Supportato da NIH / NIDCD R01 DC esperimenti 011582. imaging sono stati effettuati presso l&#39;Università del Colorado Anschutz Medical Campus avanzata Luce Microscopia core supportato in parte dal NIH / NCRR Colorado CTSI Concessione Numero UL1 RR025780 e Disturbi Rocky Mountain Neurlogical Core Center sovvenzione NIH P30NS048154. Dr. Sascha du Lac del Salk Institute ci ha fornito i topi GlyT2-GFP.

1. genotipizzazione ottico 1. Optical genotipizzazione del mouse Pups <ol><li> Controllare espressione del marcatore fluorescente rispettivo usando un puntatore laser di adeguata lunghezza d&#39;onda di eccitazione (405 nm negli esperimenti qui descritti) e corrispondenti occhiali filtro di blocco alla lunghezza d&#39;onda di eccitazione, ma passando la lunghezza d&#39;onda di emissione (450-700 nm negli esperimenti qui descritti) . Puntare il puntatore laser sul retro della testa o del midollo spinale del cucciolo mouse (vedi Figura 1). Evitare che splende il laser negli occhi e lunga esposizione della pelle alla luce laser. </li></ol> 2. ottica genotipizzazione degli anziani animali <ol><li> Profondamente anestetizzare il mouse (di età compresa tra P14 a P138 negli esperimenti qui descritti), con una overdose di pentobarbital attraverso un&#39;iniezione intraperitoneale (120 mg / kg di peso corporeo). Confermare anestesia corretta verificando i riflessi degli animali (brevemente pizzicare la punta di the orecchio o una delle zampe posteriori per suscitare il riflesso retrazione dell&#39;orecchio o della gamba). </li><li> Nota: Nonostante l&#39;uso di una dose eccessiva di pentobarbital (120 mg / kg di peso corporeo) si fa riferimento alla procedura di iniezione come &quot;profonda anestesia&quot; invece di eutanasia, perché l&#39;animale è idealmente ancora vivo (cioè il suo cuore batte ancora), quando la chirurgia e la perfusione cominciano. Questo assicura una più efficiente perfusione degli organi interni compreso il cervello. </li><li> Una volta che l&#39;animale non mostra riflessi, rimuovere con attenzione la pelle sovrastante il cranio (Figura 2A) facendo un&#39;incisione nella pelle che copre la parte posteriore della testa e taglio al tronco del cranio. Esporre il cranio scoperto alla luce laser e osservare la fluorescenza attraverso gli occhiali filtro come descritto sopra. Se un segnale GFP positivo viene osservato, passare al punto 2, se non, sacrifica l&#39;animale attraverso decapitazione (secondo / garantendo forma di eutanasia seguendo il nostroRegolamenti IACUC). </li></ol> Nota: Nei topi, anche più grandi (&gt; 1 mese) la fluorescenza può essere osservata attraverso gli occhi dell&#39;animale. 2. transcardial Perfusione e Cervello Preparazione <ol><li> Profumato transcardiaca con tampone fosfato salino ghiacciata (PBS; NaCl: 137 mm, KCl 2,7 mM, KH 2 PO 4: 1.76 mM, Na 2 HPO 4: 10 mm) con una siringa ago da 30 G per rimuovere gran parte del sangue da l&#39;animale. <ol><li> Innanzitutto, aprire con cautela la gabbia toracica con forbici affilate e poi spingere l&#39;ago nel ventricolo sinistro del cuore. Avviare il pompaggio PBS nel cuore e l&#39;aorta e immediatamente dopo questa fase aprire nell&#39;atrio destro del cuore con le forbici per consentire al sangue di uscire dal corpo. Nota: perfusione richiede 5 - 10 min a seconda della taglia dell&#39;animale. </li></ol></li><li> Dopo dissanguamento mediante perfusione, decapitare il animali, garantire la sua testa con il perno needles (o 30 G aghi delle siringhe) da loro penetrante attraverso le orbite in un piatto preparato e rimuovere il cervello dal cranio. <ol><li> Innanzitutto, utilizzare forbici affilate per tagliare la pelle sovrapponendo cranio: fare una piccola incisione nella parte posteriore della testa, poi tagliare lungo la linea mediana sul lato dorsale della testa, tagliati ai lati appena caudalmente degli occhi dell&#39;animale e infine tagliato in direzione caudale rimuovere completamente i lembi di pelle nella parte posteriore della testa. </li><li> Successivamente, ripetere lo stesso schema di taglio per il cranio stesso, assicurarsi di rimuovere due coclee nel