Gli autori desiderano ringraziare Chiyoko Kobayashi e Kiyokazu Agata per utili consigli sul trapianto di planaria così come i membri passati e presenti del laboratorio per le discussioni Sánchez preziosi durante lo sviluppo di queste tecniche. Questo lavoro è stato supportato dal NIH Training Grant (5T32 HD0791) per OCG e NIH R37GM057260 ad ASA. ASA è un Howard Hughes Medical Institute.

Nota: questo protocollo suggerisce l&#39;uso di materiali potenzialmente pericolosi (piombo e chloretone). Acquisire, leggere e seguire MSDS per tutti i materiali potenzialmente pericolosi. 1. Animal Cultura, selezione e preparazione <ol><li> Per la cultura degli animali e l&#39;uso dell&#39;acqua manipolazione planaria (1X sali di Montjuïc 9) e pipette di plastica. </li><li> Sexual biotipo Schmidtea mediterranea può essere utilizzato quando sollevate in laboratorio in condizioni normali condizioni di coltura a 10. Per produrre esemplari asessuali di dimensioni necessarie, S. mediterranea sollevato a temperatura ambiente in condizioni normali 9 dovrebbe essere alimentati a doppia tripla frequenza normale (2-3 volte a settimana) per uno o due mesi prima da utilizzare. In alternativa, gli animali asessuali alimentati a frequenza normale può essere conservato a 10 gradi Celsius indefinitamente per aumentare la loro dimensione media. </li><li> Selezionare animali che sono tra 1 e 2 cmlunghezza e più largo 2 mm quindi fame animali 3-7 giorni prima dell&#39;uso. </li><li> Se l&#39;esecuzione di eventuali trattamenti farmacologici o radiologici su host destinati, i donatori, o animali irradiati in parte, effettuare il trattamento (s) a questo punto. </li><li> Se i trattamenti farmacologici sono stati eseguiti che ha richiesto l&#39;alimentazione degli animali, gli animali muoiono di fame altri 3 a 7 giorni prima dell&#39;uso. </li></ol> 2. Preparazione di soluzioni e materiali <ol><li> Preparare la soluzione chloretone, un leggero anestetico locale, sciogliendo 0.1-0.2% w / v in acqua chloretone planarian refrigerazione e la soluzione su ghiaccio. </li><li> Se si esegue l&#39;irradiazione solo parziale, passare al punto 2.7. Per il trapianto di tessuti proseguire con il passo 2.3. </li><li> Utilizzando un becco Bunsen, piegare diametro interno 0,75 mm, usato per tagliare il tessuto trapiantato, e 0,7 mm di diametro esterno, usato per la creazione di un foro in cui l&#39;host riceverà il trapianto, tubi capillari ad un angolo di 90 ° a 1-2 cm dalla fine each tubo. Per salvare i materiali, piegare entrambe le estremità di ogni tubo capillare e rompere a metà per la produzione di due strumenti. Fate attenzione a non fiamma le estremità dei tubi stessi. </li><li> Tagliare i seguenti documenti alle dimensioni indicate: <ul><li> Nero filtro di carta (tagliata in rettangoli. Circa 2,5 cm x 1,5 cm) </li><li> Whatman # 3 filtro di carta (tagliata in rettangoli di circa 2 cm x 0,5 cm) </li><li> Kimwipe (piegato e tagliato a circa borre. 3 cm x 0,5 cm x 4 ply) </li><li> Cigarette rolling paper (rimuovere la striscia di gomma e tagliate a rettangoli. Circa 3 cm x 2 cm) </li></ul></li><li> Preparare modificato Holtfreter la soluzione (3,5 g / L di NaCl, 0,2 g / L NaHCO 3, 0,05 g / L KCl, 0,2 g / L MgSO 4, 0,1 g / L CaCl 2, pH 7,0-7,5) e caseina soluzione satura Holtfreter e freddo sia a 4 ° C. </li><li> Collegare un Kimwipe piegato ad un quadrato di Parafilm e luogo sulla piastra refrigerante Peltier o altro dispositivo di raffreddamento posta sotto un microscopio da dissezione. Impregnare il Kimwipe con Holtf refrigeratesoluzione di reter e posto due rettangoli neri sulla carta da filtro Kimwipe. </li><li> Linea piastre di Petri con Whatman # 2 carta da filtro. Inumidire la carta da filtro con la soluzione Holtfreter e raffreddare i piatti sul ghiaccio. Per irradiazione parziale un&#39;antenna più grande e rivestimento di carta filtro può essere utilizzato. </li></ol> 3. Anestesia e immobilizzazione <ol><li> Riempire una capsula di Petri con una soluzione chloretone refrigerati