Il protocollo per la generazione di umani CD40 delle cellule B attivate da PBMC è diviso in due parti: la parte A dimostra la preparazione di ligando CD40 esprimere NIH/3T3 celle, che sarà usato come piatto legato cellule nutrici. Parte B descrive l&#39;attuale B CD40-cultura. A. Preparazione di cellule di alimentazione (tCD40L NIH/3T3) Il NIH/3T3 tCD40L è un aderente murino linea cellulare di fibroblasti, che non dovrebbe mai diventare completamente confluenti. Le cellule sono quindi suddivisi due volte alla settimana. Coltura per più di 6 settimane non è raccomandato. <ol><li> Rimuovere medio vecchio dalla coltura primaria con una pipetta sterile e lavare le cellule con 10 ml di PBS 1x. Aspirare il PBS dopo il lavaggio. </li><li> Aggiungere 4 ml di tripsina / EDTA in un centimetro 75 2 fiasco per 5-10 minuti a 37 ° C. Usa picchiettando leggermente per staccare le cellule. </li><li> Aggiungere 10 ml di medium di tipo selvatico e girevole con delicatezza. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in un tubo da 50 ml con una pipetta sterile e girare le celle in basso a 225 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 10 ml di medium di tipo selvatico. Contare il numero di cellulare di una aliquota della sospensione cellulare e preparare tre da 50 mL con il numero appropriato di cellule: <ol><li> 1,5 x 10 6 cellule per subcolture </li><li> 0,2 x 10 6 cellule / pozzetto di irradiazione utilizzate nel CD40-B colture cellulari </li><li> resto di congelare (se necessario). </li></ol></li><li> Spin le cellule verso il basso a 225 xg per 5 min. </li><li> Rimuovere il surnatante. <ol><li> Per subcolture: risospendere 1,5 x 10 6 cellule in 10 ml di tipo medio selvatici in un CM 75 2 fiasco coltura cellulare (cellule densità di 1,5 x 10 5 cellule / ml), aggiungere G-418 [0,7 mg / ml] e incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2. Dividere le celle due volte alla settimana. </li><li> Per la B CD40-coltura cellulare: Avete bisogno di 1,2 x 10 6 cellule per un 6-pozzetti. Risospendere le cellule in terreno di tipo selvatico ad una densità di 0,1 x 10 6 cellule / ml e irradiare li a 78 Gy. Tavola 2 ml di sospensione cellulare in ciascun pozzetto e incubare loro a 37 ° C con 5% di CO 2. Utilizzare questa piastre preparate per la stimolazione delle cellule B quando tCD40L NIH/3T3 cellule sono aderenti (almeno 4 ore: controllare l&#39;aderenza con il microscopio, non aspettare più di 24 ore per iniziare la stimolazione delle cellule B). (Continua con B.) </li></ol></li></ol> B. CD 40-B di coltura cellulare I. Preparazione di PBMC per CD40-stimolazione (giorno 0): Attenzione: prima di continuare a constatare che le cellule feeder siano aderenti. Aggiungere sempre soluzioni fresche di interleuchina-4 e ciclosporina A per il terreno di coltura immediatamente prima dell&#39;uso. <ol><li> Prendete PBMC, fresco o opportunamente scongelati. Risospendere PBMC due volte in 50 mL di PBS 1x di lavarli e spin down prima volta a 265 xg per 7 min e una seconda volta a xg 190 per 7 minuti per eliminare altre cellule. Gettare il surnatante e risospendere le cellule in 20 ml di PBS. Determinare il numero di cellule in una parte aliquota della sospensione cellulare. </li><li> Spin down quantità necessaria di cellule a 225 xg per 5 min. Per un 6-pozzetti 4 x 10 6 cellule / pozzetto sono necessari, quindi 24 x 10 6 cellule per piastra. </li><li> Rimuovere il supernatante e risospendere il PBMC con 1 x 10 6 cellule / ml in B CD40-terreno di coltura fresco integrato con 50 U / mL di interleuchina-4 come un fattore di crescita e di 0,63 mg / ml ciclosporina A per prevenire conseguenza di cellule T (concentrazioni indicati si riferiscono a un mezzo ml di cultura!). </li><li> Rimuovere il surnatante da 6 pozzetti di pre-incubazione piatto con tCD40L NIH/3T3 cellule. </li><li> Lavare l&#39;aderente tCD40L NIH/3T3 cellule con 2 ml di PBS per primo pozzo e in una seconda fase con 2 ml di CD40-B medio di lavaggio. </li><li> Delicatamente aggiungere 4 ml di sospensione PBMC (1 x 10 6 cellule / ml) in ciascun pozzetto della piastra ben 6. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Il giorno 7, reculture le cellule (Continua al punto 3.2.). </li></ol> II. Ricoltivazione di cellule CD40-B (7 ° giorno e poi ogni 3-4 giorni): <ol><li> Cluster raccolta di cellule CD40-B da 6 pozzetti da risospendere con una pipetta da 10 mL e la piscina in un tubo da 50 ml. </li><li> Spin down a 225 xg per 7 minuti e sostituire completamente il sopranatante con CD40-B medio di lavaggio. Mentre conta la quantità delle cellule di una aliquota, girare la celle in basso a 225 xg per 5 minuti. Risospendere le cellule B CD40-CD40-B in terreno di coltura ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Aggiungi soluzioni fresche di interleuchina-4 in una concentrazione di 50 U / mL e 0,63 mcg / mL ciclosporina A per la media. </li><li> Rimuovere il surnatante da un 6-pozzetti pre-incubate con tCD40L NIH/3T3 cellule. </li><li> Lavare le cellule aderenti con 2 ml di PBS per primo pozzo e in una seconda fase con 2 ml di CD40-B medio di lavaggio. </li><li&gt; delicatamente aggiungere 4 ml (1 x 10 6 cellule / ml) di sospensione CD40-B in ciascun pozzetto della piastra ben 6. </li><li> Incubare le piastre a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Cellule sottocultura di nuovo ogni 3-4 giorni per finire con elevata purezza umano CD40 delle cellule B attivate dopo un totale di 14 giorni. </li></ol> C. Soluzione dei problemi - Che cosa succede se le cellule CD40-B non crescono? <ol><li> Hai controllato di espressione ligando CD40 delle cellule alimentatore? </li><li> La piastra-bound cellule alimentatore utilizzato per la stimolazione non deve essere più di 24 ore? </li><li> È una possibile contaminazione con micoplasma? </li><li> È stata la interleuchina-4 soluzione utilizzata per la supplementazione appena scongelato e aveva l&#39;attività biologica appropriata? </li><li> È stato aggiunto ciclosporina A nella concentrazione giusta? </li></ol><img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig1tmb.jpg" border="0" alt="Figura 1" /> Figura 1. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig1.jpg">cliccare qui</a> per una versione più grande della figura 1. <img src="/files/ftp_upload/1373/1373fig2tmb.jpg" border="0" alt="Figura 2" /> Figura 2. Si prega di <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1373/1373fig2.jpg">cliccare qui</a> per una versione più grande della figura 2.

