid for membrane protein crystallization.</a> J. Struct. Biol. 148, 169-175 (2004).</li><li>Caffrey, M., Porter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystallizing+Membrane+Proteins+for+Structure+Determination+using+Lipidic+Mesophases.">Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases.</a> J. Vis. Exp. , e1712 (2010).</li><li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+robot+for+high-throughput+crystallization+of+membrane+proteins+in+lipidic+mesophase.">Use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophase.</a> J. Vis. Exp. , e4000 (2012).</li><li>Lyons, J. A., Aragao, D., Slattery, O., Pisliakov, A. V., Soulimane, T., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+insights+into+electron+transfer+in+caa(3)-type+cytochrome+oxidase.">Structure insights into electron transfer in caa(3)-type cytochrome oxidase.</a> Nature. 10, (2012).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

In questo articolo il video abbiamo dimostrato come i cristalli coltivati ​​in un mesofase lipidico sono stati raccolti e crio-raffreddata in preparazione per l&#39;uso nella raccolta dei dati di diffrazione e, infine, per la determinazione della struttura. Mesofase hosting può essere la fase viscoso e appiccicoso cubica o la fase spugna più fluido 4. Come le lastre di vetro a sandwich sono aperte e come i cristalli sono raccolti molto dipende dal tipo di mesofase. E &#39;importante quindi sapere quale dei due è quello che fare con anticipo. L&#39;identità del lipide hosting e il precipitante utilizzati sono importanti in questo senso, e l&#39;aspetto fisico del bolo mesofase nella cristallizzazione bene può essere usato per distinguerli (Figura 3). Raccolta da entrambi i tipi mesofase è stato illustrato in questo articolo. Raccolta piccoli cristalli da un mesofase lipidica in superfici di vetro di vetro è un faticoso processo che richiede tempo, abilità, compeience, pazienza e una mano ferma. E &#39;importante mettere da parte una quantità di tempo adeguato per la raccolta e per impostare il laboratorio in modo che tutte le forniture e le attrezzature sono a portata di mano in anticipo. Una seconda persona con raccolta non è essenziale, ma è consigliabile. Quella persona può aiutare con la fornitura di pre-marcate le piastre per l&#39;individuo a fare la raccolta e l&#39;immissione anelli montati crio-raffreddati con cristalli raccolti nel disco di archiviazione. L&#39;assistente può anche svolgere un ruolo importante di supporto nel documentare osservazioni sui cristalli effettuate durante la raccolta che potrebbe rivelarsi cruciale durante la raccolta dei dati di diffrazione. In assenza di un assistente, un comando vocale audio-dispositivo di registrazione può essere vantaggiosamente utilizzato per la documentazione. Dopo il protocollo descritto in questo articolo vi aiuterà a ottenere il visualizzatore installato e funzionante con la raccolta di cristallo. Tuttavia, è importante sottolineare che il processo non è semplice e che practice è necessario prima di lanciarsi nella raccolta preziosi cristalli di proteine ​​di membrana. Si raccomanda pertanto che le targhe di prova con cristalli di proteine ​​che non rappresentano un particolare valore essere sperimentato prima. Ciò fornirà il neofita preziosa esperienza nel taglio del vetro, rimuovendo frammenti di vetro, sollevando il coprioggetto da oltre mesofase, utilizzando la funzione polarizzante sul microscopio per vedere cristalli e di rintracciarli durante la raccolta, movimentazione e infine i diversi tipi di mesofasi e la raccolta da loro. La trama del mesofase, e per estensione la facilità con cui i cristalli possono essere raccolti, cambia con il tempo durante la cristallizzazione. E &#39;importante quindi di praticare la raccolta con cristalli di minor valore, ma con quelli che sono cresciuti nelle stesse condizioni come quelle di maggior valore. È possibile far crescere cristalli di lisozima e taumatina dal meso o in lipidica metodo fase cubica 28 e questi dovrebbero essere consideEred a titolo di guadagnare familiarità con i materiali e il metodo. Si