<p class="jove_content"&gt; Questo lavoro è stato sostenuto dal programma intramurale del National Institute of Neurological Disorder and Stroke dei National Institutes of Health. Vorremmo anche ringraziare il Dr. George Mentis per i suoi contributi precedenti al metodo e ai dati in Figura 3.</p

Destrani fluorescenti sono stati utilizzati come strumenti anatomici e per l&#39;imaging attività neuronale 1-4. Campi et al. (2009) 4 pubblicato un protocollo per l&#39;applicazione di ioni e della tensione di coloranti sensibili ai tratti assonali con un focus sul midollo spinale come sistema modello. Qui si descrive una procedura più dettagliata per l&#39;applicazione colorante fluorescente e / o ione-sensibile alle radici taglio ventrali, radici dorsali o qualsiasi tratto neuronale del midollo spinale per studi in vitro optophysiological e morfologiche. 1. Di tipo I e tipo II Pipettes Avviare tirando due brevi tratti di tubazione in polietilene (PE90, Clay marca Adams) sulla fiamma di una lampada ad alcool 7 per la produzione di pipette con puntali conici. Una pipetta (Type-I) deve essere breve (3-7 mm) con una piccola punta che può ben tenere la radice di destinazione o del tratto (diametro esterno: 0,2-0,4 mm, diametro interno: 0,1-0,3 mm). Quindi tirare una pipetta secondo (Type-II) con un più lungo (8-12 cm) più sottile, albero e una punta molto fine (diametro esterno: 0,2-0,3 mm, diametro interno: 0.1-0.2 mm) che può essere inserito nel tipo I pipettare fino la sua punta. La seconda pipetta sottile verrà utilizzato per aspirare ed introdurre fluido cerebrospinale artificiale (ACSF) e la soluzione colorante, rispettivamente, dal tipo I pipetta. 2. Posizionamento di tipo-I Pipettare Staccare ed isolare il midollo spinale 8,9 e collocarlo in un bagno, con superfuso refrigerate ACSF (~ 16 ° C) durante tutto il processo di caricamento. Posizionare il Type-I pipettare su un portaelettrodo (H1/12 portaelettrodo, Narishige) in modo che la sua apertura posteriore può essere facilmente collegato ad una siringa (1 ml U-100 siringa da insulina, Becton Dickinson o comparabili) tramite un tubo flessibile (PharMed BPT, Cole-Parmer, # AY242002, 10 cm) (Fig.1A-B). 3. Dye Application <ol><li> Usando la siringa, prima disegnareACSF nel tipo I pipetta (Fig.1B; 2A) seguita dal tratto assonale o radice da riempire (Fig. 2B). Il tubo flessibile deve quindi essere rimosso dalla apertura posteriore. Il Tipo II-pipetta è attaccata ad un&#39;altra siringa e inserito nel tipo I pipettare premuto il tratto assonale o radice. Usando la siringa collegata al tipo II pipetta, aspirare ACSF in modo che il residuo ACSF copre appena il tratto assonale (Fig.1C; 2C-D). Poi ritirare il tipo II pipetta dal tipo I pipetta. Monitorare il livello ACSF per qualche minuto per verificare una buona tenuta sul tratto assonale o nervi (vedi sezione 3 Risoluzione dei problemi di &quot;buona tenuta&quot;). </li><li> Sciogliere il colorante in ACSF o 0,2% di Triton X-100 in acqua bidistillata e renderlo il Type-II pipetta facendo attenzione a non includere bolle d&#39;aria. Inserire il Tipo II-pipetta contenente il colorante nel tipo I pipetta e nella soluzione residua ACSF (Fig. 2E). Rilasciare lentamenteil colorante nella ACSF mediante una leggera pressione positiva (Fig. 2F). Fare attenzione a non introdurre eventuali bolle d&#39;aria o di provocare lo spostamento del tessuto bersaglio dall&#39;interno della punta. Ritirare il tipo II pipetta dopo sufficiente quantità di colorante è stata rilasciata (3-5 ml di soluzione colorante). </li></ol> 4. Incubazione Incubare il tessuto al buio tra 6 e 20 ore a seconda del tipo di esperimento. Una volta che un tempo sufficiente è stato consentito per il riempimento, tirare delicatamente l&#39;elettrodo lontano dal tessuto lasciando il tessuto pronto per l&#39;imaging e l&#39;istologia. Risoluzione dei problemi <ol><li> Se il tessuto bersaglio