Questo protocollo consente ai ricercatori di chiarire il comportamento planariano e i meccanismi sec alla base di questo comportamento combinando l'analisi comportamentale quantitativa con perturbazioni molecolari e chimiche. Questa tecnica è facilmente accessibile a tutti i livelli di abilità in quanto non richiede strumenti avanzati o software specializzati per ottenere letture comportamentali quantitative dei planari in movimento libero. Lo scrunching può essere usato per studiare l'eccezione nei planari e funge da endpoint sensibile al test, interrompendo la funzione del sistema nervoso causata da xenobiotici e malattie.
Inizia posizionando un pannello LED dimmabile su una superficie piana, che fornirà uno sfondo bianco uniforme e può essere utilizzato come fonte di luce regolabile per ottenere un contrasto appropriato. Posizionare un'arena di petri da 100 millimetri sul pannello LED. Monta una telecamera su un supporto ad anello sopra l'arena e regolane la posizione, l'altezza e la messa a fuoco in base alle esigenze in modo che l'intera arena sia centrata sul campo visivo ed è a fuoco.
Riempire l'arena con circa 25 millilitri del supporto di esposizione appropriato per avere il massimo volume, accendere il pannello LED e spegnere qualsiasi altra fonte di luce che possa influire negativamente sulla qualità della registrazione. Lascia cadere un planariano al centro dell'arena usando una Pipetta di trasferimento. Quando si testa una soluzione chimica, trasferire il planariano con il meno possibile di acqua planaria, in modo che la concentrazione della sostanza chimica non sia cambiata in modo significativo.
Inizia a registrare i dati come sequenze di immagini in un formato Fiji nativo. Per gli esperimenti di planata, registrare da uno a due minuti di comportamento di planata, per esperimenti di scrunching o peristalisi, registrare abbastanza a lungo da catturare almeno tre oscillazioni consecutive che si verificano in linea retta. Una volta completato l'esperimento, terminare la registrazione.
Se il planario raggiunge il confine dell'arena senza soddisfare il criterio di terminazione, rila tubazione il planario al centro dell'arena. Aprite la sequenza di immagini non elaborati per un esperimento nelle Figi, convertitela in otto bit e usate lo strumento freccia o il dispositivo di scorrimento nella parte inferiore dello stack di immagini per scorrere la sequenza di immagini. Per estrarre un periodo di tempo e un'area di interesse, disegnare un'area di interesse che comprenda il percorso completo di un planario utilizzando lo strumento rettangolo.
Fare clic con il pulsante destro del mouse sullo stack di immagini e selezionare duplicato, selezionare la casella in cui lo stack duplicato. Immettere il primo e l'ultimo fotogramma della sequenza di interesse e fare clic su OK. Per gli esperimenti di planata, estrarre un periodo di planatale in cui il planario si muove almeno il doppio della sua lunghezza corporea per esperimenti di scrunching o peristalisi.
Estrarre un'istanza quando il planario subisce un minimo di tre oscillazioni del corpo consecutive e complete in linea retta. Applicare una soglia allo stack di immagini duplicato per binarizzare l'immagine ed estrarre il planariano dallo sfondo, regolare le barre scorrevoli in modo che l'intero planariano sia evidenziato in rosso. I valori esatti dipendono dalla qualità dell'imaging.
Lascia deselezionate le caselle per lo sfondo scuro, impila l'istogramma e non reimpostare l'intervallo. Scorrere lo stack di immagini per assicurarsi un buon intervallo di soglia e quindi fare clic su Applica. Nello stack di conversione in finestra binaria impostare il metodo su default e lo sfondo su light.
Deselezionare tutte le caselle di questa finestra e quindi fare clic su OK. Apparirà un'immagine binarizzata che mostra un planario nero su uno sfondo bianco. Assicurarsi che l'intero planariano sia visibile in tutti i fotogrammi della sequenza di immagini.
Impostare le misurazioni facendo clic su analizza e imposta misurazioni. Selezionare le caselle relative all'area, al centro della massa, alla posizione della pila e all'ellisse di adattamento, quindi fare clic su OK. Selezionate la pila di immagini aperta e selezionate analizza e analizzate le particelle.