<ol>
	<li>Schultze, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+human+B+cells:+an+alternative+source+of+highly+efficient+antigen+presenting+cells+to+generate+autologous+antigen-specific+T+cells+for+adoptive+immunotherapy.">CD40-activated human B cells: an alternative source of highly efficient antigen presenting cells to generate autologous antigen-specific T cells for adoptive immunotherapy.</a> J Clin Invest. 100, 2757-2765 (1997).</li><li>Schultze, J. L., Grabbe, S., vonBergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DCs+and+CD40-activated+B+cells:+current+and+future+avenues+to+cellular+cancer+immunotherapy.">DCs and CD40-activated B cells: current and future avenues to cellular cancer immunotherapy.</a> Trends Immunol. 25, 659-664 (2004).</li><li>Bergwelt-Baildon, M. v. o. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+express+full+lymph+node+homing+triad+and+induce+T-cell+chemotaxis:+potential+as+cellular+adjuvants.">CD40-activated B cells express full lymph node homing triad and induce T-cell chemotaxis: potential as cellular adjuvants.</a> Blood. 107, 2786-2789 (2006).</li><li>Wiesner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conditional+immortalization+of+human+B+cells+by+CD40+ligation.">Conditional immortalization of human B cells by CD40 ligation.</a> PLoS ONE. 3, 1464-14 (2008).</li><li>Urashima, M., Chauhan, D., Uchiyama, H., Freeman, G. J., Anderson, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40+ligand+triggered+interleukin-6+secretion+in+multiple+myeloma.">CD40 ligand triggered interleukin-6 secretion in multiple myeloma.</a> Blood. 85, 1903-1912 (1995).</li><li>Lapointe, R., Bellemare-Pelletier, A., Housseau, F., Thibodeau, J., Hwu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-stimulated+B+lymphocytes+pulsed+with+tumor+antigens+are+effective+antigen-presenting+cells+that+can+generate+specific+T+cells.">CD40-stimulated B lymphocytes pulsed with tumor antigens are effective antigen-presenting cells that can generate specific T cells.</a> Cancer Res. 63, 2836-2843 (2003).</li><li>von Bergwelt-Baildon, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+primary+and+memory+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+are+efficiently+induced+by+means+of+CD40-activated+B+cells+as+antigen-presenting+cells:+potential+for+clinical+application.">Human primary and memory cytotoxic T lymphocyte responses are efficiently induced by means of CD40-activated B cells as antigen-presenting cells: potential for clinical application.</a> Blood. 99, 3319-3325 (2002).</li><li>Kondo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD40-activated+B+cells+can+be+generated+in+high+number+and+purity+in+cancer+patients:+analysis+of+immunogenicity+and+homing+potential.">CD40-activated B cells can be generated in high number and purity in cancer patients: analysis of immunogenicity and homing potential.</a> Clin Exp Immunol. 155, 249-256 (2009).</li><li>Mason, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-loaded+CD40-activated+B+cells+stimulate+antigen-specific+T-cell+responses+in+dogs+with+spontaneous+lymphoma.">RNA-loaded CD40-activated B cells stimulate antigen-specific T-cell responses in dogs with spontaneous lymphoma.</a> Gene Ther. 15, 955-965 (2008).</li></ol>