processo, perché questo semplifica notevolmente la rimozione del tronco cerebrale alla fine. Dopo questa procedura, la parte caudale del cervello dovrebbe giacciono completamente esposto. </li><li> Nella fase successiva, utilizzare una lama di rasoio affilata o un bisturi per tagliare attraverso tutta proencefalo ad un angolo di circa 45 ° e circa 2 mm rostrale dal cervelletto. Scoop fuori la metà anteriore separata del cervello con abspatola ent. </li><li> Utilizzare la spatola per elevare la parte caudale del cervello alla sua estremità rostrale e successivamente tagliare i nervi cranici che sono ancora collegate al tronco cerebrale sul lato ventrale. Come risultato finale, la parte caudale del cervello incluso il tronco cerebrale deve cadere liberamente fuori il resto della testa di animale preparato. </li><li> Capovolgere la parte caudale rimosso del cervello per esporre il suo lato ventrale e tagliare lungo il piano coronale solo rostrale (per le iniezioni anterograda) o semplicemente caudale (per le iniezioni retrogradi) delle &quot;lampadine&quot; ventrale situati contenenti il ​​corpo trapezoidale (vedere il passaggio 2.3). <ol><li> Utilizzare sempre una lama di rasoio affilata o un bisturi per la procedura di taglio per ridurre al minimo la morte cellulare causata da eccessiva sollecitazione meccanica sul tessuto. Come risultato finale, un espianto cervello attraversa circa 1 cm di lunghezza e contenente la completa oliva pontina lungo altre regioni del cervello avrebbe dovuto essere ottenuta. </li></ol></li></ol> &lt;/ li&gt; </ol> Nota: Questo protocollo illustra la procedura di iniezione tracciante nel corpo trapezoidale situato nel tronco cerebrale uditivo. Adattare la posizione e l&#39;orientamento dei piani di taglio e siti di iniezione come necessario. Se le regioni cerebrali fluorescenti di interesse si trovano abbastanza vicino alla superficie del cervello, in modo che possano essere identificati e iniettati senza tagliare il cervello (vedere la Figura 2B), allora la fase di taglio coronale può essere omesso. <ol start="3"><li> Identificare il corpo trapezoidale come due ventrali &quot;lampadine&quot; di spicco che contengono il nucleo ventrale del corpo trapezoidale (VNTB). </li></ol> Nota: per ulteriori riferimenti anatomici per quanto riguarda la localizzazione stereotassica approssimativa di questi piani di taglio, vedere Franklin &amp; Paxinos, 2008. Panel 78 dell&#39;atlante, Bregma ~ -5.7 mm mostra il nucleo mediale del corpo trapezoidale (= MNTB) etichettato come &quot;Tz &quot;. Panel 69 mostra il nucleo ventrale del bo trapeziody (VNTB) etichettato come &quot;MVPO&quot; (medioventral nucleo periolivary) 19. 3. anterograda / retrograda Tracing Nota: Eseguire tutte le procedure di seguito a temperatura ambiente (25 ° C). <ol><li> Dopo il taglio, posizionare l&#39;espianto tronco cerebrale in un piatto preparato contenente ossigenata (95% O 2, CO 2 5%) dissezione soluzione (NaCl: 125 mm, KCl: 2,5 mm, MgCl 2: 1 mm, CaCl 2: 0,1 mm, il glucosio : 25 mM, NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO 3: 25 mM, acido ascorbico: 0.4 mM, mio-inositolo: 3 mM, acido piruvico: 2 mM), fissandolo con 30 aghi siringa G. Assicurarsi che la zona di iniezione è rivolta verso l&#39;alto. </li><li> Tirare pipette iniezione da vetro borosilicato e riempirli con uno dei seguenti tre soluzioni: a) una soluzione di 1,0 mg / ml di choleratoxin subunità b coniugato ad un fluoroforo Alexa 555 in PBS 12-13 (utilizzato principalmente per il trasporto retrogrado), b ) un -d 1%ilution in soluzione fisiologica 0,9% di destrano tetramethylrhodamine 555 (3.000 MW, utilizzato principalmente per il trasporto retrogrado) oppure c) una diluizione, 1% in soluzione fisiologica 0,9% di 10.000 MW-destrano TRITC 555 (utilizzato principalmente per il trasporto anterogrado). <ol><li> Assicurarsi che le resistenze gamma pipetta di iniezione 2,5-3,5 MOhm e che sono fabbricati in 3 - 4 cicli di trazione. Per gli esperimenti qui descritti, ottenere ciò selezionando un algoritmo tirando preprogrammato sul estrattore pipetta. </li></ol></li><li> Illuminare l&#39;espianto del