e pipette vermi nel piatto. Per trapianto solo anestetizzare un host e un donatore alla volta. Per irradiazione parziale molti (n&gt; 10) gli animali possono essere anestetizzati in una volta. </li><li> Lasciare in ammollo i vermi nella soluzione chloretone fino a diventare immobili (5-10 min). </li><li> Risciacquare vermi pipettando in un piatto riempito con la soluzione Holtfreter refrigerate di. </li><li> Immobilizzare gli animali pipettando loro nero su carta da filtro con la soluzione satura Holtfreter refrigerate e orientarli lato ventrale verso il basso con una pinza. Se gli animali sono in grado di locomote, assorbire la soluzione Holtfreter in eccesso, leggermente diminuire la temperatura della vostra Peltier o piatto freddo, o aumentare la durata del trattamento chloretone. </li></ol> 4. L&#39;irradiazione parziale Nota: Seguire questa procedura per preparare gli animali per l&#39;irradiazione parziale. Se si esegue il trapianto, invece, passare alla sezione 5. <ol><li> Posizionare un piatto freddo Petri a partire dal punto 2,7 su ghiaccio nel secchiello del ghiaccio che si inserisce all&#39;interno di una fonte top X-ray irradiatore. </li><li> Disporre animali anestetizzati in una capsula di Petri spostando il filtro di carta nera su cui si sono immobilizzati. Utilizzo di pinze per spostare i vermi anestetizzati direttamente possono ferire. </li><li> Trasporto disposti animali ad una top-sorgente di raggi X irradiatore e collocare il contenitore del ghiaccio tale che la distanza dal tubo catodico agli animali viene minimizzata, massimizzando così il tasso di dose efficace. </li><li> Posizione piombo scudo (s) (figura 1) tra gli animali e la t catodoUbe come desiderato. Shields dovrebbe essere 4,5 a 6 mm per consentire l&#39;97-99% di una attenuazione dei raggi X 325kV trave 11. </li><li> Fornire dose di raggi X. Se completa ablazione delle cellule staminali da non schermati regioni si desidera, fornire 30 Gy o superiori utilizzando un X-ray irradiatore. Per riferimento, 30 Gy è equivalente a 3,6 minuti a 320 kilovolt e 10 milliampere in una precisione X-Ray Inc. XRAD320 con un campo-sorgente distanza di 30 centimetri. </li><li> Immediatamente dopo la somministrazione è stata completata, la gestione vermi dal filtro di carta nera, gli animali di trasferimento in acqua refrigerata planaria. Consentire l&#39;acqua planarian a temperatura ambiente e gli animali stessi per rimuovere dalla carta filtro nero. La procedura di irradiazione parziale è ora completa. </li></ol> 5. Trapianto di tessuti <ol><li> Utilizzando una pipetta di trasferimento e pinze, organizzare ospite anestetizzato e vermi dei donatori sulla rettangoli separati di nero carta da filtro sul Kimwipe che è stato raffreddato in Peltier piatto o più fredda sotto il microscopio di dissezione. </li><li> Utilizzando un tubo di diametro interno 0,75 millimetri capillare tagliato la spina innesto dal donatore e, utilizzando pinze, posizionarlo su un rimpicciolire la porzione via del host. Se il materiale innesto rimane incastrato nel tubo capillare, rimuovere con una pinza. </li><li> Utilizzando un tubo di 0,7 mm di diametro esterno capillare rimuovere un plug dall&#39;host e utilizzando la posizione pinza l&#39;innesto nel foro che viene lasciato alle spalle. </li><li> Trasferire l&#39;host trapiantato sul suo rettangolo nero carta da filtro nella piastra di Petri preparato nella fase 2.7. </li><li> Bagnare un pezzo di carta laminazione con soluzione satura Holtfreter caseina e posizionarlo sopra dell&#39;host trapiantato come diagramed in Figura 2A. </li><li> Immergere quattro pezzi di carta da filtro in caseina soluzione satura Holtfreter e racchiudono l&#39;host trapiantato come diagramed nella figura 2B. </li><li> Immergere quattro mazzette di Kimwipe taglio caseina soluzione satura Holtfreter e stenderli sula carta da filtro passo 5,6 (Figura 2B). Sostituire il coperchio e mettere il piatto Petri su ghiaccio. </li><li> Trasferire il worm donatore planaria in acqua per