Nella finestra analizza particelle, selezionate mostra e maschera per aprire una nuova pila che mostra tutti gli oggetti rilevati con i parametri scelti. Impostare un filtro dimensioni per rimuovere il rumore indesiderato immettendo l'area approssimativa del planariano. Quindi selezionare le caselle per visualizzare i risultati e cancellare i risultati e fare clic su OK.
Scorrere lo stack di immagini della maschera utilizzando il dispositivo di scorrimento nella parte inferiore del pannello per assicurarsi che non vi siano rumori o fotogrammi senza un planariano. Nella finestra dei risultati salvare i dati utilizzando il file e salvarli con nome, aggiungere l'estensione CSV al nome del file per salvare i dati come valori separati da virgole. Una volta salvati i dati per lo stack di immagini, chiudere i rispettivi risultati dello stack di immagini e mascherare le finestre.
Per indurre scrunching attraverso la temperatura scioxiosa, riscaldare l'acqua planaria in un bicchiere a 65 gradi Celsius su una piastra calda. Posizionare un planariano al centro dell'arena e attendere che si orienti in posizione verticale e inizi a scivolare, quindi inizia a registrare. Utilizzare una pipetta P 200 per pipettare lentamente e costantemente 100 microlitri dell'acqua planaria preriscaldata, post faringeo sull'estremità della coda del planario per indurre lo scrunching.
Interrompere la registrazione, una volta cessato lo scrunching. Posizionare il planario in un contenitore di recupero e scambiare i supporti nella piastra di Petri con acqua planaria fresca a temperatura ambiente, se si eseguono più esperimenti. Per indurre lo scricchiolio attraverso l'amputazione, trasferisci un planario al centro dell'arena e aspetta che il planariano si orienti in posizione verticale e inizi a scivolare.
Quindi inizia a registrare, amputa il planario con una lama di rasoio pulita. Assicurarsi che la posizione di taglio sia coerente tra gli esperimenti. Interrompere la registrazione una volta che il pezzo anteriore ha cessato di scrunching.
Rimuovere entrambi i pezzi, posizionarli in un contenitore separato e consentire loro di rigenerarsi per sette giorni. I planari amputati possono essere reincorporati nel contenitore di casa una volta rigenerati. Questo protocollo è stato utilizzato per verificare se vicino all'esposizione alla luce UV, induce scrunching in S.mediterranea e D.japonica planarians, mentre I planari di D.japonica scricchiolano, quando esposti a luce UV vicina, i planari di S.mediterranea mostrano un assottigliamento della coda o nessuna risposta.
Una quantificazione dei parametri di scrunching per i planari D.japonica che hanno esibito almeno tre lanci consecutivi in linea retta, rivela caratteristiche che scrunching parametri per questa specie In contrasto l'esposizione a 250 micromolare cinnamaldeide sconosciuto TRPA un agonista nei topi, provoca scrunching e S.mediterranea. Mentre i planari D.japonica mostrano una miscela di movimento simile a un serpente e oscillatorio interrotto da scivolamento o giri vigorosi della testa. Una quantificazione dei campioni con almeno tre oscillazioni consecutive, ha prodotto valori significativamente più bassi per tre parametri su quattro poi previsti per il striminzimento in D.japonica, indicando che il moto oscillatorio osservato non è screziato.
RNAi conferma la specificità dello scrunching e la risposta all'esposizione alla cinnamaldeide in S.mediterranea. Entro 180 secondi dall'esposizione in acqua planariana, tutti controllano la planaria RNAi. Rispetto a nessuno dei planari RNAi SMTRPA che dimostrino che s.mediterranea scrunching in cinnamaldeide richiede SMTRPA uno.
È essenziale essere coerenti e come gli animali vengono manipolati per ridurre il rumore e garantire la riproducibilità nelle misurazioni comportamentali. Questi progetti possono essere espansi per includere l'analisi della forma del corpo, che consentirebbe l'identificazione e la quantificazione di altri comportamenti planariani che non vengono catturati qui.