cervello utilizzando un puntatore laser montato in modo statico della lunghezza d&#39;onda appropriata (punto n ° 2 nella figura 3A; 405 nm di lunghezza d&#39;onda negli esperimenti qui descritti). Utilizzare il puntatore laser come guida per le iniezioni, e puntare il fascio laser verso il nucleo cerebrale fluorescente o cellule di interesse che verrà iniettato. </li><li> Trovare e osservare il fascio luminoso attraverso un microscopio binoculare mentre indossa gli occhiali filtranti compatibili (450 - 700 nm filtro passa banda negli esperimenti qui descritti). Inserire l&#39;elettrodo di iniezione tramite micromanipolatore nella zona di interesse. </li><li> Iniettare la sostanza tracciante. Le iniezioni sono composti da 2 - 10 impulsi di pressione a 15 psi per 50 msec ciascuno, utilizzando un dispositivo di iniezione a pressione, diretto perpendicolarmente nella regione di interesse (ROI) all&#39;interno della sezione cervello. Somministrare ogni impulso di pressione ad intervalli di 10 - 15 secondi per consentire il colorante di diffondersi. </li><li> Nel caso delle iniezioni tetramethylrhodamine (TRITC), inoltre stimolare elettricamente per migliorare l&#39;assorbimento di colorante attraverso elettroporazione con l&#39;elettrodo posto nella zona del cervello di interesse (MNTB e VNTB negli esperimenti qui descritti). <ol><li> Utilizzare 8 impulsi TTL di 8 volt per 50 msec con 50 msec inter intervalli, guidati da uno stimolatore e amplificati a 55 V con una unità di isolamento di stimolazione (articoli n ° 7 e 9 nella Figura 3B). Usare 10 - 20 ripetizioni di questo protocollo, amminitrato per diversi minuti 7,8. Assicurati di massa l&#39;elettrodo correttamente - il filo di terra deve essere collegato al soluzione del bagno! </li></ol></li><li> Controllare successo dell&#39;iniezione. Dal momento che un tracciante fluorescente con una lunghezza d&#39;onda di emissione è più anche emettendo un segnale fluorescente su eccitazione laser con lunghezza d&#39;onda più corte, per controllare visivamente il colorante captazione / diffondersi nella zona di destinazione iniettata mentre illuminando la zona con il laser e osservando attraverso gli occhiali del filtro. </li></ol> 4. Incubazione <ol><li> Dopo l&#39;iniezione, incubare le brainstems nel liquido cerebrospinale artificiale ossigenato (ACSF; NaCl: 125 mM, KCl 2,5 mM, MgCl 2 1 mM, CaCl 2: 2 mM, glucosio 25 mM, NaH 2 PO 4: 1.25 mM, NaHCO 3: 25 mM, acido ascorbico: 0.4 mM, myo-inositolo: 3 mM, acido piruvico: 2 mM, bollito con 95% O 2 - 5% 2) a temperatura ambiente CO (RT, 25 ° C) per 1 - 4 ore, mentreil colorante viene trasportato. Bubble soluzione durante l&#39;intero periodo di incubazione. </li><li> Successivamente, trasferire i brainstems in 4% paraformaldeide (PFA) disciolto in PBS (circa 100 ml;. PH 7 per il mix PFA / PBS) e incubate a 4 ° C per consentire post-fissazione overnight (O / N). </li></ol> 5. Tessuto affettare e di montaggio <ol><li> Il giorno dopo, lavare il tronco cerebrale per tre volte in PBS (5 minuti per ogni fase di lavaggio), coprire nel 4% agar e poi tagliata a 50 - 80 micron di spessore fette su un vibratomo. Montare le fette con un mezzo di montaggio su un vetrino e coprioggetto. </li><li> Facoltativamente, etichettare le sezioni con Nissl fluorescente per 25 min (per esempio blu Nissl ad una diluizione 1: 100 in AB media). <ol><li> Per preparare AB media, mescolare 250 ml di 0,2 M tampone fosfato (PB; 51 KH MM 2 PO 4, 150 mm Na 2 HPO 4), 15 ml di 5 M di NaCl, 15 ml 10% Triton-X, 220 ml DDH 2 O e 5 g albumina di siero bovino. </li><li> Precede e avere successo l&#39;etichettatura Nissl passo da 3 fasi di lavaggio in PBS (10 minuti ciascuno). </li></ol></li></ol> Nota: Nei casi in cui devono essere montati e analizzato sezioni più spesse (in esperimenti descritti qui tali fette erano 100 - 500 micron di spessore per mantenere i collegamenti assonale su distanze più grandi), la tecnica può essere combinata con compensazione dei tessuti. Abbiamo trovato il ClearT2 12 per avere successo 20. Quando un passo di compensazione tessuto è incluso, eseguire prima di montare sezioni.