recuperare, curare e rigenerare. </li><li> Quando tutti i trapianti sono stati completati, inserire i vermi trapiantate in un incubatore a 10 ° C durante la notte. </li><li> La mattina seguente, facendo attenzione a non disturbare l&#39;innesto, scoprire il worm e trasferirlo (sulla sua carta da filtro nero) in una capsula di Petri riempita con acqua planaria. </li><li> Lasciare che il worm per rimuovere se stesso dalla carta da filtro o rimuoverli delicatamente con una pinza. </li><li> Cambiare l&#39;acqua planaria una volta ogni 2-3 giorni. </li></ol> 6. Risultati rappresentativi Subito dopo l&#39;irradiazione parziale planaria apparirà normale e inalterati. A seconda della dose erogata e la geometria dello scudo utilizzato, tessuto irradiato può regredire e addirittura disintegrano 7. Tessuto schermato dovrebbe rimanere intatto. Follregressione tessuto seguito e una perdita di integrità del tessuto, un blastoma formerà e strutture mancanti sarà rigenerato (Figura 3A). Se un amputazione viene effettuata nella regione irradiata parzialmente, il tessuto irradiato verrà salvato (cioè impedito di regressione o disintegrazione) (Figura 3B). In entrambi i indenne e la rigenerazione caso amputata sarà ritardato rispetto ad un amputato non irradiato planaria (Figura 3C). Se una dose di raggi X di 30 Gy stato consegnato e l&#39;animale era parzialmente irradiato illeso, successo ablazione cellule staminali in un modello corrispondente con lo scudo piombo usato può essere confermata da 2 a 3 giorni dopo irradiazione parziale mediante ibridazione in situ per la cellula staminale marcatore Smed-piwi-1 12 (aka smedwi-1) (Figura 4). Il mattino successivo trapianto, un innesto positivo del tessuto trapiantato dovrebbe essere w evidentiell&#39;ambito del tessuto ospite, avendo aderito ad entrambe le superfici dorsale e ventrale del paese ospitante (Figura 5A). Di tanto in tanto, l&#39;innesto aderirà alla sola superficie ventrale o dorsale. Se il trapianto era completamente successo, nessun segno dell&#39;innesto sarà visibile sia dalla superficie dorsale o ventrale dell&#39;ospite (Figura 5B). Poco dopo un innesto positivo di non-tessuto irradiato in un ospite che era stato asportato di cellule staminali per irradiazione letale 13,14, ibridazione in situ per Smed-piwi-1 rivela che le cellule staminali sono presenti prevalentemente nella innesto (figura 5C ). Inoltre, innesti di successo non-tessuto irradiato letalmente irradiati in padroni di casa si tradurrà in salvataggio di tessuto ospite e di sopravvivenza a lungo termine dello Stato membro ospitante 15. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig1.jpg" /> Figura 1. Disposizione generale del componente di bases per irradiazione parziale. In un irradiatore a raggi X con un top posizionato sorgente di raggi X (tubo catodico) il planarian anestetizzato è posizionato direttamente sotto la sorgente di raggi X nel campo di irradiazione. Per massimizzare raggi X dose, la distanza tra il planarian e la sorgente di raggi X dovrebbe essere minimizzato. Uno schermo cavo deve essere posizionato tra il tubo catodico e il verme anestetizzato, più vicino alla vite senza fine come pratico. Lo schermo principale dovrebbe essere progettati, costruiti e posizionati in modo che si protegge il tessuto desiderato, ma espone completamente il resto del worm. Molti produttori commerciali produrrà schermi di piombo personalizzati dal vostro diagramma di design semplice, abbiamo usato con successo Alpha Systems Corp. (Bluffdale, UT). Il cavo deve essere sufficientemente spesso da consentire la quantità desiderata di schermatura. Per esempio, se quasi completa schermatura 320 kV di un fascio di raggi X si desidera, il cavo deve essere 4,5 a 6 mm. La planaria e lo schermo sono posizionati sucarta imbevuta un filtro Holtfreter doppiata capsula di Petri, che riposa in un secchiello del ghiaccio. Dato un sufficientemente grande campo dei raggi X irradiazione e un certo numero di scudi piombo identici, molti campioni