dovrebbe anche prendere in considerazione di lavoro con privo di proteine ​​mesofase primo a conoscere dei suoi capricci. Le procedure hanno dimostrato qui erano tutti fatto in un confortevole 20 ° C o giù di lì. È possibile far crescere cristalli dal metodo in meso a temperature inferiori. Così, monoolein come lipidi hosting in uno stato di fase metastabile può essere utilizzato a 4 ° C 1,2,29,30. Un&#39;alternativa è quella di utilizzare il razionalmente 7,9 MAG per cristallizzazione a bassa temperatura 31. Facciamo crysallogenesis bassa temperatura di routine con gli obiettivi di alcune proteine ​​di membrana. In questo caso, la crescita dei cristalli e la raccolta è fatta in un walk-in frigorifero a 4 ° C. Lavorare in queste condizioni ha le sue sfide non ultimo dei quali è la necessità di un abbigliamento caldo e confortevole. Il passo successivo nel processo generale di determinazione della struttura con cristalli macromolecolaritallography è quello di raccogliere dati di diffrazione su cristalli raccolti e snap-raffreddato, come illustrato in questo articolo. Nel meso-grown cristalli sono solitamente di piccole dimensioni. Tuttavia, utile raccolta dati di diffrazione è stato possibile con cristalli aventi una dimensione massima di 20 micron 9. A questo scopo, micro-beam X-radiazione di sincrotrone viene utilizzata ed è al centro di un articolo separato JoVE in questa serie 32,33.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reagente </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Componenti </td></tr><tr><td> Pinzette curve </td><td> Sigma </td><td> F4142 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Puntali monouso </td><td> Gilson </td><td> Vario </td><td> Usa e getta </td></tr><tr><td> Schiuma dewar </td><td> Spearlab </td><td> FD-500 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Vetro e metallo Contenitori per rifiuti </td><td> Daniels Sanità </td><td> DD479OL </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Loop raccolta </td><td> MiTeGen </td><td> Vario </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Raccolta microscopio </td><td> Nikon </td><td> SMZ1500 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Lab notebook </td><td> Vario </td><td> NA </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Spinta magneticabottone campione bacchetta di caricamento </td><td> Hampton Ricerca / dimensioni molecolari </td><td> HR4-729/MD7-411 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Puck originale (per l&#39;utilizzo con SLA stile robot solo) </td><td> Sistemi di posizionamento di cristallo </td><td> CP-111-035 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Dispositivi di pipettaggio </td><td> Gilson </td><td> Vario </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Soluzioni precipitante </td><td> Vario </td><td> Vario </td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Puck Bent Cryo-Tong </td><td> Sistemi di posizionamento di cristallo </td><td> CP-111-030 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Puck Cane spedizione ripiani (originali ALS-style) con manico a gancio e asta di chiusura </td><td> Sistemi di posizionamento di cristallo </td><td> CP-111-029 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Acqua depurata </td><td> Millipore </td><td></td><td> Reagente </td></tr><tr><td> Occhiali di sicurezza </td><td&gt; Varie </td><td> NA </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Basi Pin campione - magnetico (senza rame) </td><td> Sistemi di posizionamento di cristallo </td><td> CP-111-015 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Spedizione dewar </td><td> Taylor-Wharton </td><td> CX100 </td><td> Strumento </td></tr><tr><td> Tessuti </td><td> NA </td><td> NA </td><td> Usa e getta </td></tr><tr><td> Tungsteno-carburo di vetro taglierina (Punta a tracciare TCT) </td><td> Strumenti Silverline (Yeovil, Regno Unito) </td><td> 633657 </td><td> Strumento </td></tr></tbody></table>

harvesting and cryo-cooling crystals of membrane proteins grown in lipidic mesophases for structure determination by macromolecular crystallography