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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrically+induced+DNA+uptake+by+cells+is+a+fast+process+involving+DNA+electrophoresis.">Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis.</a> Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).</li><li>Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+Slice+Culture+of+E18+Rat+Brains.">Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains.</a> J. Vis. Exp. (6), e235 (2007).</li><li>G&#228;hwiler, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+monolayer+cultures+of+nervous+tissue.">Organotypic monolayer cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).</li><li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons.">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li></ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

Una forza generale in vitro tracciante elettroporazione, al contrario di studi in vivo tracciamento, è che dà ricercatori migliore accesso alla zona del cervello di interesse e quindi non comporta stereotassica costose (e spesso elettrofisiologico) attrezzature. Inoltre, il periodo di sopravvivenza richiesto per gli espianti cerebrali estende solo poche ore (1 - 4) invece di giorni o settimane nel caso di vivo iniezioni traccianti in (vedere una recensione dettagliata sull&#39;uso d...

Per definire un certo (micro) circuito neuronale, si deve avviare da trovare vari partecipanti di detto circuito, e il loro modello di connessione. Da quando la pubblicazione di Waller su neurofiber rintracciare attraverso la lesione 1 una grande varietà di tecniche di tracciamento neuroanatomiche è stata stabilita. Alcune di queste tecniche possono essere applicate in tessuto fissato post mortem 2-4, altri si basano sul trasporto attivo del colorante nei neuroni vivi, come scoperto nel 1971 5-6. Quest&#39;ultimo può essere ulteriormente suddiviso in due gruppi discriminano tra metodi sfruttando retrograda attiva (dalla zona iniettata alla sorgente di sporgenze, cioè. Somata di neuroni che sono sporgenti da detta area) e anterograda attiva (dal iniettato zona al target di una data di proiezione, cioè. le proiezioni assonale ei terminali assonale dei neuroni marcati) di trasporto. Inoltre, in alcuni casi di tramateriale cer viene iniettato in animali vivi che poi sopravvivono l&#39;iniezione di diversi giorni o settimane (a iniezioni vivo tracciante), mentre in altri casi cervelli espiantati vengono iniettati e incubare per diverse ore dopo l&#39;iniezione di liquido cerebrospinale artificiale (in vitro iniezioni tracciante) . In questo protocollo abbiamo modificato uno esistente in vitro tecnica elettroporazione 7-8 per etichettare somata e processi neuronale nel anterograda e tracciamento retrogrado esperimenti usando choleratoxin subunità-b e tetramethylrhodamine destrano le sostanze tracciamento. L&#39;obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire neuroscienziati con uno strumento efficiente per tracciare modelli di connettività tra i diversi nuclei neuronali del cervello, usufruendo di linee disponibili topo transgenico ed apparecchiature ottiche di base al fine di aumentare la precisione di mira durante le iniezioni traccianti. Sebbene il metodo di anterograda e retrograda usando tracingcholeratoxin e ammina destrano e rispettivi coniugati fluorescente non è nuova 9-13 (come è il metodo di elettroporazione, per es. Haas et al. 14), la combinazione di iniezioni traccianti con elettroporazione in una preparazione in vitro coinvolgono blocchi di tessuto cerebrale è uno sviluppo più recente 7. Il principale vantaggio rispetto alle tecniche di tracciatura neuronali utilizzando lo stesso tipo di coloranti traccianti di animali vivi è la maggiore intensità di etichettatura, a causa della maggiore efficienza con cui il colorante elettroporate viene ripreso dai neuroni. Un ulteriore vantaggio è il termine abbreviato di incubazione (necessario per il trasporto di colorante) e la sua maggiore accuratezza bersaglio durante l&#39;iniezione tracciante, perché lo sperimentatore ha il controllo visivo sull&#39;area bersaglio di iniezione. Quest&#39;ultimo significa anche che non costose apparecchiature stereotassica è richiesto per trovare il nucleo o il cervello area di interesse. Per addizionale aumentare la precisione di mira, abbiamo approfittato di una linea di topi transgenici, che esprime GFP nella sottopopolazione glicinergica di neuroni 15 ed apparecchiature ottiche di base che consistono di un puntatore laser portatile di 405 nm occhiali passa-banda di lunghezze d&#39;onda e la congruenza di filtraggio (450 - 700 nm). Così, abbiamo ottenuto un ulteriore significativo aumento di targeting accuratezza individuando la zona di iniezione attraverso il suo segnale