possono essere parzialmente irradiato in una sola volta (non raffigurato). <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig2.jpg" /> Figura 2. Costruire la camera di recupero. (A) una vista esplosa della camera di raccolta del tessuto trapianto, che mostra tutti i componenti che sono stratificati uno sopra l&#39;altro, dopo essere stati immersi in soluzione satura di caseina di Holtfreter. (B) Una camera di recupero è quasi completata, che illustra il posizionamento ad incastro della Whatman # 3 rettangoli di carta da filtro, che racchiudono perfettamente la planaria anestetizzato, impedendo il movimento durante la guarigione. La costruzione accurata della camera di recupero impedisce il movimento degli animali e di essiccazione, promuovendo rapida guarigione e maggiore efficacia del trapianto di tessuto. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig3.jpg" /> Figura 3. Risultati rappresentativi di semplice irradiazione posteriore parziale. Come descritto Dubois 7, (A) quando la metà posteriore del planarie sono stati schermati con piombo e quindi esposti alla x-ray irradiazione del tessuto anteriore è stato osservato a regredire di nuovo al confine tra la irradiato e schermato tessuto in cui blastemas punto depigmentate formata e gli animali cominciarono a rigenerarsi. (B) D&#39;altro canto, quando gli animali sono stati decapitati seguendo la stessa irradiazione parziale eseguita in (A), regressione tessuto non è stata osservata e il restante tessuto irradiato anteriore stato salvato. Il decapitato animali irradiati in parte le teste rigenerato (B), tuttavia, la rigenerazione è stato significativamente ritardato rispetto ai controlli non irraggiati decapitati (C). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig4.jpg" /> Figura 4. Rappresentante outcome di ablazione parziale di cellule staminali dopo irradiazione parziale. Whole-mount ibridazione in situ (WISH) per il marcatore di cellule staminali Smed-piwi-1 rivela che planaria wild type sono le cellule staminali distribuito in tutto il loro corpo, ad eccezione del tessuto anteriore al fotorecettori (punta di freccia) e la corretta faringe (asterisco) 14. (A) Esprimete un desiderio Smed-piwi-1 nel controllo irradiato, ma completamente schermato planaria fissata tre giorni dopo l&#39;irradiazione mostra una distribuzione di cellule staminali che è indistinguibile da quella della planaria wild type. (B) D&#39;altro canto, voglia di Smed-piwi-1 negli animali che sono stati solo parzialmente schermati, lasciando esposta anteriore e posteriore, ma sono stati anche fissati tre giorni di seguito viene illustrato irradiazione che le cellule staminali vengono asportate dalle regioni non schermati . Barre di scala sono 500 micron. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4015/4015fig5.jpg" /> Figura 5. Examples di trapianto di tessuti di successo e insuccesso. (A) Immagini in diretta di opinioni dorsali e ventrali di una planaria trapiantato con successo tre giorni dopo il trapianto. L&#39;innesto (indicata) è chiaramente visibile su entrambe le superfici dorsale e ventrale ed è circondata da caratteristici del tessuto pigmentato al trapianto di interfaccia host. (B) Di conseguenza, i trapianti non riusciti non visualizzare alcun innesto di tessuto visibile sul sito trapianto (indicata) e invece mostrano un guarito, non pigmentato, ferita laterale dal trapianto fallito. Un innesto che aderisce solo la dorsale o la superficie ventrale può assomigliare ad un trapianto di successo (A) se visto da un lato e un trapianto successo (B) se visto dall&#39;altro. (C) Quando wild type (WT), il tessuto si innesta in un ospite irradiato che è stato asportato di cellule staminali residenti e le cellule staminali trapiantate sono successivamente rivelate da WISH per Smed-piwi-1 due giorni successivi al trapianto, leil successo del trapianto è mostrato chiaramente dalla presenza di cellule staminali solo in o attorno alla posizione innesto (frecce). Barre di scala sono 500 micron.