non entra facilmente nella punta della pipetta di tipo I o è sciolto una volta dentro, allora il diametro della punta è la dimensione sbagliata. In questo caso, tirare e utilizzare una pipetta differente. </li><li> Prima di aggiungere il colorante alla ACSF del tipo I pipetta, assicurarsi che ACSF sia sufficiente in modo che possa essere raggiunto con laType-II puntale (Fig. 2D). Altrimenti, un traferro esisterà una volta che il colorante viene aggiunto. Se questo accade, non aggiungere il colorante e rimuovere il tratto assonale dalla pipetta e poi tirarla indietro con ACSF sufficiente per essere raggiunto dalla Type-II pipetta. </li><li> Se il livello ACSF in tipo I aumenta pipette dopo che è stato aspirato con il Tipo II-pipetta, significa che il sigillo con il tessuto non è buona. Utilizzare un elettrodo diverso, altrimenti il ​​colorante viene diluito nel corso della procedura di etichettatura. </li><li> Se una bolla d&#39;aria viene introdotta nel tipo I pipetta mentre iniettando il colorante, defluire la bolla facendo avanzare il tipo-II vicino punta della pipetta per la bolla e delicatamente applicando una pressione negativa debole usando la siringa attaccata. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Motoneuroni Per illustrare l&#39;applicazione del metodo, caricati contemporaneamente, le afferenze sensoriali e interneuroni spinali con tre differenti Dextcorse di coniugati coloranti fluorescenti (Fig. 3A). Come illustrato in fig. 3B, tre classi di neuroni sono etichettati; afferenze sensoriali (rosso), interneuroni sporgenti all&#39;interno del funicolo ventrale (verde) e motoneuroni (blu). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig1.jpg" /> Figura 1. Schema che mostra Pipettare di tipo I e tipo II montaggio. (A) Un tipo I pipetta (luce blu) è posto su un portaelettrodo in modo che sia indietro apertura può essere facilmente collegata al tubo elastomero flessibile (B) e in cui uno di tipo II pipetta può essere inserito (C). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig2.jpg" /> Figura 2. Schematico che mostra il processo di caricamento dei motoneuroni con coloranti fluorescenti. (A) di tipo A-I pipetta si trova vicino alla radice ventrale da riempire. (B) di aspirazione viene applicata alla pipetta per disegnare ACSF nella pipetta seguita dalla radice. (C-D) Staccare il tubo flessibile in elastomero dal backend di tipo-I pipetta e ridurre la quantità di ACSF applicando aspirazione alla Type-II pipetta. (E) Inserire la punta della pipetta Type-II contenente il colorante dissolto nel ACSF rimanente nel tipo I pipetta. (EF) Lentamente riempire la Type-I pipetta con il colorante e quindi rimuovere la Type-II pipetta. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4008/4008fig3.jpg" /> Figura 3. Applicazione della procedura di riempimento al midollo spinale topo isolato. (A) schematico che mostra tre tipo I pipette per riempire diverse classi neuronali nel midollo spinale. Motoneuroni (blu, blu destrano Cascade) e sacrale afferenze sensoriali (rosso, Texas-Red destrano) sono stati riempita attraverso le radici ventrali e dorsali, rispettivamente. Fluoresceina destrano è stato utilizzato per caricare interneuroni spinali (verde) i cui assoni salire attraverso il funicolo ventrale (VF). 1 mg di ciascun colorante destrano (10.000 MW; Molecular Probes)è stato sciolto in 6 microlitri di acqua distillata contenente 0,2% Triton X-100 (B). Immagine confocale di una sezione del midollo sacrale di un midollo spinale in cui i neuroni sono stati retro-etichettato come descritto in A. Si noti che le afferenti etichettate sensoriali sono principalmente omolaterale con alcune sporgenze poco controlaterali. I neuroni motori sono etichettati omolaterale alla radice ventrale riempita mentre le interneuroni sono etichettati controlaterale al lato del riempimento (testa freccia). Calibrazione bar 200 micron.