fluorescente e fornendo un modo più fine di controllare per la diffusione di colorante all&#39;interno dell&#39;area di iniezione attraverso l&#39;osservazione dell&#39;interazione tra il segnale GFP indigena e il tracciante fluorescenza. La nostra tecnica permette anche di scoprire la funzionalità di un circuito con la sua connettività identificando neuroni inibitori GFP-positive (o eccitatorio in altre linee di topo), che sono stati riempiti con il tracciante. In sintesi, abbiamo ulteriormente migliorato un potente strumento per studiare la neuroscientifica connettoma del cervello dei vertebrati e valutare tha diverse caratteristiche neuroanatomiche di un determinato neurocircuit. Utilizzando topi transgenici con apparecchiature ottiche economico e largamente disponibile siamo stati in grado di aumentare significativamente la precisione di mira dei nostri iniezioni. Inoltre, i topi transgenici ha permesso di identificare il tipo di connessioni tracciate, che hanno contribuito scoprire la funzionalità di un microcircuito inibitorio nel tronco cerebrale uditivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td>All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride&#160;</td>
			<td></td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td></td>
			<td>P5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate di-basic</td>
			<td></td>
			<td>S907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td></td>
			<td>M2670</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td></td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td></td>
			<td>G7528</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td></td>
			<td>S6297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic acid</td>
			<td></td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Myo-inositol</td>
			<td></td>
			<td>I5125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td></td>
			<td>P2256</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumine</td>
			<td></td>
			<td>A2153</td>
			<td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton-X-100</td>
			<td></td>
			<td>X100</td>
			<td>optional, for additional (immuno)histochemistry</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol), 8000 MW</td>
			<td></td>
			<td>P2139</td>
			<td>optional, for brain clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>F84</td>
			<td>optional, for brain clearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Choleratoxin subunit-b</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C-34776 (Alexa 555)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dextrane tetramethyl-rhodamine</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>D-7162 (Alexa 555)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Nissl</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>N-21479 (blue)</td>
			<td>optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>SF93</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16520</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount-G</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>0100-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbi-tal</td>
			<td>Vortech Pharmaceuticals</td>
			<td>Fatal-Plus&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Borosilicate glass filaments</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>G150F-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette puller</td>
			<td>Zeitz Instruments, Germany</td>
			<td>DMZ Universal Puller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion setup</td>
			<td>Custom-made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser pointer&#160;</td>
			<td>laserpointerpro.com, Hong Kong</td>
			<td>HK-88007294 (405 nm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter/safety goggles</td>
			<td>Dragon Lasers, China</td>
			<td>LSG09 (band-pass 450-700 nm)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bionocular microscope&#160;</td>
			<td>Wild Heerbrugg, Switzerland</td>
			<td>Wild M3</td>
			<td>Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.)&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>Parker Instruments</td>
			<td>Picospritzer III</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PC with installed MC Stimulus software</td>
			<td>Multi Channel Sys-tems, Germany (software)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-channel stimulator</td>
			<td>Multi Channel Sys-tems, Germany</td>
			<td>STG-1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulation isolation unit</td>
			<td>A.M.P.I., Israel</td>
			<td>Iso-Flex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulator</td>
			<td>Narishige, Japan</td>
			<td>YOU-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>VT1000S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