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Importanza di immobilizzazione L&#39;immobilizzazione è di gran lunga il passo più critico per il completamento di qualsiasi di questi processi. Se planaria sono impropriamente immobilizzati prima dell&#39;irradiazione parziale, possono muoversi sotto lo scudo di piombo, producendo risultati inconsistenti e confusione. Inoltre, se gli animali sono sufficientemente immobilizzati dopo il trapianto, il verme host probabilmente allontanarsi dal tessuto innesto, con conseguente fallimento del trap...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> General Purpose pipetta di trasferimento </td><td> Samco </td><td> 691 </td></tr><tr><td> Tubi capillari (ID 0,75 mm) </td><td> FHC </td><td> 30-30-0 </td></tr><tr><td> Tubi capillari (diametro esterno 0,7 mm) </td><td> FHC </td><td> 30-50-08 </td></tr><tr><td> Parafilm M </td><td> VWR </td><td> 52858-076 </td></tr><tr><td> Kimwipes 34155 </td><td> VWR </td><td> 500029-891 </td></tr><tr><td> Nero carta da filtro </td><td> Schleicher &amp; Schuell </td><td> 10310809 </td></tr><tr><td> Whatman # 2 filtro di carta 1002-055 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-810b </td></tr><tr><td> Whatman # 3 filtro di carta 1003-185 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 09-820E </td></tr><tr><td> Cigarette rolling paper </td><td> Zig-Zag, originale </td><td> NA </td></tr><tr><td> Petripiatti </td><td> VWR </td><td> 82050-544 </td></tr><tr><td> Pinza DUMONT, INOX # 5 </td><td> FST </td><td> 11251-20 </td></tr><tr><td> Chloretone </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 112054 </td></tr><tr><td> Caseina </td><td> Sigma Aldrich </td><td> C3400 </td></tr><tr><td> Piombo Shields </td><td> Alpha Systems Corp., Bluffdale, UT </td><td> Design personalizzato </td></tr><tr><td> XRAD-320 Irradiator biologica </td><td> Precision X-Ray, North Branford, CT </td><td> NA </td></tr></tbody></table>