A. Preparazione dei supporti: <table border="1"cellspacing="0"><tbody><tr><td colspan="2"> Alimentatore cellule wild type media </td><td colspan="2"> Alimentatore cellulare medio selezione </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Concentrazione </td><td> Reagente </td><td> Concentrazione </td></tr><tr><td> DMEM-Ham / F12 </td><td></td><td> DMEM-Ham / F12 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glutammina </td><td> 365 mg / ml </td><td> L-Glutammina </td><td> 365 mg / ml </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 10% </td><td> FBS </td><td> 10% </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 mM </td><td> HEPES </td><td> 10 mM </td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> 15 mg / ml </td><td> Gentamicina </td><td> 15 mg / ml </td></tr><tr><td></td><td></td><td> G-418 </td><td> 0,7 mg / ml </td></tr></table><table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> CD40-B lavaggio medio </td><td colspan="2"> CD40-B terreno di coltura </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Concentrazione </td><td> Reagente </td><td> Concentrazione </td></tr><tr></tr></tbody><tbody><tr><td> IMDM </td><td> </td><td> IMDM </td><td> </td></tr></tbody><tbody><tr><td> L-Glutammina </td><td> 584 mg / ml </td><td> L-Glutammina </td><td> 584 mg / ml </td></tr></tbody><tbody><tr><td> HEPES </td><td> 25 mM </td><td> HEPES </td><td> 25 mM </td></tr></tbody><tbody><tr><td> Gentamicina </td><td> 15 mg / ml </td><td> Gentamicina </td><td> 15 mg / ml </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> rh transferrina </td><td> 50 mg / mL </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> L&#39;insulina rh </td><td> 5 mcg / ml </td></tr></tbody><tbody><tr><td> </td><td> </td><td> AB-Humanserum </td><td> 10% </td></tr></tbody></table> B. Varie Reagenti: <table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Il decreto n. </td></tr><tr></tr><tr><td> DMEM / Ham F12 </td><td> PAA </td><td> Cat No: E15-813 </td></tr><tr><td> IMDM </td><td> Invitrogen Gibco ® </td><td> REF 21980-032 </td></tr><tr><td> Dulbecco PBS (10x) </td><td> PAA </td><td> Nessun gatto H15-011 </td></tr><tr><td> AB-siero umano </td><td> Invitrogen </td><td> Nessun gatto 34005100 </td></tr><tr><td> olo-transferrina umana </td><td> Sigma </td><td> Nessun gatto T0665 </td></tr><tr><td> Insulina umana </td><td> Sigma </td><td> Nessun gatto I2643 </td></tr><tr><td> Gencin ® </td><td> Delta Select </td><td> Art. n. 7395800 </td></tr><tr><td> Ricombinante umano interleuchina-4 </td><td> Immunotools </td><td> Nessun gatto 11130045 </td></tr><tr><td> Ciclosporina A </td><td> Novartis </td><td> Nessun gatto NDC 0078-0109-01 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> LONZA </td><td> Nessun gatto DE14-802C </td></tr><tr><td> HEPES Buffer </td><td> PAA </td><td> Nessun gatto S11-001 </td></tr><tr><td> G-418 Solfato </td><td> PAA </td><td> Nessun gatto P02-012 </td></tr><tr><td> Tripsina / EDTA (10x) </td><td> Invitrogen Gibco ® </td><td> REF 15400-054 </td></tr></tbody></table> C. Varie Forniture: <table cellspacing="0" border="1"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Azienda </td><td> Il decreto n. </td></tr><tr></tr><tr><td> Puntali sterili </td><td> Sarstedt </td><td></td></tr><tr><td> 6 pozzetti </td><td> NUNC </td><td> Nessun gatto 140675 </td></tr><tr><td> 50mL tubo conico </td><td> BD Falcon ™ </td><td> Nessun gatto 352070 </td></tr><tr><td> Tessuto cultura fiasco </td><td> Sarstedt </td><td> Nessun gatto 83.1813.002 </td></tr></tbody></table>