laser-guided neuronal tracing in brain explants

Presentiamo una tecnica che combina un protocollo in vitro iniezione tracciante, che utilizza una serie di impulsi elettrici, di pressione per aumentare colorante assorbimento attraverso elettroporazione in espianti cerebrali con illuminazione laser mirati e congrui occhialini filtro durante la procedura. La tecnica descritta di elettroporazione in vitro per sé produce relativamente buon controllo visivo rivolti determinate aree del cervello. Attraverso la combinazione con il laser di eccitazione di marcatori genetici fluorescenti e la loro lettura attraverso gli occhiali di filtro a banda passante, che possono raccogliere le emissioni dei geneticamente etichettati cellule / nuclei e il colorante tracciamento fluorescente, un ricercatore può aumentare notevolmente la precisione delle iniezioni trovando l&#39;area di interesse e di controllo per il colorante diffuso / assorbimento nella zona di iniezione molto più efficiente. Inoltre, la tecnica di illuminazione laser consente di studiare la funzionalità di un dato neurocircuit dal provIding informazioni sul tipo di neuroni che proiettano una certa area in casi in cui l&#39;espressione della GFP è legata al tipo di trasmettitore espressa da una sottopopolazione di neuroni.

Figure 1 e 2 mostrano come il puntatore laser e occhiali laser può essere usato al genotipo modo rapido ed economico GFP animali risultati positivi da una cucciolata. In caso di cuccioli di topo, la tecnica può essere utilizzata per identificare in maniera non invasiva etichetta GFP nel cervello dell&#39;animale attraverso il cranio e la pelle sovrastante (Figura 1A - D). Fluorescenza emessa può essere visto attraverso la pelle e il cranio del mouse cuccioli almeno fino al giorno pos...

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Laser-guided Neuronal Tracing In Brain Explants

Descriviamo una tecnica per etichettare i neuroni ei loro processi tramite iniezioni anterograda o traccianti retrogradi in nuclei cerebrali con una preparazione in vitro. Abbiamo modificato un metodo esistente di i n vitro tracciante elettroporazione sfruttando fluorescente mutanti di topo attrezzatura ottica e di base al fine di aumentare la precisione di etichettatura.

Neuronal Tracing negli espianti cerebrali a guida laser

We present a technique which combines an in vitro tracer injection protocol, which uses a series of electrical and pressure pulses to increase dye uptake ...

laser-guided-neuronal-tracing-in-brain-explants

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.8K Views.  University of Colorado School of Medicine.  Descriviamo una tecnica per etichettare i neuroni ei loro processi tramite iniezioni anterograda o traccianti retrogradi in nuclei cerebrali con una preparazione in vitro. Abbiamo modificato un metodo esistente di i n vitro tracciante elettroporazione sfruttando fluorescente mutanti di topo attrezzatura ottica e di base al fine di aumentare la precisione di etichettatura. 