planarian immobilization, partial irradiation, and tissue transplantation

La planaria, un verme piatto d&#39;acqua dolce, ha dimostrato di essere un potente sistema per la rigenerazione dei metazoi dissezione e la biologia delle cellule staminali 1,2. Rigenerazione planaria di eventuali tessuti mancanti o danneggiate è resa possibile da cellule staminali adulte chiamato neoblasts 3. Anche se queste cellule staminali sono state definitivamente dimostrato di essere pluripotenti e singolarmente in grado di ricostituire un animale intero 4, l&#39;eterogeneità all&#39;interno della popolazione di cellule staminali e le dinamiche dei loro comportamenti cellulari rimangono in gran parte irrisolti. A causa del numero elevato e ampia distribuzione di cellule staminali in tutto il corpo piano planarian, metodi avanzati per manipolare sottopopolazioni di cellule staminali per lo studio molecolare e funzionale in vivo sono necessari. Trapianto di tessuti e di irradiazione parziale sono due metodi con cui una sottopopolazione di cellule staminali planaria possono essere isolati per ulteriori studi. Ogni tecnica ha i suoi vantaggi distinti. Ttrapianto questione permette l&#39;introduzione di cellule staminali, in un ospite ingenuo, che sono intrinsecamente o geneticamente distinte o sono stati precedentemente trattati farmacologicamente. In alternativa, irradiazione parziale consente l&#39;isolamento di cellule staminali all&#39;interno di un host, giustapposti al tessuto privo di cellule staminali, senza l&#39;introduzione di una ferita o culatta in integrità dei tessuti. Utilizzando questi due metodi, si può indagare sui fattori cellulari autonomi e non autonomi che controllano le staminali funzioni cellulari, quali la proliferazione, la differenziazione e la migrazione. Sia il trapianto di tessuti 5,6 e l&#39;irradiazione parziale 7 sono state utilizzate storicamente nella definizione molte delle domande circa la rigenerazione planaria che rimangono in fase di studio oggi. Tuttavia, queste tecniche sono rimaste sottoutilizzate a causa della natura laboriosa e incoerente dei metodi precedenti. I protocolli presentati qui rappresentano un grande passo in avanti nel ridurre il tempo di unond sforzo necessario per generare in modo riproducibile un gran numero di animali innestati o parzialmente irradiato con efficacie che si avvicinano al 100 per cento. Copriamo la cultura degli animali di grandi dimensioni, l&#39;immobilizzazione, la preparazione per l&#39;irradiazione parziale, il trapianto di tessuti, e l&#39;ottimizzazione del recupero degli animali. Inoltre, il lavoro qui descritto dimostra la prima applicazione del metodo irradiazione parziale per l&#39;uso con la planarian più ampiamente studiato, Schmidtea mediterranea. Inoltre, il tessuto efficiente innesto in planaria apre la porta per il test funzionale di sottopopolazioni di cellule staminali naive o trattati in saggi di ripopolamento, che ha da tempo il metodo di gold-standard di saggiare il potenziale delle cellule staminali dell&#39;adulto nei mammiferi 8. Ampia adozione di queste tecniche sarà senza dubbio portato ad una migliore comprensione dei comportamenti cellulari di cellule staminali adulte durante l&#39;omeostasi dei tessuti e la rigenerazione.

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Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

Un metodo efficace per l&#39;innesto di tessuto di dimensione definita e coerente tra planaria è descritto. È inclusa anche una descrizione di come la tecnica di immobilizzazione utilizzata per il trapianto può essere adattato, in combinazione con scudi piombo, per l&#39;irradiazione parziale di animali vivi.

Planaria immobilizzazione, irradiazione parziale, e di tessuti

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

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Research

JoVE Journal

Biology

19.4K Views.  University of Utah School of Medicine. Un metodo efficace per l'innesto di tessuto di dimensione definita e coerente tra planaria è descritto. È inclusa anche una descrizione di come la tecnica di immobilizzazione utilizzata per il trapianto può essere adattato, in combinazione con scudi piombo, per l'irradiazione parziale di animali vivi.

Video: Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

Murine Skin Transplantation

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. The aim of this video-article is to provide the viewer with a step-by-step visual demonstration of skin transplantation using the mouse model. The protocol is divided into 5 main components: 1) harvesting donor skin; 2) preparing recipient for transplant; 3) skin transplant; 4) bandage removal and monitoring graft rejection; 5) helpful hints. Once proficient, the procedure itself should take &lt;10 min to perform.

Allogeneic skin transplantation is a standard model to assay host T cell responses to MHC-disparate donor antigens. This video-article provides a visual tutorial of each step involved in performing a BALB/c--&gt;C57BL/6 skin transplant.

Trapianto di pelle murina

As one of the most stringent and least technically challenging models, skin transplantation is a standard method to assay host T cell responses to ...