generation of human cd40-activated b cells

CD40-attivate le cellule B (linfociti B CD40-) sono stati identificati come fonte alternativa di immuno-stimolatorie cellule presentanti l&#39;antigene (APC) per l&#39;immunoterapia del cancro 1-3. Rispetto alle cellule dendritiche (DC), il miglior APC caratterizzato, le cellule CD40-B hanno diverse proprietà distinte biologici e tecnici. Simile alla DC, le cellule B mostrano un aumento dell&#39;espressione di MHC e molecole co-stimolatorie (Fig.1b), mostrano una forte capacità migratoria e presentazione dell&#39;antigene presente in modo efficiente alle cellule T, dopo stimolazione con il ligando dell&#39;interleuchina-4 e CD40 (CD40L). Tuttavia, a differenza di DC immature o mature, le cellule B CD40-esprimono la piena triade nodo homing linfa composto da CD62L, CCR7/CXCR4, e la funzione dei leucociti antigene-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessaria per homing di organi linfatici secondari (Fig.1a) 3. Cellule CD40-B può essere generato senza difficoltà da piccolissime quantità di sangue periferico che può essere ulteriormente espanse in vitro di grandi quantità di altamente puri-CD40 delle cellule B (&gt; 10 9 cellule per paziente) da donatori sani e come il cancro pazienti (Fig.1c, d) 1,4. In questo protocollo dimostriamo come ottenere pienamente attivato le cellule B CD40-da PBMC umane. Molecole chiave per la coltura cellulare sono ligando CD40, l&#39;interleuchina-4 (IL-4) e ciclosporina A (CsA), che viene rifornito in un ciclo di 3-4 cultura giorno. Per scopi di laboratorio CD40-stimolazione è fornito da NIH/3T3 cellule che esprimono CD40 ligando ricombinante umano (tCD40L NIH/3T3) 5. Per evitare la contaminazione con le cellule non transfettate, espressione del ligando CD40 umano sulla trasfettate deve essere controllata regolarmente (Fig.2). Dopo 14 giorni CD40-B colture cellulari costituiti da oltre il 95% delle cellule B puro e una espansione del CD40 delle cellule B con più di 65 giorni è spesso possibile senza alcuna perdita di funzione 1, 4. Le cellule B CD40-in modo efficiente raccogliere, trasformare e antigeni presenti alle cellule T 6. Non solo naϊve primo, ma anche di espandere le cellule T di memoria 7,8. CD40-attivate le cellule B possono essere utilizzati per studiare l&#39;attivazione delle cellule B, la differenziazione e la funzione. Inoltre, essi rappresentano uno strumento promettente per la vaccinazione terapeutica o preventiva contro i tumori 9.

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Generation of Human CD40-activated B cells

In questo video vi presentiamo il<em&gt; Ex vivo</em&gt; Generazione ed espansione dei diritti umani CD40 delle cellule B attivate (CD40-B) dalle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) attraverso la stimolazione con il ligando CD40 e l&#39;interleuchina-4.

Generazione di Human CD40 delle cellule B attivate

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

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Research

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Biology

15.1K Views.  University Hospital of Cologne, Department I of Internal Medicine. In questo video vi presentiamo il Ex vivo Generazione ed espansione dei diritti umani CD40 delle cellule B attivate (CD40-B) dalle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) attraverso la stimolazione con il ligando CD40 e l'interleuchina-4.