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DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; Gan et al., 2000). Here we provide a detailed description of each step required together with exemplary images of good and bad outcomes that will help when setting up the technique. In our experience, a few steps proved critical for the successful application of DiOLISTICS. These considerations include the quality of the DiI-coated bullets, the extent of fixative exposure, and the concentration of detergent used in the incubation solutions. Tips and solutions for common problems are provided. This is a versatile labeling technique that can be applied to multiple animal species at a wide range of ages. Unlike other fluorescent labeling techniques that are limited to preparations from young animals or restricted to mice because they rely on the expression of a fluorescent transgene, DiOLISTIC labeling can be applied to animals of all ages, species and genotypes and it can be used in combination with immunostaining to identify a specific subpopulation of cells. Here we demonstrate the use of DiOLISTICS to label neurons in brain slices from adult mice and adult non-human primates with the purpose of quantifying dendrite branching and dendritic spine morphology.

We demonstrate the use of the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons in brain slices from rodents and non-human primates of different ages. In this particular case, we use adult mice (3-6 months old) and adult cynomologus monkeys (9-15 years old). This technique, originally described by the laboratory of Dr. Lichtman (Gan et al., 2000), is well suited for the study of dendritic branching and dendritic spine morphology and can be combined with traditional immunostaining, if detergents are kept at a low concentration.

Etichettatura DiOLISTIC di neuroni da roditori e non-umano Fette cervello dei primati

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Ricerca

Neuroscienze

Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output. During development, this activity is important for the migration and differentiation of cortex cell types and the formation of neuronal connections1. In the mature animal, ongoing activity reflects the past and the present state of an animal into which sensory stimuli are seamlessly integrated to compute future actions. Thus, a clear understanding of the organization of ongoing i.e. spontaneous activity is a prerequisite to understand cortex function. 
Numerous recording techniques revealed that ongoing activity in cortex is comprised of many neurons whose individual activities transiently sum to larger events that can be detected in the local field potential (LFP) with extracellular microelectrodes, or in the electroencephalogram (EEG), the magnetoencephalogram (MEG), and the BOLD signal from functional magnetic resonance imaging (fMRI). The LFP is currently the method of choice when studying neuronal population activity with high temporal and spatial resolution at the mesoscopic scale (several thousands of neurons). At the extracellular microelectrode, locally synchronized activities of spatially neighbored neurons result in rapid deflections in the LFP up to several hundreds of microvolts. When using an array of microelectrodes, the organizations of such deflections can be conveniently monitored in space and time. 
Neuronal avalanches describe the scale-invariant spatiotemporal organization of ongoing neuronal activity in the brain2,3. They are specific to the superficial layers of cortex as established in vitro4,5, in vivo in the anesthetized rat 6, and in the awake monkey7. Importantly, both theoretical and empirical studies2,8-10 suggest that neuronal avalanches indicate an exquisitely balanced critical state dynamics of cortex that optimizes information transfer and information processing.
In order to study the mechanisms of neuronal avalanche development, maintenance, and regulation, in vitro preparations are highly beneficial, as they allow for stable recordings of avalanche activity under precisely controlled conditions. The current protocol describes how to study neuronal avalanches in vitro by taking advantage of superficial layer development in organotypic cortex cultures, i.e. slice cultures, grown on planar, integrated microelectrode arrays (MEA; see also 11-14).

A robust way to study neuronal avalanches, i.e. scale-invariant spatio-temporal activity bursts, indicative of critical state dynamics in cortex. Avalanches emerge spontaneously in developing superficial layers of cultured cortex which allows for long-term measurements of the activity with planar integrated multi-electrode arrays (MEA) under precisely controlled conditions.

Multi-array di elettrodi Recordings Valanghe neuronali in Culture organotipica

The cortex is spontaneously active, even in the absence of any particular input or motor output.  During development, this activity is important for the ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Indurre Plasticità di astrociti recettori per manipolazione del neuronali di cottura Prezzi

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Intracerebroventricular Viral Injection of the Neonatal Mouse Brain for Persistent and Widespread Neuronal Transduction