Ricerca

Biologia

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

Actina Co-sedimentazione di analisi, per l&#39;Analisi del Binding Protein a F-Actina

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

Generazione di Human CD40 delle cellule B attivate

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

Tessuto Chimere mirate embrionali: Zebrafish gastrula trapianto di cellule

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from these animals reform the original body plan following regeneration of missing body structures. For example if a 'trunk' fragment is cut from an intact worm, a new 'head' will regenerate anteriorly and a 'tail' will regenerate posteriorly restoring the original 'head-to-tail' polarity of body structures prior to amputation (Figure 1A).
Regeneration is driven by planarian stem cells, known as 'neoblasts' which differentiate into ~30 different cell types during normal body homeostasis and enforced tissue regeneration. This regenerative process is robust and easy to demonstrate. Owing to the dedication of several pioneering labs, many tools and functional genetic methods have now been optimized for this model system. Consequently, considerable recent progress has been made in understanding and manipulating the molecular events underpinning planarian developmental plasticity2-9.
The planarian model system will be of interest to a broad range of scientists. For neuroscientists, the model affords the opportunity to study the regeneration of an entire nervous system, rather than simply the regrowth/repair of single nerve cell process that typically are the focus of study in many established models. Planarians express a plethora of neurotransmitters10, represent an important system for studying evolution of the central nervous system11, 12 and have behavioral screening potential13, 14. 
Regenerative outcomes are amenable to manipulation by pharmacological and genetic apparoaches. For example, drugs can be screened for effects on regeneration simply by placing body fragments in drug-containing solutions at different time points after amputation. The role of individual genes can be studied using knockdown methods (in vivo RNAi), which can be achieved either through cycles of microinjection or by feeding bacterially-expressed dsRNA constructs8, 9, 15. Both approaches can produce visually striking phenotypes at high penetrance- for example, regeneration of bipolar animals16-21. To facilitate adoption of this model and implementation of such methods, we showcase in this video article protocols for pharmacological and genetic assays (in vivo RNAi by feeding) using the planarian Dugesia japonica.

Pharmacological and Functional Genetic Assays to Manipulate Regeneration of the Planarian Dugesia japonica

An attractive model for studying stem cell differentiation within a live animal is the planarian flatworm. Regeneration is studied by simple amputation experiments that are easily performed in a basic laboratory and are amenable to pharmacological and genetic (in vivo RNAi) manipulation as detailed by protocols in this article.

I dosaggi farmacologici genetica e funzionale di manipolare Rigenerazione del Planaria Japonica Dugesia</em

Free-living planarian flatworms have a long history of experimental usage owing to their remarkable regenerative abilities1. Small fragments excised from ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

Germ trapianto di cellule e di tessuto testicolare xenotrapianto in topi

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to complete. We describe a method for the rapid isolation of mitochondria from mammalian biopsies using a commercial tissue dissociator and differential filtration. In this protocol, manual homogenization is replaced with the tissue dissociator&#8217;s standardized homogenization cycle. This allows for uniform and consistent homogenization of tissue that is not easily achieved with manual homogenization. Following tissue dissociation, the homogenate is filtered through nylon mesh filters, which eliminate repetitive centrifugation steps. As a result, mitochondrial isolation can be performed in less than 30 min. This isolation protocol yields approximately 2 x 1010 viable and respiration competent mitochondria from 0.18 &#177; 0.04 g (wet weight) tissue sample.

A method for rapid isolation of mitochondria from mammalian tissue biopsies is described. Rat liver or skeletal muscle preparations were homogenized with a commercial tissue dissociator and mitochondria were isolated by differential filtration through nylon mesh filters. Mitochondrial isolation time is &#60;30 min compared to 60 - 100 min using alternative methods.