Un percorso importante per capire come le proteine ​​funzionano ad un livello meccanicistico è quello di avere la struttura della proteina bersaglio disponibile, idealmente a risoluzione atomica. Attualmente, vi è solo un modo per acquisire informazioni come applicato alle proteine ​​integrali di membrana (Figura 1), ed i complessi che formano, e questo metodo è macromolecolare cristallografia a raggi X (MX). Per fare MX cristalli qualità di diffrazione sono necessari che, nel caso delle proteine ​​di membrana, non formano facilmente. Un metodo per cristallizzare proteine ​​di membrana che prevede l&#39;utilizzo di mesofasi lipidiche, in particolare le fasi cubi e spugna 1-5, ha guadagnato una notevole attenzione a causa del ritardo per i successi che ha avuto nella proteina-recettore accoppiato campo G 6-21 ( <a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www . mpdb.tcd.ie</a> ). Tuttavia, il metodo, d&#39;ora in poi denominato in meso o lipidica metodo fase cubica, viene fornito con il proprio tecnicosfide. Questi derivano, in parte, a causa della natura generalmente viscoso e appiccicoso della mesofase lipidico in cui i cristalli, che sono spesso microcristalli, crescono. Manipolando cristalli diventa difficile a causa e in modo particolare durante la raccolta 22,23. Sorgono problemi anche nella fase che precede la raccolta che richiede che le lastre di vetro sandwich in cui i cristalli crescono (Figura 2) 24,25 sono aperte per esporre il bolo mesofase, ed i cristalli in esso, per la raccolta, crio-raffreddamento e X eventuali diffrazione raccolta dati. Le varianti mesofase cubi e spugna (Figura 3), da cui cristalli devono essere raccolti hanno reologie profondamente diversi 4,26. La fase cubica è viscoso e appiccicoso simile a un dentifricio spessore. Per contro, la fase spugna è più fluido con una spiccata tendenza a flusso. Di conseguenza, i diversi approcci per l&#39;apertura di pozzi cristallizzazione containing cristalli crescono nel cubo e la fase spugna sono chiamati a effetti diversi metodi sono necessari per la raccolta di cristalli dai due tipi mesofase. Protocolli per fare proprio che sono state perfezionate e attuate nella membrana Biologia Strutturale e Funzionale (MS &amp; FB) del Gruppo, e sono descritte in dettaglio in questo articolo JoVE (Figura 4). Alcuni esempi sono riportati di situazioni in cui i cristalli sono raccolti con successo e crio-raffreddato. Forniamo anche esempi di casi in cui sorgono problemi che portano alla perdita irrimediabile di cristalli e descrivere come questi problemi possono essere evitati. In questo articolo il Viewer è dotato di passo-passo le istruzioni per l&#39;apertura di pozzi di cristallizzazione a sandwich di vetro, per la raccolta e per la crio-raffreddamento cristalli di proteine ​​di membrana che crescono in cubi e nelle fasi spugna.

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Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Qui è descritto procedure implementate nella membrana Caffrey Strutturale e Funzionale Biologia Gruppo di cristalli di membrana raccolta e crio-cool proteine ​​coltivate in fasi lipidiche cubi e spugna per l&#39;uso in determinazione della struttura macromolecolare con cristallografia a raggi X.

Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento delle proteine ​​di membrana Grown in mesofasi lipidici per la determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

harvesting-cryo-cooling-crystals-membrane-proteins-grown-lipidic

Research

JoVE Journal

Biology

24.7K Views.  Trinity College Dublin. Qui è descritto procedure implementate nella membrana Caffrey Strutturale e Funzionale Biologia Gruppo di cristalli di membrana raccolta e crio-cool proteine ​​coltivate in fasi lipidiche cubi e spugna per l'uso in determinazione della struttura macromolecolare con cristallografia a raggi X.