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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+functional+synaptic+connections+between+medullary+reticulospinal+neurons+and+lumbar+descending+commissural+interneurons+in+the+neonatal+mouse.">Organization of functional synaptic connections between medullary reticulospinal neurons and lumbar descending commissural interneurons in the neonatal mouse.</a> J. Neurosci. 31, 4731-4742 (2011).</li></ol>

<p class="jove_content"&gt; Non abbiamo nulla da rivelare.</p

<p class="jove_content"&gt; Descriviamo qui un protocollo semplice e conveniente per l&#39;introduzione di coloranti in neuroni, nervi e tratti della colonna vertebrale. Questo metodo consiste nell&#39;esporre i percorsi identificati anatomiche a una soluzione altamente concentrata colorante per la durata del processo di caricamento. Ciò si traduce in etichettatura retrogrado del sito bersaglio con sfondo poco rispetto microiniezioni, applicazione bagno e tecniche di elettroporazione. Tuttavia, il metodo è limitato ai siti nel sistema nervoso...

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td colspan="2"<strong&gt; Nome del materiale</strong</td&gt;<td<strong&gt; Azienda</strong</td&gt;<td<strong&gt; Numero di catalogo</strong</td&gt;<td<strong&gt; Commenti</strong</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td rowspan="2"&gt; Tubi</td&gt;<td&gt; PE90 (IDxOD: 0,034 &quot;x0.050&quot;; Spessore parete: 0.008 &quot;)</td&gt;<td&gt; Clay Adams Marca Intermedic</td&gt;<td&gt; 427.421</td&gt;<td&gt; Per Tipo I e Tipo II pipette</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; NSF-51 (IDxOD: 1/16x1/8; Spessore parete: 1/32)</td&gt;<td&gt; PharMed BPT, Cole-Parmer</td&gt;<td&gt; AY242002</td&gt;<td&gt; Per Tubi flessibili</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Siringa</td&gt;<td&gt; Siringa da insulina da 1 ml U-100</td&gt;<td&gt; Becton Dickinson</td&gt;<td&gt; 329.650</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Needle</td&gt;<td&gt; 19G x1-1/2 &quot;Metal Hub Needle</td&gt;<td&gt; MONOJECT</td&gt;<td&gt; 200.136</td&gt;<td&gt; Collegamento di tipo II pipetta siringa</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt; Alcohol Lamp</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Rubinetto</td&gt;<td&gt; Valvola a tre vie con Maschio Adattatore Luer slip</td&gt;<td&gt; Baxter Healthcare Corp.</td&gt;<td&gt; 2C6241</td&gt;<td&gt; Usa con siringa</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td rowspan="3"&gt; Titolare</td&gt;<td&gt; Supporto H-1 elettrodo</td&gt;<td&gt; Narishige</td&gt;<td&gt; H-1/12</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Magnet supporto</td&gt;<td&gt; Narishige</td&gt;<td&gt;-8 GJ</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Micromanipolatore</td&gt;<td&gt; Narishige</td&gt;<td&gt; M-3333</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pinzetta</td&gt;<td&gt; S &amp; T DUMONT svizzera 00632-11</td&gt;<td&gt; DUMONT</td&gt;<td&gt; JF-5 TC</td&gt;<td&gt;</td&gt;</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;<p class="jove_content"&gt; * Questi sono materiali suggeriti. Può essere sostituito con qualsiasi prodotti compatibili</p

retrograde loading of nerves, tracts, and spinal roots with fluorescent dyes

Etichettatura retrograda di neuroni è uno standard 1,2 metodo anatomica che è stata anche utilizzata per caricare e calcio voltaggio-coloranti sensibili in neuroni 3-6. Generalmente, i coloranti vengono applicate come cristalli solidi o mediante iniezione a pressione locale utilizzando pipette di vetro. Tuttavia, ciò può causare diluizione della intensità etichettatura colorante e ridotta, in particolare quando sono necessarie diverse ore per diffusione colorante. Qui mostriamo una tecnica semplice e di basso costo per l&#39;introduzione coloranti fluorescenti e ioni sensibile in neuroni con una pipetta di aspirazione polietilene riempito con la soluzione colorante. Questo metodo offre un modo affidabile per mantenere un&#39;elevata concentrazione del colorante in contatto con assoni tutta la procedura di caricamento.

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Retrograde Loading of Nerves, Tracts, and Spinal Roots with Fluorescent Dyes

Descriviamo una tecnica semplice ea basso costo per introdurre alta concentrazione di coloranti fluorescenti e calcio-sensibili in neuroni o qualsiasi tratto neuronale mediante una pipetta di aspirazione polietilene.

Caricamento in corso retrogrado di Nervi, tratti e radici spinali con le tinture fluorescenti

Retrograde labeling of neurons is a standard anatomical method1,2 that has also been used to load calcium and voltage-sensitive dyes into neurons3-6. ...

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12.2K Views.  National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health. Descriviamo una tecnica semplice ea basso costo per introdurre alta concentrazione di coloranti fluorescenti e calcio-sensibili in neuroni o qualsiasi tratto neuronale mediante una pipetta di aspirazione polietilene.