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene expression in the mouse brain. Here we describe a technique first introduced by Passini and Wolfe for direct intracranial delivery of virally-encoded transgenes into the neonatal mouse brain. In its most basic form, the procedure requires only an ice bucket and a microliter syringe. However, the protocol can also be adapted for use with stereotaxic frames to improve consistency for researchers new to the technique. The method relies on the ability of adeno-associated virus (AAV) to move freely from the cerebral ventricles into the brain parenchyma while the ependymal lining is still immature during the first 12-24 hr after birth. Intraventricular injection of AAV at this age results in widespread transduction of neurons throughout the brain. Expression begins within days of injection and persists for the lifetime of the animal. Viral titer can be adjusted to control the density of transduced neurons, while co-expression of a fluorescent protein provides a vital label of transduced cells. With the rising availability of viral core facilities to provide both off-the-shelf, pre-packaged reagents and custom viral preparation, this approach offers a timely method for manipulating gene expression in the mouse brain that is fast, easy, and far less expensive than traditional germline engineering.

Here we demonstrate a technique for widespread neuronal transduction by intraventricular injection of adeno-associated virus into the neonatal mouse brain. This method provides a rapid and easy way to attain lifelong expression of virally-delivered transgenes.

Intracerebroventricular Iniezione virale del cervello neonatale mouse per persistente e diffusa trasduzione neuronale

With the pace of scientific advancement accelerating rapidly, new methods are needed for experimental neuroscience to quickly and easily manipulate gene ...

Closed-loop Neuro-robotic Experiments to Test Computational Properties of Neuronal Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation of a given stimulus might be dependent on context and history. If this is actually the case, bi-directional interactions between the brain (or if need be a reduced model of it) and sensory-motor system can shed a light on how encoding and decoding of information is performed. Here an experimental system is introduced and described in which the activity of a neuronal element (i.e., a network of neurons extracted from embryonic mammalian hippocampi) is given context and used to control the movement of an artificial agent, while environmental information is fed back to the culture as a sequence of electrical stimuli. This architecture allows a quick selection of diverse encoding, decoding, and learning algorithms to test different hypotheses on the computational properties of neuronal networks.

In this paper, an experimental framework to perform closed-loop experiments is presented, in which information processing (i.e., coding and decoding) and learning of neuronal assemblies are studied during the continuous interaction with a robotic body.

Closed-loop di esperimenti neuro-robotica a prova le proprietà computazionali di neuronali Networks

Information coding in the Central Nervous System (CNS) remains unexplored. There is mounting evidence that, even at a very low level, the representation ...

Conditional Genetic Transsynaptic Tracing in the Embryonic Mouse Brain

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits during embryonic maturation of the brain however is technically challenging because most transsynaptic tracing methods developed to date depend on stereotaxic tracer injection. To overcome this problem, we developed a binary genetic strategy for conditional genetic transsynaptic tracing in the mouse brain. Towards this end we generated two complementary knock-in mouse strains to selectively express the bidirectional transsynaptic tracer barley lectin (BL) and the retrograde transsynaptic tracer Tetanus Toxin fragment C from the ROSA26 locus after Cre-mediated recombination. Cell-specific tracer production in these mice is genetically encoded and does not depend on mechanical tracer injection. Therefore our experimental approach is suitable to study neural circuit formation in the embryonic murine brain. Furthermore, because tracer transfer across synapses depends on synaptic activity, these mouse strains can be used to analyze the communication between genetically defined neuronal populations during brain development at a single cell resolution. Here we provide a detailed protocol for transsynaptic tracing in mouse embryos using the novel recombinant ROSA26 alleles. We have utilized this experimental technique in order to delineate the neural circuitry underlying maturation of the reproductive axis in the developing female mouse brain.

Capitalizing on a binary genetic strategy we provide a detailed protocol for neural circuit tracing in mice that express complementary transsynaptic tracers after Cre-mediated recombination. Because cell-specific tracer production is genetically encoded, our experimental approach is suitable to study the formation and maturation of neural circuitry during murine embryonic brain development at a single cell resolution.

Condizionale genetica Transsynaptic Tracing nel cervello embrionali di topo

Anatomical path tracing is of pivotal importance to decipher the relationship between brain and behavior. Unraveling the formation of neural circuits ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

Imaging del due-fotone calcio nei dendriti neuronali nelle fette del cervello

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

Preparazione della fetta di cuneo in vitro per imitare la connettività del circuito neuronale in vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Methods Article

Neuronal Tracing negli espianti cerebrali a guida laser