Video: Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristallizzare proteine ​​di membrana per la determinazione della struttura utilizzando Mesophases lipidica

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Ricerca

Biologia

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

L&#39;importanza della concentrazione della proteina corretta per Cinetica e determinazione affinità nella struttura-funzione di analisi

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

Valutazione bidimensionale Prove di cristallizzazione delle proteine ​​di membrana per piccoli studi di biologia strutturale di Cristallografia Electron

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

Cristallizzazione delle proteine ​​di membrana lipidica in Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Cristallizzazione high-throughput di proteine ​​di membrana con il metodo lipidica Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through macromolecular X-ray crystallography (MX). An essential ingredient of MX is a steady supply of ideally diffraction-quality crystals. The in meso or lipidic cubic phase (LCP) method for crystallizing membrane proteins is one of several methods available for crystallizing membrane proteins. It makes use of a bicontinuous mesophase in which to grow crystals. As a method, it has had some spectacular successes of late and has attracted much attention with many research groups now interested in using it. One of the challenges associated with the method is that the hosting mesophase is extremely viscous and sticky, reminiscent of a thick toothpaste. Thus, dispensing it manually in a reproducible manner in small volumes into crystallization wells requires skill, patience and a steady hand. A protocol for doing just that was developed in the Membrane Structural &amp; Functional Biology (MS&amp;FB) Group1-3. JoVE video articles describing the method are available1,4. 
The manual approach for setting up in meso trials has distinct advantages with specialty applications, such as crystal optimization and derivatization. It does however suffer from being a low throughput method. Here, we demonstrate a protocol for performing in meso crystallization trials robotically. A robot offers the advantages of speed, accuracy, precision, miniaturization and being able to work continuously for extended periods under what could be regarded as hostile conditions such as in the dark, in a reducing atmosphere or at low or high temperatures. An in meso robot, when used properly, can greatly improve the productivity of membrane protein structure and function research by facilitating crystallization which is one of the slow steps in the overall structure determination pipeline. 
In this video article, we demonstrate the use of three commercially available robots that can dispense the viscous and sticky mesophase integral to in meso crystallogenesis. The first robot was developed in the MS&amp;FB Group5,6. The other two have recently become available and are included here for completeness.	
An overview of the protocol covered in this article is presented in Figure 1. All manipulations were performed at room temperature (~20 &deg;C) under ambient conditions.

Herein is described a robotic approach to high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography. Three robots capable of handling the viscous and sticky protein-laden mesophase integral to the method are introduced.

L&#39;utilizzo di un robot per High-throughput cristallizzazione delle proteine ​​di membrana in mesofasi lipidici

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

Intravitale Microscopia per le strutture Imaging subcellulari in topi vivi Esprimere proteine ​​fluorescenti

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Immunolocalizzazione della membrana esterna proteine ​​mediante citometria di flusso di mitocondri isolati

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

Green Fluorescent Protein-base Espressione Proiezione di proteine ​​di membrana in<em&gt; Escherichia coli</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of transporters. The phosphorylation and nucleotide dependent chloride channel activity of CFTR has been frequently studied in whole cell systems and as single channels in excised membrane patches. Many Cystic Fibrosis-causing mutations have been shown to alter this activity. While a small number of purification protocols have been published, a fast reconstitution method that retains channel activity and a suitable method for studying population channel activity in a purified system have been lacking. Here rapid methods are described for purification and functional reconstitution of the full-length CFTR protein into proteoliposomes of defined lipid composition that retains activity as a regulated halide channel. This reconstitution method together with a novel flux-based assay of channel activity is a suitable system for studying the population channel properties of wild type CFTR and the disease-causing mutants F508del- and G551D-CFTR. Specifically, the method has utility in studying the direct effects of phosphorylation, nucleotides and small molecules such as potentiators and inhibitors on CFTR channel activity. The methods are also amenable to the study of other membrane channels/transporters for anionic substrates.

Described here is a rapid and effective procedure for functional reconstitution of purified wild-type and mutant CFTR protein that preserves activity for this chloride channel, which is defective in Cystic Fibrosis. Iodide efflux from reconstituted proteoliposomes mediated by CFTR allows studies of channel activity and the effects of small molecules.

Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento delle proteine ​​di membrana Grown in mesofasi lipidici per la determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare

Cristalli di raccolta e di Cryo-raffreddamento delle proteine di membrana Grown in mesofasi lipidici per la determinazione della struttura di cristallografia macromolecolare