Isolamento rapida e purificazione di mitocondri per il trapianto da tessuto Dissociazione e Filtrazione Differenziale

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

A Mouse Model of Intestinal Partial Obstruction

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including tumorous growths. However, the cellular remodeling mechanisms involved in, and caused by, intestinal obstructions are poorly understood. Several animal models of intestinal obstructions have been developed, but the mouse model is the most cost/time effective. The mouse model uses the surgical implantation of an intestinal partial obstruction (PO) that has a high mortality rate if it is not performed correctly. In addition, mice receiving PO surgery fail to develop hypertrophy if an appropriate blockade is not used or not properly placed. Here, we describe a detailed protocol for PO surgery which produces reliable and reproducible intestinal obstructions with a very low mortality rate. This protocol utilizes a surgically placed silicone ring that surrounds the ileum which partially blocks digestive movement in the small intestine. The partial blockage makes the intestine become dilated due to the halt of digestive movement. The dilation of the intestine induces smooth muscle hypertrophy on the oral side of the ring that progressively develops over 2 weeks until it causes death. The surgical PO mouse model offers an in vivo model of hypertrophic intestinal tissue useful for studying pathological changes of intestinal cells including smooth muscle cells (SMC), interstitial cells of Cajal (ICC), PDGFR&#945;+, and neuronal cells during the development of intestinal obstruction.

Intestinal obstructions are a partial or complete blockage of the intestine that can cause severe abdominal pain, nausea, vomiting, and preventing the passage of stool. This procedure for creating intestinal partial obsructions in mice is reliable in studying the mechanisms underlying pathological cell growth and death in the intestine.

Un modello murino di ostruzione intestinale parziale

Intestinal obstructions, that impede or block peristaltic movement, can be caused by abdominal adhesions and most gastrointestinal (GI) diseases including ...

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce musculature-driven forms of locomotion: peristalsis or scrunching. While peristalsis results from a ciliary defect, scrunching is independent of cilia function and is a specific response to certain stimuli, including amputation, noxious temperature, extreme pH, and ethanol. Thus, these two musculature-driven gaits are mechanistically distinct. However, they can be difficult to distinguish qualitatively. Here, we provide a protocol for inducing scrunching using various physical and chemical stimuli. We detail the quantitative characterization of scrunching, which can be used to distinguish it from peristalsis and gliding, using freely available software. Since scrunching is a universal planarian gait, albeit with characteristic species-specific differences, this protocol can be broadly applied to all species of planarians, when using appropriate considerations. To demonstrate this, we compare the response of the two most popular planarian species used in behavioral research, Dugesia japonica and Schmidtea mediterranea, to the same set of physical and chemical stimuli. Furthermore, the specificity of scrunching allows this protocol to be used in conjunction with RNA interference and/or pharmacological exposure to dissect the molecular targets and neuronal circuits involved, potentially providing mechanistic insight into important aspects of nociception and neuromuscular communication.

Freshwater planarians exhibit three gaits (gliding, peristalsis, and scrunching) that are distinguishable by quantitative behavioral analysis. We describe a method to induce scrunching using various noxious stimuli, quantification thereof, and distinction from peristalsis and gliding. Using gene knockdown, we demonstrate the specificity of scrunching as a quantitative phenotypic readout.

Planarian Scrunching come una lettura comportamentale quantitativa per il rilevamento di stimoli nocivi

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage (40-300 kV) X-Ray Facilities

The importance of dosimetry protocols and standards for radiobiological studies is self-evident. Several protocols have been proposed for dose determination using low energy X-ray facilities, but depending on the irradiation configurations, samples, materials or beam quality, it is sometimes difficult to know which protocol is the most appropriate to employ. We, therefore, propose a dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray facility. The aim of this method is to perform the dose estimation at the level of the cell monolayer to make it as close as possible to real cell irradiation conditions. The different steps of the protocol are as follows: determination of the irradiation parameters (high voltage, intensity, cell container etc.), determination of the beam quality index (high voltage-half value layer couple), dose rate measurement with ionization chamber calibrated in air kerma conditions, quantification of the attenuation and scattering of the cell culture medium with EBT3 radiochromic films, and determination of the dose rate at the cellular level. This methodology must be performed for each new cell irradiation configuration as the modification of only one parameter can strongly impact the real dose deposition at the level of the cell monolayer, particularly involving low energy X-rays.

Dosimetry for Cell Irradiation using Orthovoltage 40-300 kV X-Ray Facilities

This document describes a new dosimetry protocol for cell irradiations using low energy X-ray equipment. Measurements are performed in conditions simulating real cell irradiation conditions as much as possible.